Zmienność genetyczna różnych stadiów rozwojowych Schistosoma japonicum: czy rozmieszczenie w ślimakach i preferencja łączenia się w pary korzystnie wpływają na transmisję?
Zbieranie próbek
Zbieranie próbek i projekt eksperymentalny są podsumowane na Rys. 1. Poniżej opisano etapy zbierania próbek, w tym zbieranie ślimaków, zbieranie cerkarii, infekcję myszy i zbieranie dorosłych robaków oraz zbieranie miracidiów.
Flowchart of sample collection and experimental design
Zbieranie ślimaków
ŚlimakiOncomelania hupensis zostały zebrane w marcu i wrześniu 2016 roku ze wschodniego obszaru jeziora Dongting (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), prowincja Hunan, Chiny. Ślimaki znajdowały się w rowach w 3 wioskach w odległości 10 km. Miejsce zbioru jest bagnem, a nie parkiem narodowym, innym obszarem chronionym lub terenem prywatnym. Zbiory przeprowadzono za zgodą i z pomocą Instytutu Kontroli Schistosomatozy Prowincji Hunan w Chinach, który nadzoruje zwalczanie ślimaków na tym obszarze. Oncomelania hupensis nie jest gatunkiem zagrożonym ani chronionym. Ślimaki przywieziono z powrotem do laboratorium i zaklasyfikowano do grupy A dla tych zebranych w marcu i do grupy B dla tych zebranych we wrześniu. Po miesiącu przetrzymywania ślimaków w niewoli, przemyto je i przeniesiono do pojedynczych fiolek wypełnionych wodą na 3 h pod światło w temperaturze 25 °C, w celu stymulacji pojawienia się cerkarii do identyfikacji infekcji S. japonicum. Ostatecznie, 20 ślimaków z grupy A i 25 ślimaków z grupy B zidentyfikowano jako zakażone S. japonicum.
Zbieranie cerkarii
Po uwolnieniu cerkarii z poszczególnych ślimaków, niektóre z nich przenoszono do naczynia za pomocą pętli i płukano w roztworze do płukania cerkarii (5 g/l hydrolizatu laktoalbuminy, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O i 1 g/l glukozy) pod mikroskopem. Po 3 płukaniach cerkarie były pojedynczo pipetowane z 2 μl wysterylizowanego roztworu do płukania na kartę Whatman™ FTA (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Po wysuszeniu karty przechowywano w szczelnie zamkniętej plastikowej torebce w eksykatorze w temperaturze pokojowej. Przynajmniej 50 cerkarii na ślimaka zebrano indywidualnie i przechowywano na kartach Whatman™ FTA.
Zakażenie myszy cerkariami z pojedynczego ślimaka
Aby odróżnić jednopłciowe ślimaki zakażone S. japonicum, 2 laboratoryjne myszy Kunming zakażono przezskórnie 30 cerkariami z każdego ślimaka na mysz. W sumie 40 myszy zostało zakażonych na 20 ślimaków w grupie A, a 50 myszy zostało zakażonych na 25 ślimaków w grupie B. Robaki zostały pobrane z żył krezkowych każdej myszy przez perfuzję z użyciem 0,9% NaCl i dysekcję 7 tygodni później po zakażeniu. Zadbano o zminimalizowanie możliwości rozszczepienia sparowanych dorosłych robaków spowodowanego siłą mechaniczną podczas perfuzji i dysekcji, wykorzystując 3 doświadczonych techników do jak najszybszej obróbki robaków. Każda para robaków była przenoszona do osobnych probówek w celu natychmiastowego umycia i oznaczenia, a po samoistnym rozdzieleniu przechowywana w absolutnym etanolu w parach. Nieparowane robaki od każdej myszy sprawdzano pod mikroskopem w celu potwierdzenia płci, a następnie przechowywano w etanolu.
Zakażenie myszy cerkariami zebranymi od wszystkich ślimaków (Metoda I i II) i zbieranie dorosłych robaków
Do kolejnych zakażeń 17 z 20 ślimaków z Grupy A i 16 z 25 z Grupy B pozostało żywych i zdolnych do wytworzenia wystarczającej liczby cerkarii. Zastosowano dwie różne metody łączenia cerkarii dla dwóch grup ślimaków. Dla 17 pozostałych ślimaków z Grupy A, wszystkie ślimaki zostały zebrane razem w kolbie z wodą w celu stymulacji pojawienia się cerkarii (Metoda I). Następnie trzydzieści jeden myszy zostało zakażonych przezskórnie, przy czym na każdą mysz przypadały 34 cerkarie. W przypadku zakażenia z wykorzystaniem 16 ślimaków z grupy B, łączono po 2 cerkarie z każdego ślimaka wydalające się pojedynczo, a zmieszane 32 cerkarie wykorzystywano do zakażenia myszy (metoda II), powtarzając zakażenie w sumie u 22 myszy. Wszystkie myszy uśmiercono, aby zebrać robaki S. japonicum 7 tygodni po zakażeniu, jak opisano powyżej. Ostatecznie zebrano 530 robaków od myszy metodą I (Grupa A), 484 robaki od myszy metodą II (Grupa B).
Zbieranie miracydiów
Przed uśmierceniem wszystkich zakażonych myszy w celu zebrania dorosłych robaków, stolce od każdej myszy zbierano przez 7 dni, aby skoncentrować jaja wydalane przez jelito w celu wyklucia miracydiów. Osad z jaj każdej myszy poddawano działaniu odchlorowanej wody w kolbie pod lampą w temperaturze 25 °C w celu wyklucia się miracidiów. Miracidia były zbierane z górnej wody każdej kolby za pomocą pipety i przenoszone do naczynia z roztworem przemywającym miracidia (5 g/l hydrolizatu laktoalbuminy, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 i 0,20 g/l NaHCO3). Po 3 przemyciach miracidia były pojedynczo pipetowane z 2 μl wysterylizowanego roztworu myjącego na kartę Whatman™ FTA. Po wysuszeniu karty przechowywano w szczelnie zamkniętej plastikowej torebce w eksykatorze w temperaturze pokojowej. Zbierano co najmniej 50 miracydiów na stolec myszy.
Miracydia wylęgające się z jaj uwięzionych w wątrobach zakażonych myszy również zbierano w następujący sposób. Wątroba każdej zarażonej myszy była pobierana po zebraniu dorosłych robaków, homogenizowana w zimnym 1,2% NaCl i filtrowana w celu uzyskania osadu jaj. Miracidia wylęgały się przy użyciu tej samej metody, którą zastosowano w przypadku próbki kału. Wreszcie, co najmniej 50 miracidiów na wątrobę myszy pipetowano pojedynczo i przechowywano na kartach Whatman™ FTA.
Ekstrakcja genomowego DNA
Dla DNA pojedynczej próbki cerkarii lub miracidium, usuwano krążek o średnicy 2 mm ze środka każdego obszaru pipetowania próbki na karcie Whatman™ FTA przy użyciu 2 mm mikronakłuwacza Harrisa (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Krążek umieszczano w podstawie 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U o pojemności 1,2 ml. Po jednokrotnym płukaniu 100 μl odczynnika oczyszczającego FTA (GE Healthcare Life Sciences) przez 5 min, a następnie 100 μl buforu TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), do każdej studzienki dodawano 14 µl 0,1 M NaOH z 0,3 mM EDTA, pH 13,0 i pozostawiano roztwór do inkubacji przez 5 min, po czym dodawano 26 µl 0,1 M buforu Tris-HCl, pH 7,0. Następnie płytkę wymieszano pulsacyjnie za pomocą mieszadła vortex 3 razy przez około 10 s każde. Następnie roztwór pozostawiono w temperaturze pokojowej na 10 min, pulsacyjnie worteksowano 10 razy, a eluat przeniesiono na czystą płytkę 96-dołkową i przechowywano w temperaturze – 20 °C do dalszego wykorzystania.
Jak w przypadku pojedynczych dorosłych robaków, przednia część, w tym macica, została odcięta pod mikroskopem od każdej dorosłej samicy robaka, aby uniknąć wpływu jaj w macicy na genotyp samicy robaka. Do ekstrakcji DNA wykorzystywano całe samce lub niedojrzałe samice. Całkowity genomowy DNA był ekstrahowany indywidualnie z każdego robaka przy użyciu standardowej procedury dodecylosiarczan sodu-proteinaza K w następujący sposób. Każdy robak był inkubowany i rozmrażany w 400 μl buforu ekstrakcyjnego zawierającego 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS i 100 mg/ml proteinazy K, w temperaturze 56 °C przez 1 h, przy delikatnym mieszaniu. DNA w roztworze ekstrahowano stosując standardowe oczyszczanie fenol/chloroform, a następnie 3 M octan sodu (pH 5,2) i wytrącanie etanolu. Granulki DNA przemywano w 70% etanolu, suszono na powietrzu i ponownie zawieszano w 20 μl TE (pH 8,0), przechowywano w temperaturze – 20 °C jako surowy ekstrakt DNA dorosłego robaka do dalszego wykorzystania.
PCR amplifikacja i genotypowanie mikrosatelitarne
Aby potwierdzić istnienie genomowego DNA w eluencie z karty FTA lub surowym ekstrakcie z próbki przechowywanej w etanolu, fragment genu 28S rybosomalnego DNA amplifikowano z roztworu DNA pojedynczej cerkarii, miracidium lub dorosłego robaka, stosując następujące startery: forward (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) i reverse (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR przeprowadzono przy użyciu Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads w 96-dołkowej płytce (GE Healthcare Life Sciences, USA). Do każdej kulki dodawano 2 µl eluentu FTA z pojedynczej larwy lub 0,5 µl surowego ekstraktu z pojedynczego robaka, po 1 µl każdego primera oraz wodę do końcowej objętości 25 µl. Amplifikację prowadzono według następującego programu: 95 °C przez 5 min; następnie 40 cykli po 30 s w 95 °C, 30 s w 60 °C i 40 s w 72 °C; oraz końcowy etap przedłużania w 72 °C przez 7 min. Reakcje sprawdzano następnie przez naniesienie 5 µl na 2% żel agarozowy TAE.
Genotypowanie na małą skalę przeprowadzono dla 30 cerkarii, 30 miracidiów i 30 robaków, które wybrano losowo, w celu skonstruowania optymalnego panelu multiplex mikrosatelitarnych loci do amplifikacji PCR. Sprawdzono 20 loci opracowanych i zwalidowanych w poprzednich badaniach oraz pochodzących z naszego laboratorium. Ostatecznie wybrano 9 loci mikrosatelitarnych (Dodatkowy plik 1: Tabela S1), z których utworzono panel. Lokalizacje mikrosatelitarne dla każdej próbki DNA były genotypowane przy użyciu zestawu Type-it Microsatellite PCR kit (Qiagen, Manchester, UK) z multipleksem 9 loci. Starter forward każdej pary znakowany był odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym, w tym 6-FAM, HEX, TAMRA i ROX (plik dodatkowy 1: Tabela S1). Reakcje PCR przygotowywano w 96-dołkowej płytce PCR z użyciem 6,25 µl 2× master mix, 1,25 μl roztworu Q, 0,5 μl primerów (10 μM), 2 μl szablonu DNA i 2,5 μl ddH2O, a następnie przeprowadzano w termocyklerze Bio-Rad z następującym programem: 95 °C przez 5 min; następnie 35 cykli po 30 s w 95 °C, 90 s w 60 °C i 3 min w 72 °C; po czym końcowy etap przedłużania w 60 °C przez 45 min. Reakcje PCR sprawdzano, nakładając 5 µl na 2% żel agarozowy TAE, a udane amplifikacje wysyłano do Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny) do analizy fragmentów na analizatorze genetycznym ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genotypy były oceniane przy użyciu wtyczki mikrosatelitarnej Geneious 11.0 . Wszystkie próbki były amplifikowane i genotypowane dwukrotnie w celu zmniejszenia odchylenia. W sumie wygenerowano genotypy 346 cerkarii, 701 dorosłych robaków i 393 miracidiów do następujących analiz.
Analizy różnorodności genetycznej
Różnorodność genetyczną każdego locus oszacowano we wszystkich genotypowanych cerkariach poprzez obliczenie obserwowanej liczby alleli (Na), efektywnej liczby alleli (Ae) w GenAlEx 6.5 oraz bogactwa allelicznego (Ar) i różnorodności genów (Hs) w hierfstat ver. 0.04-22 , w tym 156 cerkarii z 20 ślimaków grupy A i 190 cerkarii z 25 ślimaków grupy B. Odchylenie od równowagi Hardy’ego-Weinberga (HWE) dla każdego locus testowano testem Chi-kwadrat w GenAlEx, a test nierównowagi powiązań między loci obliczano w SHEsis .
Na, Ae, Ar i Hs obliczano dla różnych populacji w procesie zakażania myszy w następujący sposób. Dla populacji cerkarii użytych w zakażeniu oceniono 132 cerkarie z 17 ślimaków z grupy A (użytych w metodzie I) i 122 cerkarie z 16 ślimaków z grupy B (użytych w metodzie II). Po genotypowaniu i odfiltrowaniu danych o niskiej jakości, co najmniej 5 par dorosłych robaków (jeśli były obecne) i wszystkie niesparowane robaki z każdej myszy zostały z powodzeniem poddane genotypowaniu. W sumie, 357 robaków od myszy w metodzie I (przy użyciu cerkarii z 17 połączonych ślimaków z grupy A), 344 robaki od myszy w metodzie II (przy użyciu równomiernie wymieszanych cerkarii z 16 pojedynczych ślimaków z grupy B) było zaangażowanych. Dodatkowo oceniano zróżnicowanie genetyczne dorosłych robaków u każdej myszy w celu sprawdzenia zgodności allelicznej dorosłych robaków wśród myszy w metodzie I i II oddzielnie. Dla populacji miracidium różnorodność genetyczną miracidiów z wątroby i kału obliczono na poziomie ponadpopulacyjnym (miracidia z wątroby lub kału wszystkich myszy), ponieważ genotypowano tylko 3-4 miracidia z wątroby lub kału u każdej myszy, w tym 93 miracidia z wątroby (3 na mysz) i 124 miracidia z kału (4 na mysz) w metodzie I oraz 88 miracidiów zarówno z wątroby, jak i z kału (po 4 na mysz) w metodzie II.
Analiza wariancji molekularnej (AMOVA)
Zróżnicowanie genetyczne wszystkich genotypowanych cerkarii z Grupy A i Grupy B oszacowano przy użyciu AMOVA w Arlequin ver. 3.5.2.2 . Po wykluczeniu ślimaków niewykorzystanych do infekcji myszy, testowano zróżnicowanie pomiędzy 132 cerkariami z 17 ślimaków z Grupy A (dla Metody I) i 122 cerkariami z 16 ślimaków z Grupy B (dla Metody II). Po zakażeniu badano zróżnicowanie między 357 dorosłymi robakami w metodzie I a pierwotną populacją cerkarii (132 cerkarie z grupy A). Ponadto, 344 robaki w metodzie II testowano w stosunku do 122 cerkarii z grupy B. Dodatkowo, oddzielnie oceniano zróżnicowanie dorosłych robaków wśród 31 myszy w metodzie I i dorosłych robaków wśród 22 myszy w metodzie II. W przypadku miracidiów, genetyczne zróżnicowanie testowano pomiędzy 93 miracidiami z wątroby i 124 miracidiami z kału w Metodzie I, i to samo dla 88 miracidiów zarówno z wątroby jak i z kału w Metodzie II.
Analiza pokrewieństwa dla pojedynczych cerkarii z niMLGs
Liczono liczbę genotypów cerkarii z każdego ślimaka. Ponieważ trudno jest odróżnić błędy w typowaniu lub mutacje somatyczne podczas namnażania sporocyst od oryginalnego genotypu miracidium, grupa genotypów cerkarii z mniej niż 2 niedopasowanymi allelami została zidentyfikowana jako niMLGs i przypisana do linii pochodzącej od tego samego miracidium w każdym ślimaku. Ostatecznie, liczba miracidiów, które utworzyły klony genetyczne u każdego ślimaka, została oceniona na podstawie numeru linii przy użyciu pakietu R allelematch ver. 2.5 .
Ponieważ cerkarie z niMLGs w jednym ślimaku zostały uznane za pochodzące z jednego miracidium, jeden z genotypów (singleton) dla niMLGs został przypisany do reprezentowania grupy cerkarii, które pochodziły z miracidium za pomocą funkcji amCluster w allelematch, w celu uzyskania przefiltrowanego zestawu danych do analizy pokrewieństwa między miracidiami. Następnie oszacowano pokrewieństwo pomiędzy pojedynczymi osobnikami (miracidiami) przy użyciu współczynnika korelacji wielkości alleli (I′) wg Streiffa w SPAGeDi ver. 1.5a na poziomie wewnątrz- i międzyślimakowym dla 20 ślimaków z grupy A i 25 ślimaków z grupy B, aby sprawdzić, czy agregacja miracidiów w jednym ślimaku korelowała z podobieństwem genetycznym miracidiów.
Rozkład alleli dla podzbiorów cerkarii pochodzących z różnej liczby ślimaków
Niejednolity rozkład genetyczny cerkarii wśród ślimaków sugeruje, że wielkość próby ślimaków-żywicieli wpłynie na rozkład alleli w suprapopulacji cerkarii (cerkarie ze wszystkich ślimaków). Na, podstawowy wskaźnik wskazujący na obfitość genów w populacji, był dalej oceniany dla każdego locus w różnych podgrupach cerkarii poprzez losowy dobór różnej liczby ślimaków. Ślimaki wybierano losowo przy każdej podanej liczbie ślimaków, która była ustawiona od 1 do maksimum w każdej grupie przy użyciu funkcji bazowej sample w R, ze 100 replikami. W każdym powtórzeniu, liczba cerkarii w każdym ślimaku została ustalona na 5, co zostało określone zgodnie z praktyczną wykonalnością i średnią liczbą cerkarii genotypowanych w każdym ślimaku w tym badaniu. Genotypy cerkarii dla tej samej liczby ślimaków połączono, a następnie oszacowano Na dla każdego locus za pomocą funkcji nb.alleles w pakiecie R hierfstat. Względność między różnorodnością genetyczną a liczbą ślimaków oceniono, obliczając najmniejszy rozmiar próbki ślimaków, gdy ustalono 50% i 95% całkowitej Na.
Dystans genetyczny między samicami i samcami dorosłych robaków
Aby wykryć potencjalną preferencję genetyczną dla S. japonicum podczas kojarzenia, międzyosobniczy dystans genetyczny Dsw między samcem i samicą każdej pary u poszczególnych myszy zmierzono za pomocą Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), i porównano z dystansem między sparowaną samicą a niesparowanymi robakami (jeśli są dostępne, niesparowane to głównie samce) u tego samego gospodarza.
Identyfikacja ojcostwa dla miracidiów
Częstotliwości alleli wszystkich dorosłych robaków i miracidiów u każdej myszy zostały przeanalizowane i obliczone przy użyciu funkcji Allele Frequency Analysis w programie Cervus 3.0 . Wszystkie 9 loci zostało ostatecznie ocenionych jako odpowiednie markery do dalszej analizy rodzicielstwa z łącznym prawdopodobieństwem niewykluczenia mniejszym niż 0,01%. Zastosowano funkcję Simulation of Parentage Analysis na podstawie częstotliwości alleli, w celu oszacowania zdolności rozdzielczej loci kodominantowych oraz wartości krytycznych log-likelihood (LOD) przy następujących założeniach: 10 000 potomstwa (miracidia) dla każdej indywidualnej myszy; 10 kandydujących matek i ojców u każdej myszy (szacowana wielkość próby zgodnie z liczbą dorosłych robaków zebranych u gospodarza); proporcja kandydatów została ustawiona na 100% genotypowanych dorosłych robaków; inne opcje były ustawione domyślnie. W końcu, oba wyjścia z Analizy Częstości Alleli i Symulacji Analizy Rodzicielstwa zostały odniesione do modułu Analizy Rodzicielstwa, aby przypisać każde potomstwo do jego najbardziej prawdopodobnych rodziców. Rodzice, którzy mają więcej niż 2 niedopasowane allele z potomstwem zostali wykluczeni, a ci, którzy mieli największe LOD zostali uznani za najbardziej prawdopodobnych rodziców.
Analiza statystyczna
Wszystkie dane użyte w analizie statystycznej w tym badaniu są danymi ciągłymi. Istotność różnic we wskaźnikach różnorodności genetycznej (Na, Ae, Ar i Hs) loci, współczynniku pokrewieństwa (I′) i międzyosobniczej odległości genetycznej (Dsw) między dwiema grupami oceniano przy poziomie istotności 0,05. W pierwszej kolejności sprawdzono normalność rozkładu zbiorów danych testem Sharpiro-Wilka. Test t dla prób sparowanych/niezależnych stosowano wówczas, gdy zestawy danych spełniały warunki rozkładu normalnego. W przeciwnym razie zastosowano test Wilcoxona i test U Manna-Whitneya dla prób powiązanych/niezależnych. Korekta Bonferroniego została użyta do skorygowania wartości P przy wielokrotnych porównaniach.