PMC
DISCUSSION
System modelowy syntezatora DNA zawiera wszystkie białka potrzebne do wsparcia każdej fazy procesu replikacji DNA, a białka te mają rozmiar od 20 do 240 kDa w obecnych warunkach testowych i mogą przeprowadzać wszystkie fazy procesu replikacji DNA in vitro. W niniejszej pracy scharakteryzowano aktywność primaz DNA związanych z syntezami, badając syntezę i wydłużanie primerów RNA katalizowane in vitro przez syntezę DNA. Wyniki naszych analiz funkcjonalnych wskazują, że aktywność primazy DNA związanej z syntezomem we frakcji P4 uzyskanej z komórek raka piersi jest 30-krotnie wyższa niż w surowych ekstraktach komórek raka piersi. Frakcja P4, zawierająca syntezom DNA, została uzyskana z połączonych jądrowych i cytoplazmatycznych rozpuszczalnych frakcji białkowych przygotowanych z komórek MCF7 i została użyta do przeprowadzenia testu replikacji DNA SV40 in vitro. Aktywność polimerazy DNA α i δ oraz primazy DNA we frakcji P4 jest 20-40 razy wyższa niż w surowych ekstraktach komórkowych; co czyni ją użytecznym narzędziem w tych badaniach, ponieważ jest w pełni kompetentna do wspierania syntezy i przedłużania starterów RNA w modelowym systemie in vitro, który, jak wykazano, wspiera wszystkie fazy procesu replikacji DNA .
Prymaza DNA wykazuje unikalną procesywność w syntezie i przedłużaniu starterów RNA. Procesywność ta jest określona przez konkurencję pomiędzy dodaniem kolejnego prawidłowego nukleotydu a dysocjacją kompleksu primer-templat . Primaza DNA jest jedynym enzymem zdolnym do syntezy primerów RNA podczas inicjacji syntezy DNA. Żadna z pojedynczych podjednostek primazy nie jest zdolna do samodzielnej syntezy lub przedłużania primera RNA . Syntezom zawiera obie podjednostki primazy, (tj. p49 i p58) i może katalizować syntezę primerów RNA in vitro przy użyciu egzogennego szablonu poli(dT). Syntezator syntetyzuje funkcjonalny primer RNA o długości jednostkowej (7-10 nt). Takie primery RNA są całkowicie hydrolizowane przez RNazę na krótkie fragmenty o długości 1-4 bp, natomiast nie są hydrolizowane przez DNazę. Cech± charakterystyczn± primazy zwi±zanej z syntezomem, odróżniaj±c± j± od izolowanej primazy DNA, jest jej specyficzna zdolno¶ć do wydłużania primera RNA w celu utworzenia nici DNA-primer. Do syntezy nici DNA-primer oprócz aktywności primazy DNA potrzebna jest również aktywność polimerazy DNA. Aktywność polimerazy DNA jest zwykle włączana w celu rozpoczęcia wydłużania primera RNA po syntezie primera. Tylko startery RNA o długości ≥7 nukleotydów są wykorzystywane przez polimerazę; niezależnie od stężenia dNTP . Tak więc synteza i wydłużenie jednostkowej długości primera RNA wymaga nie tylko primazy, ale również angażuje podjednostkę p180 polimerazy DNA α, a syntezom zawiera wysoce aktywne polimerazy DNA, które katalizują przyłączanie deoksyrybonukleotydów w celu wydłużenia primera RNA. Prymery RNA są przedłużane przez polimerazy związane z syntezomem z oligoprimeru DNA-RNA o długości 20-40 nt (primer DNA). Nici DNA-primeru zawierają dwa składniki: (1) rybonukleotyd o długości 10 nt oraz, (2) deoksyrybonukleotyd o długości 20-40 nt. RNaza i DNaza oddzielnie hydrolizują odpowiednie składniki nici DNA-primer, co prowadzi do skrócenia, ale niepełnej hydrolizy nici DNA-primer.
Inną cechą syntezomu jest szybka synteza i odrębne rozmiary primera RNA i nici DNA-primer. Syntezator katalizuje syntezę zarówno primera RNA, jak i nici DNA-primeru szybko, a poziomy stanu ustalonego wydają się gromadzić w ciągu (5-15 min). Rozmiary jednostkowej długości primera RNA (7-10 nt) i primeru DNA (20-40 nt) katalizowanych przez syntezator DNA zawsze pozostają stałe, niezależnie od stężenia syntezatora i czasu reakcji. Badania nad mechanizmem działania primazy DNA sugeruj±, że synteza primerów RNA, katalizowana przez primazę zwi±zan± z syntezomem, zachodzi na drodze powolnej inicjacji, szybkiej polimeryzacji i „inteligentnego” zakończenia primera. Primaza DNA wi±że się z szablonem DNA i powoli inicjuje syntezę dinukleotydu. Po syntezie dinukleotydu, do dinukleotydu spolimeryzowanego przez primazę DNA szybko dodawane są dodatkowe NTP. Aktywność primazy DNA charakteryzuje się syntezą każdego primera RNA w pojedynczym „wybuchu” aktywności, a nie poprzez syntezę rozdzielczą. Po wytworzeniu primerów o długości jednostkowej 7-10 nt, primaza-templat działa jak sygnał zakończenia i hamuje dalszą syntezę RNA. Zahamowanie to wynika z wytworzenia stabilnego primera-templatu, który prawdopodobnie pozostaje związany z kompleksem pol α-primaza. Interesuj±ce jest, że nici DNA-primer syntetyzowane przez syntezom DNA in vitro s± podobne do syntetyzowanych in vitro przez katalizowany syntezom primerów RNA. Synteza nici DNA-primer szybko osiąga stan ustalony, a rozmiar nici DNA-primer pozostaje względnie stały (pomiędzy 20 a 40 nt), niezależnie od czasu reakcji i stężenia syntezatora użytego podczas reakcji syntezy. Synteza nici DNA-primer wymaga oprócz primazy DNA także aktywności polimerazy DNA α. Uzyskane przez nas wyniki sugerują, że aktywność polimerazy α związanej z syntezomem charakteryzuje się również szybką polimeryzacją i „inteligentną” terminacją w syntezie nici DNA-primer. Synthesom, charakteryzuj±cy się szybk± polimeryzacj± i inteligentnym zakończeniem nici DNA-primer, różni się od syntezy mediowanej przez fragment Klenowa polimerazy DNA E. coli I podczas przedłużania primera RNA. W przeciwieństwie do synthesomu, przedłużanie primera RNA katalizowane przez polimerazę I silnie zależy od długości czasu reakcji. Zwiększenie czasu reakcji znacząco zwiększa ilość i rozmiar wydłużanych primerów RNA.
Zaproponowano dwa potencjalne mechanizmy odpowiadające za przejście z syntezy primerazy do wydłużania primera podczas procesu replikacji DNA. Pierwszy proponuje, że kompleks primaza-polimeraza dysocjuje od primera-templatu i ponownie asocjuje się z miejscem aktywnym polimerazy. Druga proponuje, że zmiana następuje w wyniku wewnątrzstrandowej translokacji kompleksu pol α-primaza z miejsca aktywnego primazy do miejsca aktywnego polimerazy α. Zmiana ta nie wiąże się z dysocjacją kompleksu pol α-primaza od szablonu DNA. Nasze eksperymenty pokazują, że katalizowane przez polimerazę I przedłużanie primera RNA jest hamowane przez wysokie stężenia syntezatora DNA. Zdolno¶ć fragmentu Klenowa do przedłużania primera RNA zależy od syntezy primerów RNA katalizowanej przez syntezom, który również potrzebuje dostępnego miejsca wi±ż±cego na końcu primera RNA. Dlatego też fragment Klenowa polimerazy I E. coli wymaga dysocjacji kompleksu primaza-polimeraza od primera-templatu. Jednak wysokie stężenia syntezomu konkurują z polimerazą I o miejsce wiążące na matrycy primera, tak że przedłużanie primera RNA jest zahamowane. Synthesom tworzy martwy kompleks na końcu primera RNA, co powoduje, że fragment Klenowa nie może uczestniczyć w procesie przedłużania primera RNA. Wynik ten sugeruje, że kompleks polimeraza-primaza syntezomu DNA musi zdysocjować od primera po syntezie primera RNA. Nasz wynik wskazuje, że syntezom zwiększa rozmiar jednostkowej długości primera RNA, gdy temperatura reakcji jest obniżana. Obniżenie temperatury reakcji zwiększa wydajność przełączania kompleksu polimeraza-prymaza i zmniejsza denaturację primera-templatu. Ponadto, podjednostka primazy DNA p49 zawiera aktywność katalityczną polimerazy RNA, potrzebną do zwiększenia rozmiaru primera RNA o długości jednostki. Dlatego nasze wyniki sugerują, że syntezom DNA ma odpowiednią aktywność polimerazy RNA potrzebną do tworzenia fragmentów DNA primowanych RNA.
Analiza kinetyczna inicjacji i wydłużania primerazy RNA wykazuje, że primaza DNA związana z syntezomem jest powolnym i stosunkowo słabym enzymem w odniesieniu do wiązania szablonu . Primaza DNA jest również polimerazą kwasów nukleinowych podatną na błędy, ponieważ enzym ten ma bardzo słabą zdolność dyskryminacji nukleotydów, co skutkuje błędną inkorporacją nukleotydów. Dlatego też, nasza analiza kinetyki enzymatycznej aktywności primazy DNA związanej z syntezą może być wykorzystana do określenia relacji szybkości syntezy i częstości błędów podczas syntezy primerów RNA. Nieciągła synteza fragmentów DNA (Okazaki) na nici opóźniającej widełki replikacyjne jest ważnym procesem biochemicznym podczas replikacji DNA. W celu zapewnienia efektywnej koordynacji pomiędzy ciągłą syntezą DNA na nici wiodącej i nieciągłą syntezą DNA na nici opóźniającej, primaza DNA wymaga precyzyjnie zaplanowanej w czasie serii kroków enzymatycznych, które kontrolują syntezę primera RNA. Badanie kinetyczne wielobiałkowego kompleksu replikacyjnego z bakteriofaga T7 pokazuje, że primaza działa jak molekularny hamulec i przejściowo zatrzymuje postęp widełek replikacyjnych. Ze względu na fizyczną interakcję polimerazy DNA δ z pol α wynik przedstawiony przez Lee i wsp. sugeruje, że primaza DNA może być w stanie zapobiec wyprzedzeniu syntezy nici wiodącej przez syntezę nici opóźniającej podczas powolnych etapów enzymatycznych na nici opóźniającej.
Różne modele replikacji eukariotycznego DNA zostały wykorzystane w badaniach funkcji primazy DNA. System replikacji macierzy jądrowej z lizatu całych komórek został wykorzystany do zbadania syntezy i dystrybucji natywnego primera RNA i RNA-primed nascent DNA w jądrach komórek eukariotycznych przy użyciu endogennego szablonu dwuniciowego DNA związanego z macierzą jądrową. Startery RNA są ściśle związane z macierzą jądrową szybko proliferujących komórek ssaków. Prymery RNA są kowalencyjnie przyłączane do nowo replikowanego DNA, tworząc RNA-primed nascent DNA. RNA-primed DNA jest degradowany do niektórych oligoribonukleotydów o długości ~10 nt po strawieniu DNazą , a co najmniej 94% natywnych primerów RNA i RNA-primed nascent DNA znajduje się w nierozpuszczalnej frakcji macierzy jądra. Startery RNA o długości 8-10 nt, które znajdują się związane z macierzą jądrową, stanowią <1% całkowitego RNA w komórce; co sprawia, że bardzo trudno jest badać startery RNA i powstające DNA pobudzone RNA we frakcji macierzy jądrowej komórki ze względu na bardzo niskie stężenie starterów RNA i stosunkowo dużą ilość innych RNA. Co więcej, izolacja primerów RNA i RNA-primed nascent DNA z lizatów całych komórek znakowanych radio-nukleotydami jest skomplikowaną i nietrywialną procedurą oczyszczania, gdy stosuje się ją do analizy syntezy primerów RNA wspomaganej modelem replikacji macierzy jądrowej. W przeciwieństwie do tego, syntezom DNA oczyszczony z połączonych frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych zawiera wysoce aktywną primazę DNA i polimerazy DNA, i w pełni wspiera syntezę natywnych primerów RNA in vitro przy użyciu dwuniciowego szablonu DNA zawierającego pochodzenie SV40. Syntetyzowane przez syntezę DNA startery RNA są normalnej długości (10-20 nukleotydów) i wydają się funkcjonować prawidłowo, aby wspierać przedłużanie startera przez polimerazę DNA. Te startery RNA mogą być łatwo przedłużane, aby utworzyć RNA-primed nascent DNA o długości 100-200 nt. Nieciągła synteza fragmentów DNA (Okazaki) na nici opóźniającej widełek replikacyjnych jest ważnym procesem biochemicznym biorącym udział w replikacji DNA, a pełnowartościowe fragmenty DNA (Okazaki) stymulowane przez RNA syntetyzowane przez syntezom DNA mają również długość około 100-200 nukleotydów. Zaobserwowali¶my, że syntezom DNA może syntetyzować różne produkty primingu RNA o długo¶ci od 10 do 200 nt. Można to uznać za uzasadnione, gdyż natywne primery RNA i nasycone RNA DNA również mają taką przybliżoną długość. Powyższe spostrzeżenie, że synteza primera RNA i powstającego DNA, katalizowana przez syntezę DNA, jest zasadniczo równoważna tej z badań opublikowanych przy użyciu modelu replikacji macierzy jądrowej w lizacie całej komórki, sugeruje, że syntezom DNA jest doskonałym systemem modelowym zdolnym do przeprowadzenia fizjologicznie znaczącego procesu replikacji DNA in vitro.
Model syntezomu DNA jest zatem unikalnym i cennym narzędziem w badaniu funkcji primazy DNA. Pośredniczona przez primazę synteza i elongacja primerów RNA przeprowadzana przez syntezom DNA ściśle przypomina tę przeprowadzaną przez inne bezkomórkowe modele replikacji. Model syntezomu wspiera syntezę i wydłużanie primerów RNA in vitro przy użyciu egzogennych jednoniciowych szablonów DNA, jak również superskręconego dwuniciowego DNA zawierającego nienaruszone miejsce replikacji SV40. Syntezom DNA jest zatem w pełni zdolny do pośredniczenia w syntezie i przedłużaniu starterów RNA in vitro i może ułatwić dalsze badania mechanizmów inicjujących syntezę DNA w komórkach eukariotycznych. Łącznie nasze wyniki sugerują, że model syntezomu stanowi unikalne narzędzie do badania interakcji primazy DNA i innych białek replikacyjnych podczas procesu replikacji DNA.