Evolução da Cólera Vibrio Toxigénica e estabelecimento de reservatórios nos ecossistemas aquáticos
Resultados
Quatro departamentos – Artibonite, Centro, Nord-Ouest, e Ouest- contabilizam 90% dos casos de cólera relatados no Haiti (9). Concentramos nossos esforços no Departamento de Ouest (Fig. 1A), uma região costeira rica em ecossistemas aquáticos onde isolamos a cólera toxigênica V. cholerae O1 de sítios ribeirinhos e estuarinos fixos (Fig. 1A). A prevalência de toxigênicas aquáticas V. cholerae O1 correlacionada com o aumento da temperatura e da precipitação, mas não com a contagem de coliformes fecais, sugerindo que a presença não foi devida apenas à contaminação fecal (10). A contagem de casos mensais em Ouest, oscilando anualmente mas diminuindo durante a estação seca e aumentando durante a estação chuvosa (abril a outubro), correlacionada com o aumento da temperatura e da precipitação (Fig. 1B). Isto está de acordo com os padrões de V. cholerae O1 endêmica em Bangladesh e Peru, onde surtos sazonais de cólera se correlacionam com o aumento da V. cholerae O1 no ambiente e aumentos da temperatura da água ou da precipitação (11, 12).
Para distinguir entre evolução sob pressão seletiva (adaptação) ou deriva genética, calculamos a razão de taxa de não-sinônimo (dN) e de substituição sinônima (dS) (dN/dS) (SI Apêndice, Fig. S6 e Tabela S5). A dinâmica evolutiva dos isolados clínicos foi impulsionada principalmente pela seleção purificadora (dN/dS = 0,6, P < 0,001), consistente com um D negativo de Tajima (-2,3, P < 0,005) e uma população com gargalos e/ou varreduras seletivas. Espera-se que a selecção negativa impulsione a epidemia já estabelecida em humanos que atingiu um pico na paisagem adaptativa durante uma fase precoce da epidemia, impulsionada pela diversificação da selecção (14). Em contraste, os isolados ambientais apresentaram maiores taxas não-sinônimas (dN/dS = 2,1, P < 0,001), características de uma população microbiana heterogênea recentemente introduzida em um novo ambiente e em processo de fixação de nova seleção diversificativa orientada pela variância. Na verdade, encontramos impressões moleculares específicas do ambiente nos genomas de V. cholerae que se replicaram e persistiram com sucesso no ambiente aquático. Um total de sete mutações não-sinônimas em regiões codificadoras, potencialmente concedendo uma vantagem seletiva à população ambiental de V. cholerae, surgiu ao longo da espinha dorsal da filogenia isolada ambiental entre 2012 e 2015 (Fig. 3 e Apêndice SI, Tabela S7). Três mutações ambientais específicas, duas no início da bifurcação da espinha dorsal (Fig. 3) e uma num ramo interno (Apêndice SI, Tabela S7), genes afectados no sistema de secreção tipo II (TSSII): proteínas A e G da via de secreção geral e K (Apêndice SI, Tabela S7). O TSSII desempenha um papel fundamental na virulência e sobrevivência de V. cholerae em diferentes nichos, como reservatórios aquáticos ou hospedeiros humanos (26). Outras mutações encontradas ao longo dos ramos internos afectaram genes relacionados com a resposta ao stress ambiental, quimiotaxia/motilidade de V. cholerae em resposta a sinais ambientais flutuantes, controlo do comprimento de gancho de flagelo, formação de biofilme no ambiente extraintestinal, e crescimento exponencial em resposta aos nutrientes disponíveis (SI Apêndice, Fig. S7 e Tabela S7). Os isolados ambientais que contribuíram com sucesso para a evolução da linhagem ambiental foram coletados não apenas perto de hospitais e centros de tratamento de cólera localizados em Gressier, mas também nas regiões próximas de Goave e Carrefour (Fig. 3).
Evolução e adaptação de V. cholerae em reservatórios aquáticos haitianos. Relação filogenética e distribuição geográfica de 27 isolados ambientais coletados entre 2012 e 2015 no Haiti. Mutações não sinônimas adquiridas durante a evolução da população ambiental, reconstruídas pela inferência Bayesiana dos estados ancestrais, são indicadas ao longo da espinha dorsal da árvore. Os SNPs detectados ao longo do tronco (linhagem sobrevivente) da árvore foram numerados sequencialmente de 1 a 7 para facilitar a comparação com a informação adicional reportada no Apêndice SI, Tabela S7. Os mapas mostram os locais de amostragem, agrupados por fonte aquática, rotulados com pontos amarelos, vermelhos, laranja e ciano na região de Gressier, roxo para Carrefour, e azul na região de Jacmel.
As evidências das forças evolutivas epidemiológicas e ambientais que impulsionaram a epidemia haitiana motivaram-nos a considerar um modelo dinâmico de transmissão de rastreamento da cólera e genética populacional através de ambientes aquáticos e hospedeiros. Como em modelos anteriores de cólera de nosso grupo (27), nosso modelo epidemiológico subjacente é baseado na estrutura de reservatório (SIRW), uma extensão da estrutura clássica de reservatório (SIR) com um compartimento adicional para concentração de patógenos em um reservatório aquático (W) (Fig. 4 e Apêndice SI, Figs. S8 e S9). De acordo com Kirpich et al. (27), permitimos a replicação fora do hospedeiro, juntamente com a sazonalidade na transmissão ambiental, descamação e decaimento, como sugerido pela correlação significativa no caso de contagens com precipitação. Além dessa formulação epidemiológica, consideramos um componente evolutivo em nosso modelo. Tanto a deriva neutra quanto as pressões de seleção são contabilizadas em nossa estrutura multilocus, onde medimos Ne calculando a diversidade genética e utilizando abordagens coalescentes (Anexo SI, Texto). Consistente com outros estudos, assumimos um tradeoff entre capacidade de sobrevivência ambiental e aptidão na transmissão de loci para o hospedeiro sob selecção. Os resultados das simulações de modelos recapitulam características qualitativas do Ne e contagens mensais de casos (Fig. 4A e SI Apêndice, Fig. S8).
Modelo de cólera e predição de vacinação. (A) Ne (tamanho efetivo da população) observado a partir dos dados (cinza) e em simulação com replicação ambiental (verde) e Ne em simulação sem replicação ambiental (violeta). (B) Cenários distintos de vacinação e controle para o modelo de simulação com replicação ambiental, em particular coberturas de vacinação de 64% (taxa de 0,01 d-1), 88% (taxa de 0,04 d-1) e 64% com um aumento de 10% na taxa de decaimento ambiental. Aqui definimos a cobertura vacinal como a redução percentual em indivíduos suscetíveis (ao atingir um estado estável aproximado após 2 a 3 meses de vacinação). Ao contrário de Kirpich et al. (27) e simulações sem replicação ambiental (Anexo SI, Fig. S10) nas quais 64% de cobertura vacinal erradica o patógeno dentro de um ano, aqui ou mais vacinação (88% de cobertura) ou maior decadência ambiental (10% de aumento) é necessária para controlar a cólera na presença de replicação ambiental.
Primeiro, tanto a produção do modelo como os dados mostram um aumento e uma queda no Ne inicialmente reflectindo uma rápida expansão seguida de uma selecção negativa após o surto inicial (Fig. 4A). Depois veio a observação de um segundo crescimento em Ne em 2013, maior em extensão do que seria esperado apenas pela transmissão do hospedeiro, produzido por um flare-up sazonal anterior e que se estendeu a um período de redução da incidência. Nossa hipótese de diversificação dentro do reservatório aquático oferece uma explicação para este aumento relativo no Ne, e é apoiada por simulações de modelos razoáveis onde a inclusão de replicação ambiental permite esta exploração evolutiva em contraste com casos sem replicação ambiental (Fig. 4A e SI Apêndice, Fig. S8). Em particular, durante o pico final de 2012 a meados de 2013, foram detectados PNUs uuSNPs nos seguintes genes da linhagem ambiental sobrevivente: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051 gene (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C), e Vch1786_II0794 (107 C→A) (Apêndice SI, Fig. S3). As mutações nestes genes podem ter contribuído para uma maior adaptação das estirpes ambientais no ecossistema aquático, embora venham a ser necessários futuros estudos in vitro para investigar a sua contribuição para a aptidão para a V. cholerae. O pico na replicação ambiental é seguido por um declínio substancial em Ne começando antes do período de maior calmaria em 2014. Mais uma vez, a incidência de casos não explica completamente a magnitude desta queda. Enquanto o estrangulamento populacional induz uma diminuição no Ne, simulações sugerem que a replicação ambiental é necessária para acelerar a fixação de genes adaptados à persistência no reservatório aquático. No final de 2014, os reservatórios ambientais se espalham para os hospedeiros com um pico em casos clínicos, possivelmente aumentado por uma adaptação benéfica do hospedeiro e/ou perda de imunidade na população hospedeira. Simulações extensivas calibradas para os dados do caso sugerem que, a fim de se adequar adicionalmente ao Ne observado, a replicação ambiental deve ser incluída no modelo. Uma grande ramificação das nossas conclusões é que a replicação e adaptação dentro do reservatório aquático pode tornar mais difíceis as estratégias de controlo que visam a transmissão do hospedeiro. De fato, projetando para frente a partir de 2015 em simulações, observamos que a vacinação pode limpar facilmente o patógeno na ausência de replicação ambiental (Apêndice SI, Fig. S10). Entretanto, para adaptação e replicação ambiental consistente com o Ne observado, a vacinação de uma parcela muito maior da população ou a adição de uma intervenção que afete o reservatório aquático é necessária para eliminar a cólera em nosso modelo dinâmico de transmissão mista (Fig. 4B).