Produção de Albumina Humana em Suínos através do CRISPR/Cas9-Batem mediado de cDNA humano no Locus de Albumina Suína nos Zigotos
A albumina sérica humana (HSA) é a proteína plasmática mais abundante que desempenha funções homeostáticas críticas na fisiologia humana, incluindo a manutenção da pressão oncótica plasmática, distribuição de fluidos corporais reguladores, transporte de pequenas moléculas, etc1. É prescrito para uma série de doenças graves, tais como insuficiência hepática e choque traumático2. Devido à escassez de sangue humano e aos riscos associados ao sangue humano, a produção alternativa de albumina humana tem sido procurada há muito tempo. A produção de HSA recombinante foi tentada anteriormente em suínos através da expressão transgênica dominante na forma de fusão Albumina-GFP3. Entretanto, nas abordagens transgênicas, devido à presença de albumina suína endógena, a separação e purificação da rHSA são problemáticas. Aproveitando o poder do sistema CRISPR/Cas9 na modificação do genoma, procuramos produzir rHSA em suínos através da batida da albumina humana cDNA no locus da albumina suína. Ao inserir o cDNA ALB humano mais a sequência de sinal SV40 polyA (2368 bp total) no locus da albumina de porco imediatamente abaixo do códon inicial, esperamos que a ALB humana seja expressa sob controle transcripcional da albumina endógena de porco e ao mesmo tempo bloquear a expressão da albumina endógena de porco (Fig. 1a). Projetamos um sgRNA visando a região do códon inicial (imediatamente 5′ de e incluindo ATG) e geramos um fragmento alvo (doador para recombinação homóloga) com o inserto flanqueado por seqüências homológicas de 1 kb em ambos os lados (Fig. 1a). Como a sequência homológica 5′ utilizada no doador vai até o códon inicial, ela contém a sequência sgRNA e, portanto, pode ser alvo pelo sgRNA como doador ou pelo alelo knockin após a recombinação homóloga. Para evitar que isso aconteça, inserimos 6 bp (gccacc) na sequência de sgRNA imediatamente antes do códão inicial. O sgRNA foi transcrito in vitro, purificado e injetado nos oócitos fertilizados juntamente com o Cas9 mRNA4 e o vetor circular contendo o fragmento alvo. A fonte dos oócitos foi Bama minipig5. Os embriões injetados foram cultivados durante 1-2 horas antes de serem implantados em fêmeas sincronizadas com o cio. ~300 embriões foram implantados em 10 fêmeas, das quais 5 engravidaram e deram à luz um total de 16 filhotes vivos. Os filhotes estavam sob cuidados padrão e não apresentaram sinais de problemas de saúde incomuns.
>Knockin de ALB humano em locus de Alb suíno.
(a) Diagrama da estratégia de knockin. (b) Genotipagem dos fundadores. Os primers PRC são ilustrados em (a). (c) Sequenciação dos resultados dos produtos PCR obtidos com o par de primers e/f (a). Os produtos foram clonados e até 12 clones (para #9) foram sequenciados.
Recortamos as pontas dos 16 leitões com cerca de 4 semanas de idade e obtemos DNA genômico para genotipagem. Para determinar se tínhamos tido sucesso em knockin, avaliamos tanto 5′ como 3′ fins do site de inserção. Utilizámos dois pares de primer, a/b e c/d (Fig. 1a). A cartilha a está fora do final da homologia 5′ utilizada e b está na ALB humana (a inserção); c está na ALB humana e d está fora do final da homologia 3′. Como mostrado na Fig. 1b, todos os 16 leitões carregam a alela de batida pretendida. Nós clonamos e sequenciamos todos os fragmentos de DNA amplificados. Eles foram os produtos homólogos recombinadores esperados (Fig. S1). Em seguida, determinamos o estado do alelo do tipo selvagem nestes leitões. Os primers e e e f (contidos na inserção) (Fig. 1a) devem amplificar um fragmento de 705 bp do locus wildtype e um fragmento de 3085 bp do alelo knockin. Como esperado, todos eles geraram o fragmento de 3085 bp. No entanto, inesperadamente, podemos obter o aparente fragmento de 705 bp wildtype a partir de apenas 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 e 15) das 16 amostras, com o restante gerando produtos fracos em torno de 700 bp (Fig. 1b). A aparente falta de alelo do tipo selvagem em alguns leitões sugere que pode ter acontecido knockin em ambos os alelos. Alternativamente, o alelo wildtype poderia ter sido editado de tal forma que o primer uma sequência foi apagada, resultando na falha em amplificar o alelo wildtype. De fato, a edição no alelo wildtype aconteceu porque o tamanho dos fragmentos amplificados diferiu dos 705 bp previstos em alguns leitões (Fig. 1b). Para confirmar isso, nós clonamos e sequenciamos todos os fragmentos amplificados. Como mostrado na Fig. 1c, todos eles foram editados, embora alguns tenham sido apenas algumas mudanças de par de base (daí parecerem estar a 705 bp). Entre estes alelos editados, aqueles encontrados no leitão #10 e #12 são de interesse. O de #10 foi o produto da substituição de um trecho de 29 pb (do ATG para o final de 3′) da sequência de leitões por 36 pb (6 pb 5′ do ATG e 26 pb depois) da sequência de dadores. Não está claro como isto aconteceu. No número 12, há dois alelos editados diferentes, o que coloca o número total de alelos em 3, indicando mosaicismo neste leitão, o que não é incomum, pois o mosaicismo foi frequentemente encontrado em animais gerados através da injeção de zigoto de Cas9/sgRNA6,7,8,9,10.
Para determinar se o sgRNA fora do alvo tinha ocorrido com o sgRNA, escolhemos 4 locais com potencial para fora do alvo com base nas sugestões da ferramenta de design CRISPR (http://tools.genome-engineering.org) e fragmentos amplificados contendo estes locais a partir do DNA genômico da ponta da orelha do leitão #14. Os fragmentos foram submetidos ao ensaio T4EN I4. Como mostrado na Fig. S2, nenhuma edição fora do alvo foi encontrada. Entretanto, não foi possível eliminar a possibilidade de que a edição fora do alvo tenha ocorrido em outros loci ou nos outros 15 porcos transgênicos. No entanto, mesmo havendo edição fora do alvo, os loci editados dificilmente serão problemáticos para o nosso propósito de produzir rHSA, desde que não interfiram no bem-estar destes porcos transgênicos.
Having demonstrou sucesso no knockin da ALB humana, procuramos determinar se a albumina humana poderia ser detectada no plasma sanguíneo destes leitões knockin. Como mostrado na Fig. 2a, todos os leitões continham albumina humana em seu plasma sanguíneo detectável com os anticorpos específicos contra a albumina humana, embora em níveis variáveis, o que provavelmente é resultado de pelo menos dois fatores, se ambos os alelos são knockin e a extensão do mosaicismo (especialmente no fígado). O nível em #7 é muito baixo apenas visível após longa exposição da mancha, apesar da aparente falta de alelos de Alb de porco do tipo selvagem (Fig. 1a). Em geral, os níveis são muito mais baixos do que os dos soros humanos adultos. Sabe-se que a concentração de albumina sanguínea em suínos aumenta com a idade, atingindo um nível semelhante ao de humanos adultos por 6 meses de idade11.
Análise da ALB humana no sangue.
(a) Detecção ocidental de albumina humana no sangue de leitões fundadores. 0,5 μl plasma de cada fundador foi separado na SDS-PAGE e analisado. O plasma sanguíneo humano (0,5 μl após diluído 30 vezes) foi usado como controle positivo. C, plasma de um porco do tipo selvagem. (b) Ilustração dos peptídeos tripépticos (verdes) detectados com análise de espectros de massa. (c) Semi-quantitação de dois peptídeos tripéticos de albumina humana e de porco através da medição das áreas de pico de cada peptídeo. O vermelho marca os resíduos de aminoácidos específicos do porco.
Para confirmar que a rHSA detectada no plasma dos nossos leitões knockin com anticorpos é realmente albumina humana, submetemos duas amostras de plasma (leitão #2 e #6) à análise espectral de massa. O #2 é aparentemente homozigotos para o alelo knockin e o #6 contém um alelo knockin e um alelo mutante (framehift) (Fig. 1). 0.5 μl O plasma foi separado em SDS-PAGE e proteínas em torno de 70 KD foram digeridas in-gel com tripsina. Os peptídeos tripticos foram eluídos do gel, secos e re-dissolvidos para separação por cromatografia líquida e análise de espectros de massa. Para o leitão #2, pudemos detectar 14 peptídeos triptídeos ALB humanos únicos e 15 para o #6 (Fig. 2b). Os espectros M/Z para o peptídeo humano FKDLGEENFK e peptídeo de porco FKDLGEQYFK (ambos do leitão #2) foram mostrados na Fig. S3. Dois peptídeos foram escolhidos para quantificação através da medição das áreas dos picos. De acordo com os resultados do western blot, estes dois peptídeos foram muito mais (~5 vezes) abundantes em #2 do que em #6 (Fig. 2c). Estes resultados demonstram que a rHSA detectada pelos anticorpos é autêntica albumina humana.
A genotipagem do DNA isolado das pontas dos ouvidos indica que ambos #2 e #6 não contêm alelo de Alb de porco do tipo selvagem, ou não estão presentes ou editados (Fig. 1b,c). Entretanto, ainda podemos detectar peptídeos tripéticos da albumina de porco em ambas as amostras, mas em muito menor abundância (Fig. 2c). Curiosamente, a abundância de peptídeos de porco foi praticamente a mesma entre as duas amostras, apesar de a abundância de peptídeos humanos ter sido muito diferente. Estes resultados sugerem que ambos os leitões contêm um número semelhante de hepatócitos de tipo selvagem (ou heterozigotos) que são responsáveis pela ALB do porco detectada no sangue destes dois leitões. No entanto, tais células contendo alelos selvagens podem não existir ou existir numa percentagem extremamente baixa nas pontas das orelhas para que o alelo do tipo selvagem não possa ser amplificado por PCR. Além disso, a análise Southern blot analysis com uma sonda interna (3′ metade do CDS da ALB humana) indicou a presença de uma inserção adicional da sequência de dadores nos leitões #1, 4 e 5 (Fig. S4). Todas estas complicações não serão um problema para o propósito de produzir albumina humana recombinante, pois o alelo knockin pode ser purificado através de retrocruzamento.
Para determinar se o alelo knockin pode ser transmitido para a próxima geração, cruzamos #2 (macho, homozigoto) com #5 (fêmea, heterozigoto) quando eles se tornaram reprodutivamente maduros. 6 filhotes nasceram da cruz. 4 deles (#1, 3, 4 e 6) são homozigotos para o alelo knockin (AlbH/H, H denota humano) e 2 (#2 e 5) heterozigotos (AlbP/H, P denota porco) (Fig. 3a). Os #5 e 6 morreram de diarréia cerca de 2 semanas após o nascimento. Analisamos a expressão da albumina humana no sangue dos leitões restantes com 4 semanas de idade. Como mostrado na Fig. 3b, todos eles têm albumina humana no sangue. Curiosamente, o nível de albumina humana no animal heterozigoto (#2) era muito mais baixo do que o dos homozigotos. Não sabemos se isto é resultado de variação individual ou se o alelo knockin é de alguma forma suprimido pelo alelo wildtype.
Transmissão germinal do alelo knockin.
(a) Genotipagem PCR da descendência F1. Os primers utilizados foram os mesmos da Fig. 1. (b) Detecção ocidental de albumina humana no sangue dos leitões F1. 0,5 μl plasma de cada leitão foi separado na SDS-PAGE e analisado. C, plasma de um porco do tipo selvagem. M, marcador de peso molecular.
Mostramos aqui a geração bem sucedida de porcos portadores de ALB cDNA humano, que foi batida no locus de Alb porco. Isto é um passo além da simples edição de genes em zigotos de porco relatada recentemente por Hai et al.12 e nós13. Grandes animais domesticados têm sido perseguidos como bioreatores para produtos protéicos biomédicos14,15,16,17,18,19,20. Normalmente, as seqüências de codificação dessas proteínas foram inseridas aleatoriamente junto com os elementos de controle de transcrição necessários no genoma como transgêneros, o que está associado a muitas complicações, incluindo a natureza de curto prazo da expressão transgênica. Nossa demonstração de que a recombinação homóloga pode ocorrer de forma altamente eficiente em zigotos de suínos abre a porta para o desenvolvimento de bioreatores cada vez melhores, bem como de linhagens animais com cada vez mais características desejáveis.