Production of Human Albumin in Pigs Through CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Human serum albumine (HSA) is het meest voorkomende plasma-eiwit dat cruciale homeostatische functies vervult in de menselijke fysiologie, waaronder het handhaven van de plasma-oncotische druk, regulering van de distributie van lichaamsvloeistoffen, transport van kleine moleculen, enz1. Het wordt voorgeschreven voor een aantal ernstige ziekten zoals leverfalen en traumatische shock2. Door het tekort aan menselijk bloed en de risico’s die verbonden zijn aan menselijk bloed, wordt al lang gezocht naar alternatieve productie van menselijk albumine. Recombinant HSA productie werd eerder geprobeerd bij varkens door dominante transgene expressie in de vorm van Albumine-GFP fusie3. In transgene benaderingen zijn echter, door de aanwezigheid van endogeen varkensalbumine, scheiding en zuivering van het rHSA problematisch. Door gebruik te maken van de kracht van CRISPR/Cas9 in genoom modificatie, hebben we getracht rHSA in varkens te produceren door menselijk albumine cDNA in de varkens albumine locus te kloppen. Door het menselijke ALB cDNA plus SV40 polyA signaal sequentie (2368 bp totaal) in varkens Alb locus in te brengen onmiddellijk stroomafwaarts van het startcodon, verwachten we dat menselijk ALB tot expressie komt onder varkens endogene albumine transcriptionele controle en tegelijkertijd de expressie van varkens endogene albumine blokkeert (Fig. 1a). We ontwierpen een sgRNA gericht op het startcodon regio (onmiddellijk 5′ van en met ATG) en genereerde een targeting fragment (donor voor homologe recombinatie) met de insert geflankeerd door 1 kb homologie sequenties aan beide zijden (Fig. 1a). Aangezien de 5′ homologie sequentie gebruikt in de donor loopt tot aan het startcodon, het bevat de sgRNA sequentie en dus kan worden gericht door de sgRNA als donor of de knockin allel na homologe recombinatie. Om dat te voorkomen, hebben we 6 bp (gccacc) in de sgRNA-sequentie ingevoegd, vlak voor het startcodon. De sgRNA werd in vitro getranscribeerd, gezuiverd en geïnjecteerd in de bevruchte eicellen, samen met Cas9 mRNA4 en de cirkelvormige vector die het targeting fragment bevatte. De bron van de oöcyten was Bama minipig5. De geïnjecteerde embryo’s werden gedurende 1-2 uur gekweekt alvorens te worden geïmplanteerd bij vrouwelijke dieren die met bronst werden gesynchroniseerd. ~300 embryo’s werden geïmplanteerd in 10 wijfjes waarvan er 5 zwanger werden en in totaal 16 levende pups ter wereld brachten. De pups werden standaard verzorgd en vertoonden geen tekenen van ongebruikelijke gezondheidsproblemen.
Knockin van menselijke ALB in varkens Alb locus.
(a) Schema van de knockin-strategie. (b) Genotypering van de founders. PRC primers zijn afgebeeld in (a). (c) Sequencingresultaten van de PCR-producten verkregen met primerpaar e/f (a). De producten werden gekloond en tot 12 klonen (voor #9) werden gesequeneerd.
We knipten de oorpunten van de 16 biggen af toen ze ongeveer 4 weken oud waren en verkregen genomisch DNA voor genotypering. Om te bepalen of we erin geslaagd waren knock-in te doen, beoordeelden we zowel de 5′- als de 3′-uiteinden van de insertieplaats. We gebruikten twee primerparen, a/b en c/d (Fig. 1a). Primer a bevindt zich buiten het 5′-uiteinde van de gebruikte homologie en b op humaan ALB (de insertie); c bevindt zich op humaan ALB en d buiten het 3′-uiteinde van de homologie. Zoals te zien is in Fig. 1b, dragen alle 16 biggen het bedoelde knockin allel. Wij kloneerden en sequenseerden alle geamplificeerde DNA-fragmenten. Zij waren de verwachte homologe recombinatieproducten (Fig. S1). Vervolgens bepaalden we de status van het wild-type allel in deze biggen. Primers e en f (opgenomen in de insert) (Fig. 1a) zouden een 705 bp fragment van de wildtype locus en een 3085 bp fragment van het knockin allel moeten amplificeren. Zoals verwacht, genereerden ze allemaal het 3085 bp fragment. Echter, onverwacht konden we het schijnbare 705 bp wildtype fragment verkrijgen uit slechts 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 en 15) van de 16 monsters, terwijl de rest zwakke producten rond 700 bp genereerde (Fig. 1b). Het duidelijke ontbreken van het wildtype allel in sommige biggen suggereert dat knockin op beide allelen kan hebben plaatsgevonden. Een andere mogelijkheid is dat het wildtype allel zodanig is bewerkt dat de primer a-sequentie is verwijderd, waardoor het wildtype allel niet wordt geamplificeerd. Inderdaad was er sprake van bewerking op het wildtype allel, omdat de grootte van de geamplificeerde fragmenten bij sommige biggen afweek van de voorspelde 705 bp (Fig. 1b). Om dat te bevestigen, hebben we alle geamplificeerde fragmenten gekloond en gesequenced. Zoals in Fig. 1c te zien is, waren ze allemaal ge-edit, hoewel sommige slechts een paar basenpaar veranderingen waren (vandaar dat ze op 705 bp leken te liggen). Van deze ge-edit allelen zijn die gevonden in big #10 en #12 van belang. Die in big #10 was het resultaat van de vervanging van een stuk van 29 bp (van het ATG naar het 3′ einde) varkenssequentie door 36 bp (6 bp 5′ van het ATG en 26 bp daarna) donorsequentie. Het is onduidelijk hoe dit gebeurd is. In #12 zijn er twee verschillende bewerkte allelen, wat het totale aantal allelen op 3 brengt, wat wijst op mozaïcisme in dit biggetje, wat niet ongewoon is aangezien mozaïcisme vaak werd aangetroffen bij dieren die werden gegenereerd door zygote injectie van Cas9/sgRNA6,7,8,9,10.
Om te bepalen of off-targeting had plaatsgevonden met de sgRNA, kozen we 4 top potentiële off-target sites op basis van suggesties van CRISPR ontwerphulpmiddel (http://tools.genome-engineering.org) en geamplificeerde fragmenten die deze sites van de oortip genomisch DNA van biggetje # 14. De fragmenten werden onderworpen aan T4EN I assay4. Zoals getoond in Fig. S2, werd geen off-target editing gevonden. We konden echter de mogelijkheid niet uitsluiten dat off-target editing plaatsvond in andere loci of in de andere 15 transgene varkens. Niettemin, zelfs als er off-target editing was, is het onwaarschijnlijk dat de bewerkte loci problematisch zijn voor ons doel van het produceren van rHSA, zolang ze niet interfereren met het welzijn van deze transgene varkens.
Hoewel we succesvolle knockin van de menselijke ALB hadden aangetoond, probeerden we te bepalen of menselijke albumine kon worden gedetecteerd in het bloedplasma van deze knockin-biggen. Zoals getoond in Fig. 2a, bevatten alle biggen humaan albumine in hun bloedplasma detecteerbaar met de antilichamen specifiek tegen humaan albumine, zij het met variabele niveaus, wat waarschijnlijk een resultaat is van ten minste twee factoren, of beide allelen knockin zijn en de mate van mozaïcisme (vooral in de lever). Het niveau in nr. 7 is zeer laag en pas zichtbaar na lange blootstelling van de blot, ondanks het kennelijke ontbreken van het wild-type varken-Alb-allel (fig. 1a). Over het geheel genomen zijn de niveaus veel lager dan die in sera van volwassen mensen. Het is bekend dat de concentratie van bloedalbumine bij varkens met de leeftijd toeneemt en op de leeftijd van 6 maanden een niveau bereikt dat vergelijkbaar is met dat bij volwassen mensen11.
Analyse van menselijke ALB in het bloed.
(a) Western blot detectie van menselijke albumine in het bloed van oprichtingsbiggen. 0,5 μl plasma van elke founder werd gescheiden op SDS-PAGE en geanalyseerd. Menselijk bloedplasma (0,5 μl na 30 maal verdund) werd gebruikt als positieve controle. C, plasma van een wildtype varken. (b) Illustratie van tryptische peptiden (groen) gedetecteerd met mass spec analyse. (c) Semi-kwantificering van twee tryptische peptiden uit menselijk en varkensalbumine door het meten van de piekoppervlakken van elk peptide. Rood markeert de aminozuurresiduen die specifiek zijn voor varken.
Om te bevestigen dat het rHSA dat in het plasma van onze knock-in biggen met antilichamen werd gedetecteerd echt menselijk albumine is, onderwierpen we twee plasmamonsters (biggen #2 en #6) aan massaspectrale analyse. # 2 is blijkbaar homozygoot voor de knockin allel en # 6 bevat een knockin en een mutant allel (frameshift) (Fig. 1). 0,5 μl plasma werd gescheiden op SDS-PAGE en eiwitten rond 70 KD werden in-gel verteerd met trypsine. De tryptische peptiden werden geëlueerd uit de gel, gedroogd en opnieuw opgelost voor scheiding door vloeistofchromatografie en mass spec analyse. Voor biggetje #2 konden we 14 unieke humane ALB tryptische peptiden opsporen en 15 voor #6 (Fig. 2b). M/Z spectra voor menselijk peptide FKDLGEENFK en varken peptide FKDLGEQYFK (beide van big #2) werden getoond in Fig. S3. Twee peptiden werden gekozen voor kwantificering door het meten van de piekgebieden. In overeenstemming met de western blot resultaten, waren deze twee peptiden veel meer (~5 keer) overvloedig in #2 dan in #6 (Fig. 2c). Deze resultaten tonen aan dat het door antilichamen gedetecteerde rHSA authentiek menselijk albumine is.
Genotypering van het DNA geïsoleerd uit de oortips geeft aan dat zowel #2 als #6 geen wildtype varken-Alb allel bevatten, ofwel niet aanwezig ofwel bewerkt (Fig. 1b,c). We konden echter nog steeds tryptische peptiden van varkensalbumine detecteren in beide stalen, maar in veel lagere abundantie (Fig. 2c). Interessant is dat de abundantie van varkenspeptiden tussen de twee monsters ongeveer gelijk was, ondanks het feit dat de abundantie van menselijke peptiden sterk verschilde. Deze resultaten suggereren dat beide biggen een vergelijkbaar aantal wildtype (of heterozygote) hepatocyten bevatten, die verantwoordelijk zijn voor de in het bloed van deze twee biggen gedetecteerde varkens-ALB. Het is echter mogelijk dat dergelijke wildtype allel-bevattende cellen niet bestaan of in een extreem laag percentage voorkomen in de oorpunten, zodat het wildtype allel niet door PCR kon worden geamplificeerd. Verder wees Southern blot analyse met een interne probe (3′ helft van menselijke ALB CDS) op de aanwezigheid van een extra insertie van de donorsequentie in biggen #1, 4 en 5 (Fig. S4). Al deze complicaties zullen geen probleem zijn voor het doel van de productie van recombinant humaan albumine, aangezien het knockin allel gezuiverd kan worden door terugkruisen.
Om te bepalen of het knockin allel kan worden overgedragen op de volgende generatie, kruisten we #2 (mannelijk, homozygoot) met #5 (vrouwelijk, heterozygoot) toen ze reproductief volwassen werden. Uit de kruising werden 6 pups geboren. 4 van hen (#1, 3, 4 en 6) zijn homozygoot voor het knockin allel (AlbH/H, H staat voor mens) en 2 (#2 en 5) heterozygoot (AlbP/H, P staat voor varken) (Fig. 3a). #5 en 6 stierven aan diarree ongeveer 2 weken na de geboorte. We analyseerden de menselijke albumine-expressie in het bloed van de resterende biggen op de leeftijd van 4 weken. Zoals getoond in Fig. 3b, hebben alle biggen humaan albumine in hun bloed. Interessant is dat het niveau van humaan albumine in het heterozygote dier (#2) veel lager was dan dat in de homozygoten. We weten niet of dit een gevolg is van individuele variatie of dat het knockin-allel op de een of andere manier wordt onderdrukt door het wildtype allel.
Germline transmissie van het knockin-allel.
(a) PCR genotypering van de F1 nakomelingen. De gebruikte primers waren dezelfde als in fig. 1. (b) Western blot detectie van humaan albumine in het bloed van de F1 biggen. 0,5 ul plasma van elke big werd gescheiden op SDS-PAGE en geanalyseerd. C, plasma van een wildtype varken. M, moleculaire gewichtsmarker.
Wij tonen hier de succesvolle generatie van varkens met menselijk ALB cDNA geklopt in de varkens Alb locus. Dit is een stap verder dan de eenvoudige gen-editing in varkens zygotes onlangs gemeld door Hai et al.12 en ons13. Grote gedomesticeerde dieren zijn nagestreefd als bioreactoren voor biomedische eiwitproducten14,15,16,17,18,19,20. Meestal werden de coderende sequenties van deze eiwitten samen met de nodige transcriptiecontrole-elementen als transgenen willekeurig in het genoom ingevoegd, wat gepaard gaat met vele complicaties, waaronder het kortetermijnkarakter van de transgene expressie. Onze demonstratie dat homologe recombinatie zeer efficiënt kan plaatsvinden in varkenszygotes opent de deur voor de ontwikkeling van steeds betere bioreactoren en van veestammen met steeds meer gewenste eigenschappen.