PMC
DISCUSSION
Het DNA synthesoom modelsysteem bevat alle proteïnen die nodig zijn om elke fase van het DNA replicatieproces te ondersteunen, en deze proteïnen variëren in grootte van 20 tot 240 kDa onder de huidige testomstandigheden, en kunnen alle fasen van het DNA replicatieproces in vitro uitvoeren. In deze studie werd de synthesoom-geassocieerde DNA primase activiteit gekarakteriseerd door de synthese en extensie van RNA primers te onderzoeken die in vitro gekatalyseerd werden door het DNA synthesoom. De resultaten van onze functionele analyses tonen aan dat synthesoom-geassocieerde DNA primase activiteit in de P4 fractie afgeleid van borstkankercellen 30-maal hoger is dan die van ruwe borstkankercel extracten. De P4 fractie, die het DNA synthesoom bevat, werd afgeleid van de gecombineerde nucleaire en cytoplasmatische oplosbare eiwitfracties bereid uit MCF7 cellen en werd gebruikt om de SV40 in vitro DNA replicatie assay uit te voeren. De activiteiten van DNA polymerase α en δ en DNA primase in de P4 fractie zijn 20-40 maal hoger dan die van ruwe celextracten ; waardoor het een nuttig instrument is voor deze studies omdat het volledig in staat is de synthese en uitbreiding van RNA primers te ondersteunen in een in vitro modelsysteem waarvan is aangetoond dat het alle fasen van het DNA replicatieproces ondersteunt .
DNA primase vertoont een unieke processiviteit bij de synthese en uitbreiding van RNA primers. Deze processiviteit wordt bepaald door een competitie tussen de toevoeging van de volgende juiste nucleotide en dissociatie van het primer-template complex . DNA primase is het enige enzym dat in staat is RNA primers te synthetiseren tijdens de initiatie van de DNA synthese . Geen van de afzonderlijke primase subeenheden is in staat een RNA primer zelf te synthetiseren of te verlengen . Het synthesoom bevat beide primase-subeenheden (d.w.z. p49 en p58) en kan de synthese van RNA-primers in vitro katalyseren met gebruikmaking van een exogeen poly(dT)-sjabloon. De synthese levert een functionele RNA-primer van eenheidslengte (7-10 nt) op. Deze RNA-primers worden door RNase volledig gehydrolyseerd tot korte fragmenten van 1-4 bp, maar worden niet gehydrolyseerd door DNase. Het kenmerkende van het synthesoom-geassocieerde primase, dat het onderscheidt van een geïsoleerd DNA-primase, is zijn specifieke vermogen om RNA-primers te verlengen tot een DNA-primer streng. Voor de synthese van een DNA-primerstreng is naast DNA-primaseactiviteit ook DNA-polymeraseactiviteit vereist. De DNA-polymerase-activiteit wordt normaliter omgeschakeld om de verlenging van een RNA-primer te starten na de synthese van de primer. Alleen RNA-primers ≥ 7 nucleotiden lang worden door het polymerase gebruikt, ongeacht de dNTP-concentratie. Voor de synthese en verlenging van RNA-primers van eenheidslengte is dus niet alleen primase nodig, maar is ook de DNA-polymerase α-subeenheid p180 betrokken, en het synthesoom bevat zeer actieve DNA-polymerasen, die de incorporatie van deoxyribonucleotiden katalyseren om de RNA-primer te verlengen. RNA-primers worden door de met het synthesoom geassocieerde polymerasen verlengd uit een DNA-RNA-oligoprimeer van 20-40 nt lengte (DNA-primer). DNA-primerstrengen bevatten twee componenten: (1) een ribonucleotide van 10 nt en (2) een desoxyribonucleotide van 20-40 nt. RNase en DNase hydrolyseren afzonderlijk de juiste componenten van de DNA-primerstrengen, wat resulteert in verkorting maar onvolledige hydrolyse van de DNA-primerstreng.
Een ander kenmerk van het synthesoom is de snelle synthese en de verschillende grootte van de RNA-primer en de DNA-primerstreng. Het synthesoom katalyseert de synthese van zowel een RNA-primer als een DNA-primer streng snel, en steady-state niveaus lijken zich op te hopen binnen (5-15 min). De grootte van de eenheid-lengte RNA-primer (7-10 nt) en DNA-primer streng (20-40 nt) gekatalyseerd door het DNA synthesoom blijft altijd constant, ongeacht de synthesoom concentratie of reactietijd. Deze studie naar het mechanisme van DNA-primaseactiviteit impliceert dat de synthese van RNA-primers, gekatalyseerd door het met het synthesoom geassocieerde primase, verloopt via een langzame initiatie, snelle polymerisatie en “intelligente” beëindiging van de primer. DNA-primase bindt het DNA-sjabloon en initieert langzaam de synthese van een dinucleotide. Na de synthese van het dinucleotide worden snel extra NTP’s toegevoegd aan het door DNA-primase gepolymeriseerde dinucleotide. De activiteit van DNA-primase wordt gekenmerkt door synthese van elke RNA-primer in één enkele “uitbarsting” van activiteit, in plaats van via distributieve synthese. Zodra primers van een lengte van 7-10 nt zijn gegenereerd, fungeert de primase-template als terminatiesignaal en remt deze verdere RNA-synthese. Deze remming is te wijten aan de generatie van een stabiele primer-template, die waarschijnlijk geassocieerd blijft met het pol α-primasecomplex. Interessant is dat de DNA-primerstrengen die door het DNA-synthesoom in vitro worden gesynthetiseerd, vergelijkbaar zijn met de in vitro gesynthetiseerde RNA-primers die door het synthesoom worden gekatalyseerd. De synthese van een DNA-primer streng bereikt snel een steady state niveau en de grootte van de DNA-primer streng blijft relatief constant (tussen 20 en 40 nt), ongeacht de reactietijd of de concentratie van het synthesoom die tijdens de synthesereactie wordt gebruikt. DNA-primer strengsynthese vereist DNA polymerase α activiteit naast DNA primase . Onze resultaten suggereren dat de synthesoom-geassocieerde polymerase α-activiteit ook wordt gekenmerkt door een snelle polymerisatie en “intelligente” beëindiging in de synthese van de DNA-primer streng. Het synthesoom, met de eigenschap van snelle polymerisatie en intelligente beëindiging van de DNA-primer streng, verschilt van de synthese die door het Klenow fragment van E. coli DNA polymerase I tijdens de extensie van de RNA primer wordt gemedicteerd. In tegenstelling tot het synthesoom is de door polymerase I gekatalyseerde RNA-primer extensie sterk afhankelijk van de lengte van de reactietijd. Verhoging van de reactietijd verhoogt aanzienlijk de hoeveelheid en de grootte van de RNA-primers die worden verlengd.
Twee potentiële mechanismen zijn voorgesteld om de overgang van primersynthese naar primerextensie tijdens het DNA-replicatieproces te verklaren. Het eerste stelt voor dat het primase-polymerasecomplex loskomt van de primer-template en zich opnieuw associeert met de actieve site van de polymerase. De tweede stelt voor dat de omschakeling plaatsvindt in een intrastrand-translocatie van pol α-primasecomplex van de actieve plaats van primase naar de actieve plaats van polymerase α. Bij deze omschakeling is geen dissociatie van het pol α-primasecomplex van het DNA-sjabloon betrokken. Onze experimenten tonen aan dat polymerase I-gekatalyseerde RNA-primerextensie wordt geremd door hoge concentraties van het DNA-synthesoom. Het vermogen van het Klenow fragment om een RNA primer te verlengen hangt af van de synthese van RNA primers die gekatalyseerd wordt door het synthesoom, dat ook een beschikbare bindingsplaats aan het eindpunt van de RNA primer nodig heeft. Daarom vereist het Klenow-fragment van E. coli polymerase I de dissociatie van het primase-polymerase-complex van de primer-template. Hoge concentraties van het synthesoom concurreren echter met polymerase I om de bindingsplaats op de primer-template, zodat de extensie van de RNA-primer wordt geremd. Het synthesoom vormt een doodlopend complex aan het eindpunt van de RNA-primer, waardoor het Klenow-fragment niet kan deelnemen aan het extensieproces van de RNA-primer. Dit resultaat suggereert dat het polymerase-primase complex van het DNA synthesoom moet dissociëren van de primer-template na de synthese van de RNA primer. Ons resultaat toont aan dat het synthesoom de grootte van de RNA-primer met eenheidslengte vergroot wanneer de reactietemperatuur wordt verlaagd. Verlaging van de reactietemperatuur verhoogt de efficiëntie van het schakelen van het polymerase-primasecomplex en vermindert de denaturatie van de primer-template . Bovendien bevat de DNA primase p49 subeenheid de RNA polymerase katalytische activiteit, die nodig is om de grootte van de eenheids-lengte RNA primer te verhogen. Daarom suggereren onze resultaten dat het DNA synthesoom de juiste RNA polymerase activiteit heeft die nodig is om RNA-primed DNA fragmenten te vormen.
De kinetische analyse van RNA primer initiatie en elongatie toont aan dat synthesoom geassocieerd DNA primase een langzaam en relatief zwak enzym is met betrekking tot template-binding . DNA primase is ook een foutgevoelig nucleïnezuurpolymerase omdat dit enzym een zeer slecht nucleotide-discriminatievermogen heeft; wat resulteert in misincorporatie van nucleotiden . Daarom kan onze analyse van de enzymatische kinetiek van synthesoom geassocieerde DNA primase activiteit gebruikt worden om de relatie tussen synthetische snelheden en foutfrequenties tijdens de synthese van RNA primers te bepalen. De discontinue synthese van DNA (Okazaki) fragmenten op de achterliggende streng van de replicatievork is een belangrijk biochemisch proces tijdens de DNA replicatie. Om een doeltreffende coördinatie te verzekeren tussen de continue synthese van DNA op de voorste streng en de discontinue synthese van DNA op de achterste streng, vereist DNA primase een precies getimede reeks enzymatische stappen die de synthese van de RNA primer controleren. Een kinetische studie van een multiproteïne replicatiecomplex van bacteriofaag T7 toont aan dat het primase als een moleculaire rem werkt en de voortgang van de replicatievork tijdelijk tot stilstand brengt. Vanwege de fysische interactie van DNA polymerase δ met pol α suggereert het resultaat van Lee et al. dat DNA primase wellicht kan voorkomen dat de synthese van de leidende streng de synthese van de achterblijvende streng overvleugelt tijdens de langzame enzymatische stappen op de achterblijvende streng.
Verschillende eukaryotische DNA replicatiemodellen zijn gebruikt bij de bestudering van de functie van DNA primase. De nucleaire matrix replicatie systeem van hele cel lysaat is gebruikt om de synthese en distributie van natief RNA primer en RNA-primed nascent DNA in eukaryotische celkernen te onderzoeken met behulp van endogene nucleaire matrix-gebonden dubbelstrengs DNA template . RNA-primers zijn nauw verbonden met de kernmatrix van snel prolifererende zoogdiercellen. RNA-primers worden covalent gehecht aan pas gerepliceerd DNA om RNA-primed nascent DNA te vormen. RNA-primed DNA wordt afgebroken tot enkele oligoribonucleotiden van ~10 nt lengte na DNase digestie , en ten minste 94% van de natieve RNA-primers en RNA-primed nascent DNA bevinden zich binnen de onoplosbare matrixfractie van de kern. RNA-primers met een lengte van 8-10 nt die zich in de kernmatrix bevinden, maken <1% uit van het totale RNA in de cel, waardoor het zeer moeilijk is RNA-primers en RNA-primed nascent DNA in de kernmatrixfractie van de cel te onderzoeken wegens de zeer lage concentratie van RNA-primers en de relatief grote hoeveelheid ander RNA. Bovendien is de isolatie van RNA-primers en RNA-primed nascent DNA van radio-nucleotide labeling hele cel lysaten is een ingewikkelde en niet-triviale zuivering procedure wanneer toegepast op de analyse van de kernmatrix replicatie model-gemedieerde RNA primer synthese. Daarentegen bevat het DNA synthesoom gezuiverd uit de gecombineerde nucleaire en cytoplasmatische fracties zeer actieve DNA primase en DNA polymerasen, en ondersteunt het volledig de synthese van natief RNA primers in vitro met behulp van een dubbelstrengs SV40 oorsprong bevattende DNA template. De door DNA-synthese gesynthetiseerde RNA-primers zijn van normale lengte (10-20 nucleotiden) en lijken naar behoren te functioneren om primerextensie door DNA-polymerase te ondersteunen. Deze RNA-primers kunnen gemakkelijk worden verlengd tot RNA-geprimed nascent DNA van 100-200 nt. De discontinue synthese van DNA (Okazaki)-fragmenten op de achterliggende streng van de replicatievork is een belangrijk biochemisch proces dat betrokken is bij DNA-replicatie, en door het DNA-synthesoom gesynthetiseerde RNA-geprimeerde DNA (Okazaki)-fragmenten van volledige lengte zijn ook ongeveer 100-200 nucleotiden lang. Wij hebben geconstateerd dat het DNA synthesoom verschillende RNA-geprimede producten kan synthetiseren, variërend in grootte van 10 tot 200 nt in lengte. Dit kan als redelijk worden beschouwd, aangezien natief RNA-primers en RNA-geprimed nascent DNA ook ongeveer deze lengte hebben. De bovenstaande observatie, dat de synthese van RNA primer en RNA-primed nascent DNA, gekatalyseerd door het DNA synthesoom, in wezen gelijkwaardig is aan die van de studie gepubliceerd met behulp van de nucleaire matrix replicatie model van hele cel lysaat , suggereert dat het DNA synthesoom is een uitstekend modelsysteem in staat is tot het uitvoeren van een fysiologisch zinvol DNA replicatie proces in vitro.
Het DNA synthesoom model is daarom een unieke en waardevolle tool in de studie van DNA primase functie. Primase gemedieerde synthese en verlenging van RNA primer uitgevoerd door het DNA synthesoom lijkt sterk op die uitgevoerd door andere celvrije replicatiemodellen. Het synthesoommodel ondersteunt de synthese en verlenging van RNA-primers in vitro met behulp van exogene enkelstrengs DNA-sjablonen, maar ook met supergewikkeld dubbelstrengs DNA dat een intacte SV40-replicatieoorsprong bevat. Daarom is het DNA synthesoom volledig in staat om de synthese en uitbreiding van RNA primers in vitro te mediëren, en kan dit het verdere onderzoek vergemakkelijken van de mechanismen die de DNA synthese in eukaryote cellen initiëren. Samen suggereren onze resultaten dat het synthesoom model een uniek instrument biedt voor het bestuderen van de interactie tussen DNA primase en andere replicatie-eiwitten tijdens het DNA replicatieproces.