Nutrófilos transmigrados no lúmen intestinal atacam o ICAM-1 para regular a barreira epitelial e o recrutamento de neutrófilos
ICAM-1 promove a adesão de PMN e locomoção na membrana epitelial apical sob as condições de inflamação
Em abcessos criptográficos, Como observado na DII ativa, o PMN infiltrando as criptas intestinais é frequentemente observado em contato íntimo com a superfície epitelial apical (luminal).14 Para examinar as interações PMN-IEC durante os estágios finais do TEM, modelamos a migração de PMN através do epitélio intestinal sob condições inflamatórias usando uma configuração transwell previamente descrita.19 O TEM de PMN na direção fisiológica basolateral-apical através do controle ou interferon-γ (IFNγ)-tratado T84 IECs foi induzido pela adição de um gradiente transepitélico N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). A exposição do T84 IECs ao IFNγ (100 U ml-1, 24 h) não teve efeito significativo na função da barreira IEC ou expressão e localização subcelular das proteínas juncionais chave JAM-A, Occludin, e ZO-1 (Figura Suplementar S1 online). O tratamento IFNγ não teve efeito significativo no número de PMN que completaram o TEM; entretanto, aumentou significativamente o número de PMN apicamente associados (de 8,7±1,8%, sem tratamento, para 19,7±1,9%, IFNγ, apical, Figura 1a). Consistente com este aumento, o número de PMN não-migrado (PMN na câmara superior, basal) foi significativamente reduzido (∼1,5 vezes) após o tratamento IFNγ, sugerindo um aumento da taxa de migração (Figura 1a). O número de PMN dentro da monocamada epitelial (epitélio) não foi alterado. Imagens representativas de imunofluorescência confocal (Figura 1b, painéis superiores) e z-projeções (painéis inferiores) mostram PMN apicalmente associado após migração através do IFNγ estimulado, mas não controla as monocamadas T84. Como o IFNγ demonstrou anteriormente induzir a expressão do ICAM-1 no epitélio inflamado,27 nós colocamos a hipótese de que durante a inflamação, o PMN migrando através das monocamadas epiteliais permaneceu aderente à membrana apical através das interações Mac-1 e ICAM-1-dependente, e portanto seria capaz de locomoção dependente do ICAM-1 como foi previamente observado no endotélio vascular.24, 28 Confirmando resultados anteriores, o tratamento IFNγ (100 U ml-1, 24 h) induziu um aumento robusto e dependente do tempo na expressão ICAM-1 (pico de 24 h após o tratamento, Figura 1c,d) na membrana apical do T84 IECs (Figura 1e). Este efeito foi específico para IFNγ, pois a exposição das IECs T84 e SKCO15 ao fator de necrose tumoral-α (TNFα; 10 ng ml-1) falhou em induzir a expressão ICAM-1 (Figura Complementar S2A,B). A upregulação do ICAM-1 também foi observada no epitélio criptográfico das biópsias do cólon de pacientes com colite ulcerativa ativa em comparação com a mucosa saudável (Figura 1f). Além disso, confirmando a adesão de PMN dependente de ICAM-1 e Mac-1 às membranas IEC apicais, a adição de anticorpos anti-ICAM-1 ou anti-Mac-1 de bloqueio da função (Abs; 20 μg ml-1) reverteu o aumento da adesão de PMN induzido por IFNγ (Figura Suplementar S3A). Curiosamente, a inibição do PMN Mac-1 resultou em uma redução mais potente (>3 vezes) na adesão de PMN comparado com a inibição do ICAM-1, sugerindo que o Mac-1 liga outros ligantes epiteliais de superfície além do ICAM-1.
Interferon-γ (IFNγ)-expressão induzida da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) promove retenção de neutrófilos (PMN) na membrana epitelial apical. (a) O PMN foi estimulado (100 nM N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF)) a migrar através de células epiteliais intestinais controladas ou tratadas com o IFNγ (IECs). Foram quantificados PMN não-migrado (basal), PMN dentro da camada epitelial (epitélio), PMN associado à membrana IEC apical após migração transepitélica (TEM) (apical), e PMN que completou TEM (TEM). (b) Após 1 h de TEM, as monocamadas IEC foram fixadas e coradas para núcleos celulares (azul) e PMN Mac-1 (verde). Imagens representativas mostram a fixação apical aprimorada de PMN após migração através do T84 IECs tratado em IFNγ. Barra = 20 μm. Os painéis inferiores são projeções de imagens adquiridas em série na direção z. (c-f) Confluentes T84 IECs foram tratados com IFNγ (100 U ml-1, 24 h) para induzir a expressão superficial do ICAM-1. (c) Diagrama de citometria de fluxo representativo e (d) quantificação da expressão do ICAM-1 em resposta ao tratamento com IFNγ. A expressão do ICAM-1 foi induzida de forma dependente do tempo, com pico às 24 h. (e) Os T84 IECs foram fixados em etanol e imunofluorescentemente rotulados para ICAM-1. A imagem representativa (z projeção de sete fatias confocais) demonstra que a expressão ICAM-1 é restrita à superfície epitelial apical. (f) Seções de tecido não inflamado e inflamado de biópsias de paciente humano com colite ulcerosa foram coradas para ICAM-1 (verde) e núcleos (Topro-3, azul). Imagens representativas de imunofluorescência mostram a upregulação da expressão do ICAM-1 no tecido inflamado (painel direito), mas não no tecido normal (painel esquerdo). Barra = 50 μm. N=5 experimentos independentes em triplicatas, **P<0.01, teste t de Student de duas caudas (a), análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls (d).
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Examinamos a seguir se o PMN aderiu apicalmente após atravessar o epitélio exibiu locomoção apical. A microscopia de fase-contraste time-lapse foi usada para rastrear e quantificar o comportamento do PMN individual aderido à membrana apical IEC. O PMN na ausência de estímulo exógeno exibiu pouco movimento; entretanto, 59,3±7,6% do PMN apicalmente associado após a migração através de IEC exibiu um comportamento altamente móvel (Figura 2a) com distâncias médias de engatinhar de 65,6±6,2 μm (Figura 2b). O TEM induziu um aumento robusto na expressão Mac-1 na superfície da célula PMN (Figura 2c), consistente com seu papel nas interações apicais PMN-IEC. Importante, o número de PMN exibindo locomoção apical foi significativamente aumentado quando IECs foram estimulados com IFNγ para upregular o ICAM-1 (88±3,6%, IFNγ, vs. 59,3±7,6%, IEC sem tratamento). Sob essas condições, o PMN viajou por distâncias significativamente maiores (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, IECs não tratadas, Figura 2b) ao longo da membrana epitelial apical. Confirmando o papel do ICAM-1 na mediação da locomoção do PMN, a adição de um anticorpo anti-ICAM-1 (Ab) bloqueador de funções reverteu os efeitos do IFNγ, reduzindo tanto o número quanto as distâncias percorridas pelo PMN (61,4±7,8% e 73,6±6,1 μm, respectivamente, Figura 2a,b). A inibição do Mac-1 aboliu a locomoção do restante do PMN aderente (Figura 2a e Filmes Suplementares S1 e S2), confirmando um papel exclusivo do Mac-1 neste processo. Os efeitos da inibição do Mac-1 na locomoção do PMN são ainda destacados em seqüências de imagens com lapso de tempo (Figura 2d) e por trajetórias de deslocamento de seis PMN representativos (Figura 2e). As velocidades de deslocamento do PMN variaram de 3 a 7 μm min-1 e não foram significativamente diferentes em IECs não estimulados vs. IFNγ (Figura Suplementar S3B).
Nutrófilos (PMN) acoplados eletricamente exibem a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1)- e a locomoção dependente de Mac-1. (a, b) Após a migração transepitalar (TEM), o PMN foi permitido aderir apicalmente às células epiteliais intestinais (IECs) cultivadas na câmara inferior dos transwells. O número de PMN exibindo locomoção (a) e as distâncias percorridas (b) foram visualizados e quantificados na presença ou ausência do controle apropriado de IgG, ou anticorpos anti-ICAM-1 e Mac-1 (Abs; 20 μg ml-1), usando microscopia de fase de contraste temporal (Zeiss, Axiovert microscope) e software ImageJ. (c) PMN antes (linha preta sólida) e depois TEM (linha pontilhada) foram analisados para expressão Mac-1 usando citometria de fluxo. O fluxograma representativo (n=4) mostra a upregulação robusta do Mac-1 na superfície PMN após o TEM. A área preenchida representa a coloração IgG de controle. (d) Sequência de imagem representando o PMN representativo exibindo locomoção em IECs T84 na ausência (painéis superiores) e na presença de Ab Mac-1-blocking (painéis inferiores). *Posição inicial do PMN, setas brancas no movimento do PMN. As linhas tracejadas destacam o trajeto percorrido pelo PMN durante 40 min. Barra = 20 μm. (e) Trajetórias de movimento (em μm) de seis experimentos representativos de PMN de três experimentos independentes durante períodos de 40 min. na superfície apical do interferon-γ (IFNγ)-suportado T84 IECs na ausência (painéis superiores) e na presença do Mac-1-blocking Ab (painéis inferiores). n=4 experimentos independentes em duplicatas, **P<0.01, análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls (a,b).
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A adesão de PMN à membrana epitelial apical compromete a função da barreira epitelial
Examinamos em seguida os efeitos das interações de PMN com ligandos epiteliais expressos apicamente sobre a função da barreira epitelial. Nesses experimentos, PMN foram adicionados apicalmente aos confluentes T84 IECs cultivados em suportes permeáveis (0,4 μm tamanho do poro, muito pequeno para permitir PMN TEM), e TER, como um índice de barreira epitelial, foi medido em 12-h sob condições especificadas. O período de 12-h foi selecionado para evitar os efeitos do PMN apoptótico sobre a barreira epitelial.29 A adesão do PMN estimulado por fMLF (100 nM) ao T84 IECs desencadeou uma diminuição dependente do tempo no TER durante um período de 12-h (∼60%, Figura 3a). Importante, a adição de PMN à membrana apical dos IECs T84 que foram pré-tratados com IFNγ, o que mostramos leva a uma maior adesão ao PMN dependente do ICAM-1 (Figura 1a), resultou em um decréscimo adicional na TER (∼90% primeiras 2 h e ∼40% durante 12 h). O tratamento com IFNγ por si só não teve efeito no TER. Para testar se o aumento observado na permeabilidade epitelial foi devido a um contato direto entre células epiteliais e PMN, utilizamos um anti-Mac-1 inibitório Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1) para inibir a adesão de PMN às IECs estimuladas pelo IFNγ. A inibição do Mac-1 atenuou significativamente a diminuição induzida pelo PMN no TER após a estimulação do IFNγ (Figura 3a). É importante notar que em experiências separadas confirmamos que a diminuição induzida pelo PMN na TER tanto em monocamadas epiteliais não estimuladas como em monocamadas epiteliais tratadas com IFNγ foi dependente do contacto directo entre o PMN e a membrana epitelial apical, e não mediada por mecanismos parácrinos. Em tais experiências, os PMNs foram adicionados à câmara inferior de transwells contendo monocamadas T84 invertidas (lado apical virado para baixo) e estimuladas com fMLF (100 nM). Nestas condições, não houve efeito do PMN sobre a barreira epitelial avaliada pelo TER (Figura 3b). A exposição de monocamadas epiteliais a 100 nM fMLF durante 12 h não teve efeito significativo na TER.
Interacções do Neoutrófilo (PMN) com a função de barreira de comprometimento da membrana epitelial apical. (a) PMN (2,5 × 105 células) foram introduzidas na superfície apical de células epiteliais não tratadas (Control) ou interferon-γ (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h)-células epiteliais T84 intestinais tratadas (IECs) cultivadas em suportes permeáveis (0.4 μm tamanho do filtro, prevenir a migração transepitélica de PMN (TEM)), na presença ou ausência de N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM) e na presença ou ausência de anticorpos inibidores anti-Mac-1 (Ab; 20 μg ml-1). As alterações resultantes na TER como índice da função de barreira epitelial foram medidas nos pontos de tempo indicados. O contato do PMN com a superfície epitelial apical resultou em uma diminuição dependente do tempo na TER, que foi parcialmente revertida com a inibição das interações entre o PMN e as células epiteliais. N=4 experimentos independentes em triplicatas, *P<0,05, **P<0,01, e ***P<0,001 significativamente diferente de Control+fMLF+PMN, ^^^P<0,001 significativamente diferente, análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls. (b) Foram adicionados PMNs nas proximidades da membrana apical do não estimulado (controle) ou IECs tratadas com IFNγ (IFNγ+PMN+fMLF) sem contato direto (câmara inferior de configuração transwell) na presença ou ausência de estimulação fMLF (100 nM). Não foram observadas alterações na TER, o que sugere efeitos dependentes do contacto. N=4 experimentos independentes em triplicatas.
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Ligação do ICAM-1 epitelial desencadeia um aumento da permeabilidade epitelial dependente de MLCK
Observamos que a upregulação apical do ICAM-1 potencializou significativamente os efeitos da adesão ao PMN dependente de Mac-1 na barreira epitelial (Figura 3a). Assim, nós colocamos a hipótese de que o aumento na permeabilidade das monocamadas epiteliais tratadas com o IFNγ foi devido ao aglomerado ICAM-1 mediado pelo PMN e uma indução de eventos de sinalização dependentes do ICAM-1, como descrito anteriormente no endotélio vascular.30, 31 T84 monocamadas IEC em suportes permeáveis foram tratadas com o IFNγ para induzir a expressão do ICAM-1, seguido pela adição de Abs de ligação cruzada ao ICAM-1. Nós confirmamos que o crosslinking induzido por Ab-mediated ICAM-1 clustering (Figura Suplementar S2C). Como mostrado na Figura 4a, o crosslinking Ab-mediated do ICAM-1 resultou em uma diminuição dependente do tempo no TER, que correlacionou com o aumento do fluxo paracelular de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran (3 kDa, Figura 4b). Este efeito foi específico para o ICAM-1, pois o reticulado de outras moléculas epiteliais de superfície, o complexo de histocompatibilidade maior-1 (MHC-1; Figura 4), e o conhecido ligante PMN, CD55 (Figura Complementar S5), não teve efeito significativo na permeabilidade. Consistente com a ausência da expressão ICAM-1 em IECs T84 não estimuladas, a aplicação de abs reticulados na superfície apical dessas IECs na ausência do IFNγ estimulação não teve efeito no TER (Figura Suplementar S4A). Da mesma forma, consistente com a localização do ICAM-1 induzida pelo IFNγ na membrana epitelial apical, a aplicação de Abs reticulado no aspecto basolateral das monocamadas epiteliais não teve efeito significativo na função de barreira (Figura Suplementar S4B).
Antibody (Ab)-mediated crosslinking of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) leads to an myosin light-chainainase (MLCK)-dependent increase in epithelial permeability. As células epiteliais intestinais T84 (IECs) cultivadas em suportes permeáveis foram estimuladas com interferon-γ (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h) para induzir a expressão ICAM-1. ICAM-1 ou proteína de superfície de controle maior histocompatibilidade complexa-1 (MHC-1) foram reticuladas por incubação com Ab primário (20 μg ml-1, 60 min) seguido por anticorpos secundários apropriados (20 μg ml-1, 30 min). TER (a) e fluxo de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran (3 kDa) (b) através de monocamadas T84 antes e depois da reticulação ICAM-1 foram quantificados nos pontos de tempo indicados como um índice de permeabilidade epitelial. Um inibidor farmacológico da MLCK, ML-7 (20 μM), foi introduzido uma hora antes do início dos protocolos de reticulação. A ligadura ICAM-1 resultou na diminuição do TER e aumento do fluxo de FITC-dextran, e foi dependente da fosforilação MLCK. (c) Manchas ocidentais representativas e análise densitométrica (usando ImageJ) mostram aumento da fosforilação MLCK após o crosslinking ICAM-1, que foi revertida com a adição do ML-7. (d) Microscopia confocal e marcação de imunofluorescência foram usados para examinar a remodelação do actin após o crosslinking do receptor de controle apicalmente expresso MHC-1, e especificamente ICAM-1, na presença ou ausência do ML-7 (20 μM). O crosslinking do ICAM-1, mas não do MHC-1, resultou na diminuição da borda apical do pincel e da actina juncional. Este efeito foi revertido na presença do ML-7. Barra = 50 μm. N=4 experimentos independentes em triplicatas (a,b), *P<0,05, **P<0,01 significativamente diferente do controle (a), **P<0,01, ***P<0,01, n.s. não significativo, (b,c), análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls.
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Mostramos anteriormente que eventos iniciais em TEM PMN (ao nível da membrana epitelial basolateral) disparam diminuições mediadas por MLCK em TER.9 MLCK tem mostrado ter um papel chave na regulação da permeabilidade epitelial regulando a contração do anel de actomiosina perijuncional através da fosforilação da cadeia de luz reguladora da miosina II.32 Assim, nós perguntamos se o aumento da permeabilidade IEC após a ligadura do ICAM-1 apicalmente expresso era dependente da MLCK. De fato, a ligação cruzada do ICAM-1 mediada por Ab resultou na fosforilação MLCK (Tyr 464), consistente com a ativação da MLCK (Figura 4c). Tal ativação foi acompanhada pela diminuição da placa de escova apical e do F-actin perijuncional (Figura 4d), indicativo de reorganização do citoesqueleto de actina. Importante, a inibição da fosforilação MLCK induzida por ligadura ICAM-1 em células T84 com ML-7 (20 μM,33 Figura S4C Suplementar) impediu a reorganização induzida por F-actina ICAM-1 (Figura 4d), a diminuição do TER (Figura 4a), e o aumento do fluxo paracelular dextran (Figura 4b). O tratamento ML-7 (20 μM) por si só não teve efeito sobre o TER. Juntos, esses dados sugerem que sob condições inflamatórias, o contato do PMN com a superfície apical das células epiteliais da cripta desencadeia eventos de sinalização dependentes do ICAM-1, resultando em aumento da permeabilidade.
O manejo do ICAM-1 na membrana epitelial apical facilita o aumento do TEM PMN TEM
Como a ligação do ICAM-1 expresso apicalmente aumenta a permeabilidade epitelial, nós fizemos experimentos para examinar se alterações dependentes do ICAM-1 na função da barreira epitelial resultariam no aumento do TEM PMN. Primeiro investigamos se o envolvimento de PMN do ICAM-1 na membrana IEC apical afetou o TEM de PMN na direção fisiologicamente relevante do basolateral ao epitelial.34 Nesses experimentos, o PMN foi estimulado a migrar através de monocamadas epiteliais e as células transmigradas foram coletadas e reaplicadas por 1 h na superfície apical de novas monocamadas epiteliais (2,5 × 105 PMN por monocamada) com ou sem pré-tratamento IFNγ. Após 1 h de contacto PMN-epitelial, as monocamadas foram lavadas sem PMN aderente e utilizadas para ensaios posteriores de TEM de PMN na direcção basolateral-apical. A introdução apical do PMN em IFNγ, mas não em monocamadas epiteliais não tratadas, desencadeou um aumento significativo do TEM PMN (1,7 vezes, Figura 5a). O tratamento IFNγ sozinho ou a presença de PMN perto da superfície apical, mas sem contato direto com os monocamadas, não teve efeito sobre o TEM PMN (Figura 5a). Em experimentos paralelos, o PMN TEM foi examinado seguindo uma ligação cruzada específica Ab-mediated do ICAM-1. Consistente com o efeito do ICAM-1 de reticulação na função de barreira IEC, a reticulação Ab-mediated do ICAM-1 em IFNγ – o T84 IECs tratado aumentou significativamente o PMN TEM (1,9±dobro, Figura 5b) comparado com a reticulação de uma molécula de controle apicalmente expressa, MHC-1. Como esperado, a aplicação dos protocolos de reticulação ICAM-1 em monocamadas IEC não tratadas não teve efeito significativo no PMN TEM. Juntos, esses achados sugerem que o PMN aderente à membrana IEC apical (luminal) através do engajamento do ICAM-1 pode desencadear alterações na função da barreira epitelial e contribuir para a regulação do recrutamento de PMN.
Gestão da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) apicalmente expressa induz o aumento dependente da cadeia de luz da miosina cinase (MLCK) na migração transepitélica de neutrófilos (PMN). O TEM de PMN na direção basolateral para a direita através do não tratado (controle) ou interferon-γ (IFNγ)-tratado (para induzir a expressão ICAM-1) As monocamadas T84 foram induzidas por um gradiente de N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). (a) Os PMN transmigrados foram coletados e introduzidos no lado apical de novas monocamadas T84 na presença de fMLF (100 nM), ou adicionados a câmaras inferiores de transwells, de frente para a membrana apical, mas sem contato direto com as monocamadas (2,5 × 105 PMN por poço, 1 h). Após a lavagem do PMN apicalmente aderido, foi quantificado o TEM subsequente do PMN. As interações apicais do PMN especificamente com as células epiteliais intestinais T84 (IECs) tratadas com IFNγ aumentaram significativamente o TEM PMN. Este efeito foi revertido na presença do anticorpo inibitório anti-Mac-1 (Ab; 20 μg ml-1). Para todas as condições, o número de PMN que permaneceu aderente à membrana epitelial apical após lavagens foi determinado e subtraído do número total de PMN transmigrado. (b) Foi quantificado o PMN TEM após a ligação cruzada Ab-mediated do ICAM-1 ou proteína de controle (major histocompatibility complex-1 (MHC-1)). A ligação cruzada do ICAM-1 mas não do MHC-1 em IFNγ – células T84 tratadas com PMN TEM aumentaram significativamente o PMN. (c) As monocamadas de controle e T84 tratadas com IFNγ foram pré-incubadas com ML-7 (inibidor MLCK, 20 μM) ou Blebbistatin (inibidor de miosina motor II, 10 μm) sozinhas ou seguidas pelo crosslinking ICAM-1. Os efeitos destes inibidores sobre o ICAM-1 induziu aumentos no TEM PMN foram quantificados. Ambos inibidores impediram os aumentos induzidos pelo ICAM-1 no TEM de PMN. Para todos os painéis, os dados apresentados como aumento dobrado acima do PMN TEM através dos T84 IECs não estimulados. N=4 experimentos independentes em triplicatas, *P<0,05, **P<0,01, n.s. não significativos, análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls.
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ICAM-1 crosslinking resultou na ativação do MLCK, sugerindo contração de actina-miosina (Figura 4). Assim, examinamos em seguida os efeitos da inibição da MLCK e inibição das forças contráteis de F-actin em TEM de PMN seguindo o crosslinking ICAM-1. O aumento do PMN TEM induzido pelo ICAM-1 crosslinking foi revertido quando as IECs foram pré-tratadas com o inibidor MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33) ou com o inibidor de miosina motor II, Blebbistatin (10 μM, 1 h,35 Figura 5c). Estes achados sugerem um papel da contração da actomiosina a jusante do ICAM-1 na regulação do TEM PMN. O tratamento com ML-7 ou Blebbistatin sozinho não teve efeito no TEM PMN (Figura 5c).
Ab-mediated ligation of ICAM-1 in murine intestinal lumen leads to MLCK-dependent increase in epithelial permeability and enhanced PMN recruitment
We next performed in-vivo experiments to examine the effect of ICAM-1 ligation on intestinal epithelial barrier function and PMN recruitment, using a mouse intestinal loop model (Figure 6b). Neste modelo, a permeabilidade de segmentos intactos, permeáveis ao sangue, do intestino delgado foi avaliada após a introdução de FITC-dextran na luz intestinal. Como mostrado na Figura 6a, embora o ICAM-1 não tenha sido detectado em epitélio não estimulado (painel superior), a administração intraperitoneal (i.p.) do IFNγ e TNFα (500 ng, 24 h) resultou em uma indução robusta da expressão do ICAM-1. Em particular, induziu ICAM-1 localizado a regiões apicais de cripta murina IECs acima de Claudin-2 (Figura 6a, painel inferior). Em paralelo, observamos que o tratamento com citocinas resultou no aumento da permeabilidade do FITC-dextran de 3kDa em ∼2 (Figura 6c).
Gestão da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) no intestino murino in vivo leva ao aumento da permeabilidade intestinal dependente da miosina quinase da cadeia de luz (MLCK). Para induzir a expressão ICAM-1, ratos foram injetados com uma mistura de interferon-γ (IFNγ) e fator de necrose tumoral-α (TNFα; 500 ng cada, 24 h, intraperitonealmente (p.i.)). (a) Segmentos congelados de intestino de camundongo foram seccionados (7 μm wide) e imunofluorescentemente corados para ICAM-1 (verde) e a proteína de junção apertada Claudin-2 (vermelha). Imagens confocais representativas mostram indução apical da expressão ICAM-1 (seta branca) após tratamento com IFNγ/IFNγ (painel inferior) comparado com tecido não ativado (painel superior). Barra = 50 μm. (b) O desenho animado retrata o modelo de laço intestinal do rato, conforme descrito em Métodos. (c) A permeabilidade epitelial intestinal in-vivo foi medida sob as condições especificadas, conforme descrito em Métodos. O peptídeo caudal ICAM-1 (100 μm ml-1) foi introduzido luminalmente 30 min antes dos protocolos de reticulação ICAM-1. O inibidor MLCK ML-7 (20 μM) foi introduzido por injeção i.p. 2,5 h antes do ICAM-1 de reticulação. O aumento do fluxo de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran após a reticulação de anticorpos (Ab) do ICAM-1 foi prevenido com a adição de peptídeo caudal ICAM-1 e pré-tratamento com ML-7. N=4 ratos por condição, *P<0,05, análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls.
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Importante, introdução de Abs reticulados ICAM, mas não Abs para a proteína de controle, MHC-1 no lúmen das alças intestinais estimuladas por citocinas induziu um aumento adicional de ∼1.5 vezes na permeabilidade ao dextrano quando comparado apenas com o tratamento com citocinas (Figura 6c). Para confirmar que os aumentos na permeabilidade epitelial intestinal foram mediados especificamente por eventos de sinalização epitelial induzidos pelo ICAM-1, usamos peptídeos derivados do domínio citoplasmático do ICAM-1 (peptídeo ICAM-1) para inibir a capacidade do ICAM-1 de mediar eventos de sinalização downstream. Foi previamente demonstrado no endotélio vascular que o ICAM-1, mas não o peptídeo controle, inibiu as interações entre o ICAM-1 e as proteínas-alvo, impedindo assim a sinalização dependente do ICAM-1 sem afetar a ligação aos ligandos leucócitos extracelulares.22, 24 Adição do ICAM-1, mas não o peptídeo controle (100 μg ml-1, 30 min), inibiu o aumento da permeabilidade intestinal induzida pela ligadura do ICAM-1 (Figura 6c). Abs introduzidos intraluminalmente nas alças intestinais (sem estimulação e após ativação em IFNγ/IFNγ) foram confirmados para não cruzar o epitélio, descartando assim a potencial contribuição indireta das células da lâmina própria para os efeitos observados (Figura Suplementar S6).
Em suporte adicional do papel da MLCK na sinalização mediada pelo ICAM-1, inibição da ativação da MLCK usando ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) antes da reticulação ICAM-1 impediu o aumento da permeabilidade (Figura 6c). Estes dados demonstram que o aumento da permeabilidade epitelial intestinal in vivo após a ligadura do ICAM-1 é dependente da MLCK.
Como o aumento da permeabilidade epitelial está associado com o aumento da migração do PMN, nós perguntamos se a ligadura do ICAM-1 levaria ao aumento do recrutamento de PMN in vivo. Usando o modelo de laço intestinal murino, a infiltração de PMN na mucosa intestinal e a migração para a luz foi induzida pela administração luminal do quimiotractor CXCL1 (1 μM em 200 μl Solução salina balanceada de Hank (HBSS)+) e quantificada pela marcação de imunofluorescência/microscopia confocal e análise do fluido lavado preparado em citospinas, e corado com Diff-Quik, respectivamente. Na ausência de quimiotracto, os PMNs não foram detectados no epitélio intestinal ou na luz intestinal (não mostrado); contudo, a administração luminal de CXCL1 desencadeou migração significativa de PMN para a camada epitelial (Figura 7a) e acúmulo na luz intestinal (Figura 7c). Consistente com o aumento da permeabilidade induzida pela citocinose, o tratamento com IFNγ/IFNγ aumentou em ∼2,2 vezes o número de PMN no epitélio intestinal, e ∼1,7 vezes na luz. Importante, a adição de Abs reticulado ICAM-1 no lúmen de loops intestinais tratados com citocina aumentou ainda mais (apenas sobre o tratamento com citocinas) o número de PMN tanto no epitélio (∼1.6 vezes, Figura 7a,b) quanto no lúmen (∼1.4 vezes, Figura 7c,d). O PMN (verde) infiltrado no epitélio intestinal (vermelho) é mostrado em imagens representativas de cortes de tecido de loops intestinais ativados por citocinose após a ligadura ICAM-1 (Figura 7b). Da mesma forma, o PMN que migrou para a luz após a ligadura com ICAM-1 são mostrados em imagens representativas dos fluidos de lavagem das alças intestinais (Figura 7d).
Gestão da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) no intestino murino in vivo leva ao aumento dependente da miosina cinase da cadeia de luz (MLCK) no recrutamento de neutrófilos (PMN). A migração transepitélica de PMN (TEM) no modelo de laço intestinal murino foi induzida pela introdução luminal de CXCL1 (1 μM em 200 μl Solução salina balanceada de Hank (HBSS)+). (a) O PMN no epitélio da mucosa foi quantificado a partir de criosseções da alça intestinal, com a marcação imunofluorescente para PMN (verde) e F-actin (vermelho). (b) Imagens representativas mostram infiltração robusta de PMN após o ICAM-1 (painel direito) comparado com tecido intestinal sem introdução de CXCL1, onde os PMN estão localizados dentro dos vasos sanguíneos (seta branca). Barra = 50 μm. (c) Os PMN que migraram para o lúmen foram isolados por lavagem e quantificados a partir de citospins corados com Diff-Quik. Dados apresentados como percentagem de todas as células do fluido de lavagem. (d) Imagens representativas das citospinas retratam o PMN transmigrado na luz do lavado intestinal após o ICAM-1 reticulado (painel direito, PMN são indicados por setas brancas). Os PMN não são detectados na luz intestinal sem a introdução do quimiotractor (painel esquerdo). Barra = 10 μm. N=4 ratos por condição, *P<0,05, análise de variância com o teste de comparação múltipla Newman-Keuls.
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Consistente com o aumento da permeabilidade epitelial induzido pela ligadura ICAM-1, a migração do PMN para a luz intestinal melhorada dependia dos eventos de sinalização mediados pelo ICAM-1 e da ativação do MLCK. Ambos adição intraluminal do peptídeo ICAM-1, mas não do peptídeo controle (não mostrado; 100 μg ml-1, 30 min), e inibição da MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) antes da ligação cruzada do ICAM-1 induzida por Ab-mediated ICAM-1, inibiu completamente os aumentos na migração do PMN (Figura 7a,c). Estas descobertas sugerem que o envolvimento do ICAM-1 na membrana epitelial do intestino apical sob condições de inflamação compromete a função de barreira, facilitando assim o aumento do recrutamento de PMN in vivo.