E-cadherina se leagă de desmogleină pentru a facilita asamblarea desmosomului
1) Această lucrare abordează mecanismul de reglare a asamblării desmosomului mediat de cadherină. Deși recenzenții sunt de acord că lucrarea este potențial interesantă, ei au ridicat mai multe probleme semnificative. În primul rând, toți sunt de acord că modelul trebuie să fie testat prin examinarea colocalizării în celulele care exprimă mutantul cadherinei.
Le mulțumim recenzenților pentru că au sugerat aceste experimente importante. Așa cum am descris în răspunsul nostru detaliat către recenzenți, am testat acum rolul diferitelor mutații Ecad în împiedicarea recrutării Dsg2 în keratinocite. Am exprimat Ecad WT de lungime completă și mutanții Ecad (L175D, K14E și W2A-K14E) în keratinocite de șoarece Ecad-knockout, Pcad-knockdown (EKO/PKD) și am analizat recrutarea Dsg2 la locurile de contact intercelular. Aceste rezultate confirmă faptul că aminoacidul L175 de pe Ecad, mediază interacțiunile Dsg2 și facilitează formarea timpurie a complexelor desmosome în celule. Experimentele noastre relevă, de asemenea, că asamblarea desmosomului este inițiată în locurile de homodimerizare trans Ecad.
2) Există, de asemenea, îngrijorări cu privire la fiabilitatea datelor de colocalizare din figura 5; este necesară o analiză mai riguroasă pentru a demonstra că colocalizarea E-cadherinei și a desmoplakinului are loc mult mai mult decât s-ar aștepta din întâmplare.
În teren, desmosomii sunt identificați după dimensiunea și aspectul de șină de cale ferată al colorației DP în imaginile SIM. Așa cum am subliniat în răspunsul nostru către recenzenți, am folosit această abordare stabilită pentru a localiza desmosomii. În plus, subliniem acum că nu măsurăm colocalizarea, ci mai degrabă recrutarea diferitelor cadherine (Ecad și Dsg) în regiuni ale membranei care prezintă acest model.
3) În al doilea rând, modelarea presupune că L175 face parte din interfață, dar fără evaluarea stoichiometriei nu se poate exclude faptul că pierderea legăturii este un efect indirect al pierderii dimerizării cis. De asemenea, modelarea este considerată slabă, deoarece nu au fost testate interfețe complementare pe Dsg2. Fără astfel de date, modelarea moleculară trebuie să fie considerată extrem de speculativă.
Așa cum am descris în răspunsul nostru detaliat către recenzenți, simulările computaționale anterioare și experimentele biofizice arată că formarea cis-dimerului Ecad necesită o dimerizare trans prealabilă. În consecință, Ecads nu se pot lega la suprafață ca cis-dimeri autonomi, formați în prealabil. Acest lucru face extrem de improbabil ca interacțiunile de legare măsurate să aibă loc între cis-dimerii Ecad și Dsg2. Cu toate acestea, suntem de acord cu recenzenții că rezultatele dozării moleculare sunt destul de slabe. Prin urmare, am eliminat aceste rezultate de modelare din manuscris.
4) În cele din urmă, așa cum a remarcat recenzentul 3, chiar dacă sunt susținute de aceste adăugiri, modelul și secțiunea Discuții nu explică cu adevărat modul în care E-cadherina reglează desmosomii.
Bazându-ne pe noile noastre date de structură-funcție celulară, propunem acum un model prin care asamblarea desmosomului este facilitată atât de interacțiunile directe cis ale Ecad și Dsg2, cât și de legarea trans a Ecad-ului opus. În modelul nostru, homodimerizarea trans a Ecad din celulele opuse servește ca un indiciu spațial pentru a coordona asamblarea desmosomului. Ulterior, Ecad formează complexe cis-dimer cu Dsg2 pentru a iniția asamblarea desmosomului. Modelul este prezentat și discutat în noul manuscris.
Revizorul #1:
1) Experimentele AFM cu o singură moleculă sunt cea mai solidă parte a lucrării. Cu toate acestea, în lectura mea, autorii nu exclud posibilitatea ca evenimentele de legare pe care le observă să se datoreze unor interacțiuni între cis-dimerii pre-formați ai E-cadherinei. Este important de stabilit stoichiometria interacțiunii, deoarece dacă legarea la Dsg2 a implicat necesitatea unui cis-dimer de E-cadherină, aceasta ar schimba interpretarea rezultatului conform căruia mutația L175D blochează interacțiunea Dsg2/E-cad. Un astfel de scenariu ar contesta, de asemenea, validitatea simulărilor de andocare. După părerea mea, probabilitatea scăzută de legare per contact al vârfului AFM cu suprafața este o dovadă slabă că legarea reflectă în mod necesar interacțiunea a doi monomeri și nici densitatea medie scăzută a moleculelor de cadherină pe suprafață. Mai mult, cadherinele sunt imobilizate cu streptavidină, care are mai multe situsuri de legare a biotinei.
Din aceste motive, cred că dovedirea faptului că heterodimerizarea are loc între monomeri este importantă. Pentru a face acest lucru, aș recomanda măsurarea sistematică a probabilității de interacțiune a vârfului cu suprafața în funcție de densitatea superficială areală a E-cadherinei pe suprafața capacului. În cazul în care interacțiunea necesită într-adevăr E-cadherină monomerică, această măsurătoare ar trebui să scadă liniar cu E-cadherina adăugată, cel puțin la densități scăzute. Cu toate acestea, această măsurătoare specifică nu este necesară – orice măsurătoare care stabilește stoichiometria va fi suficientă.
Simulări computerizate anterioare (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) au arătat că homodimerizarea cis a Ecad necesită formarea prealabilă a trans-dimerului Ecad. În mod similar, măsurătorile FRET anterioare cu o singură moleculă au arătat că nu este posibilă formarea de monomeri cis Ecad de sine stătători, chiar și atunci când monomerii Ecad sunt plasați în imediata apropiere într-o orientare cis (Zhang et al., 2009). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că, în experimentele noastre, Ecad-urile nu pot fi imobilizate pe vârful AFM sau pe substrat sub formă de cis-dimeri preformați. În consecință, eșecul mutantului Ecad-L175D de a interacționa cu Dsg2 nu se datorează absenței dimerizării cis a Ecad. Discutăm acum acest lucru în subsecțiunea „Leu 175 mediază interacțiunile Ecad și Dsg2” a manuscrisului.
Din păcate, limitările tehnice nu permit experimentul de stoichiometrie a proteinei pe care îl sugerează recenzentul. În experimentele noastre, folosim densități de suprafață a proteinelor care ne permit să identificăm fără ambiguitate evenimente de legare unice din întinderea corespunzătoare a legăturilor PEG. În cazul în care densitatea suprafeței cadherinei este mărită, așa cum a propus autorul recenziei, probabilitatea de apariție simultană a mai multor evenimente de legare Ecad crește, ceea ce face ca o analiză cantitativă a probabilității de legare a proteinelor să nu fie fiabilă. Din acest motiv (împreună cu slăbiciunea intrinsecă a analizei noastre de andocare), am exclus simulările de andocare a proteinelor din manuscris.
În cele din urmă, în manuscrisul revizuit, folosim acum analiza cluster pentru a grupa evenimentele de dezlegare a unei singure molecule pentru Spectroscopia de forță dinamică (DFS). Am arătat recent că algoritmul de clusterizare K-means pe care l-am utilizat, îmbunătățește foarte mult estimarea parametrilor cinetici în DFS (Yen și Sivasankar, 2018). În consecință, duratele de viață pe care le raportăm acum pentru interacțiunile Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 și Dsc2/Dsc2 sunt mai fiabile.
2) Simulările de andocare sunt interesante, dar, în opinia mea, oferă dovezi slabe pentru geometria de legare specifică pe care o propun autorii. Aș recomanda cu tărie ca autorii să fie mai prudenți în interpretarea și prezentarea acestor rezultate sau, alternativ, să prezinte date suplimentare, de exemplu imagini EM, care să susțină sau să infirme rezultatul computațional.
Suntem de acord cu recenzentul că datele de andocare a proteinelor sunt slabe. Prin urmare, am eliminat aceste rezultate din manuscris.
3) Din nefericire, imaginile SIM nu sunt convingătoare așa cum sunt prezentate în prezent. În special, nu este clar ce contează ca fiind un „desmosom” în analiza autorilor (Figura 5B). Ar fi necesară o tratare mai sofisticată a colocalizării pentru a stabili faptul că E-cadherina și desmoplakinul colocalizează și că această colocalizare scade pe măsură ce joncțiunile se maturizează.
În studiile anterioare (Stahley et al., 2016a, 2016b) am utilizat aspectul de „cale ferată” al DP, așa cum reiese din imagistica de super-rezoluție, pentru a defini desmosomii prin imunofluorescență (așa cum este descris în Figura 3A). Alții din domeniu au folosit, de asemenea, morfologia „șinei de cale ferată” pentru a identifica desmosomii în imaginile SIM (a se vedea, de exemplu, SIM: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). Dimensiunea și organizarea acestor structuri, așa cum sunt dezvăluite de SIM, sunt pe deplin în concordanță cu definițiile EM clasice ale desmosomilor. Am măsurat intensitatea pixelilor pentru cele două cadherine (Ecad sau Dsg2) din cadrul acestor structuri folosind analiza standard a imaginii. Este important de menționat că nu încercăm să afirmăm o colocalizare. Mai degrabă, măsurăm recrutarea cadherinei la domeniile membranare care prezintă modele de colorare a căii ferate DP. Apreciem că, uneori, este dificil să distingem urmele de șine de cale ferată în primele momente de timp. Din acest motiv, primul moment în care am considerat că am putut identifica o colorare bona fine a șinelor de cale ferată a fost la 1 oră. În plus, efectuăm măsurători numai în locurile în care putem observa modele de urme de cale ferată, mai degrabă decât puncte DP. În cele din urmă, constatarea noastră că Ecad este prezentă în desmosomii născuți este în concordanță cu experimentele imuno-EM clasice care arată că Ecad se poate localiza în desmosomi (Jones, 1988). Prin urmare, ne simțim încrezători în capacitatea noastră de a identifica desmosomii și de a măsura nivelurile relative ale celor două cadherine în momente diferite.
4) Las acest ultim punct la discreția editorului. Din punctul meu de vedere, datele de colocalizare, chiar dacă sunt luate ca fiind adevărate, nu stabilesc relevanța funcțională. Ar fi foarte bine să vedem un experiment de knockdown/reconstituire cu E-cadherina L175D. Predicția este că această moleculă nu ar colocaliza niciodată cu desmoplakina, indiferent de vârsta joncțiunii. Încălcarea acestei predicții ar pune la îndoială modelul favorit al autorilor.
Pe baza sugestiei recenzentului, am efectuat acum experimente pentru a testa direct rolul diferitelor mutații ale domeniului extracelular Ecad în împiedicarea recrutării DP și Dsg2 în keratinocite. Aceste date sunt descrise în subsecțiunea „Ecad L175 este esențială pentru o recrutare intercelulară eficientă a Dsg2 și pentru asamblarea desmosomului”. Imaginile corespunzătoare sunt prezentate în figura 5 și în figura 5-figură supliment 1. Metodele utilizate sunt descrise în subsecțiunea „Izolarea, cultivarea, transfecția și imagistica confocală a keratinocitelor primare”. Pentru aceste experimente, am utilizat keratinocite de șoarece EKO/PKD, care nu exprimă practic nicio cadherină clasică. Am demonstrat anterior că aceste keratinocite EKO/PKD nu sunt capabile să asambleze AJ-uri și desmosomi din cauza pierderii tuturor cadherinelor clasice (Michels et al., 2009). Astfel, aceste celule ne permit să evaluăm în mod direct capacitatea mutanților Ecad de a i) iniția formarea AJ și ii) de a evalua capacitatea lor de a recruta componente desmosomale la locurile de formare a contactului inițial celulă-celulă.
Din moment ce am fost interesați să evaluăm capacitatea mutanților Ecad de a recruta proteine desmosomale la începutul formării joncțiunii, am exprimat fie Ecad WT de lungime completă, fie mutanți în keratinocite EKO/PKD și am analizat recrutarea DP și Dsg2 la situsurile de contacte intercelulare cu ajutorul microscopiei confocale. Pentru a examina recrutarea în diferite stadii de formare și maturare a joncțiunii, keratinocitele au fost fixate și imunocolorate pentru DP, Dsg și Ecad la trei momente de timp după comutarea Ca2+ (3 ore, 6 ore și 18 ore).
Datele noastre au arătat că, la 3 ore după comutarea Ca2+, 93% din WT-Ecad a fost îmbogățit în AJ-uri timpurii de tip fermoar la locurile de contact intercelular. În schimb, doar 48% din keratinocitele transfectate cu L175D-Ecad au format AJ fermoare AJ, probabil din cauza formării deficitare a cis-dimerului Ecad (Figura 5 A, B). La aceste momente timpurii timpurii de după comutarea Ca2+, 66% și 91% din contactele zipper WT-Ecad au fost pozitive pentru Dsg2 și, respectiv, DP (Figura 5 A, C, D, E). Atunci când celulele au fost lăsate să se angajeze în adeziune intercelulară dependentă de Ca2+ timp de 18 ore, localizările joncționale ale Ecad-Dsg2 și Ecad-DP au crescut la 97% și, respectiv, 100% (Figura 5 A, C, D, E). În schimb, doar 39% din contactele cu fermoar induse de L175 au prezentat recrutarea Dsg2 la 3 ore după trecerea la Ca2+ ridicat, care a crescut la 65% la 18 ore (Figura 5 A, C), confirmând că este necesară o interacțiune directă între Ecad și Dsg2 pentru recrutarea eficientă a Dsg2 la contactele intercelulare timpurii. În mod similar, după 3 ore, doar 28% din contactele intercelulare stabilite de mutantul L175D-Ecad au fost pozitive pentru DP, care a crescut la 72% după 18 ore, sugerând un mecanism compensator în etapele ulterioare (Figura 5 D, E).
Pentru a confirma că efectul observat al mutației L175D nu s-a datorat împiedicării formării AJ, am transfectat keratinocitele EKO/PKD cu mutantul Ecad-K14E de lungime completă care abolește formarea X-dimerului și prinde Ecad într-o conformație de dimer de schimb de șiruri. Datele noastre au arătat că doar 4% din celulele de contact transfectate au format fermoare la momente timpurii (3 ore) după trecerea la Ca2+ ridicat, doar 24% din celulele de contact transfectate prezentând fermoare la momente târzii (18 ore) (Figura 5 A, B, Figura 5-figura supliment 1), confirmând că K14 este esențial pentru formarea eficientă a AJ și, astfel, pentru stabilirea contactului intercelular. Cu toate acestea, cele câteva AJ K14E care s-au format au recrutat Dsg2 și, în special, DP, mai eficient decât L175D (Figura 5 A, C, E, Figura 5-figura supliment 1). Acest rezultat a confirmat faptul că recrutarea întârziată a Dsg2 la contactele intercelulare nu a fost rezultatul incapacității Ecad L175D de a forma eficient AJ-uri, ci mai degrabă din cauza absenței interacțiunii directe dintre Ecad și Dsg2. Deoarece nu a existat niciodată o colocalizare a DP și Ecad în absența fermoarelor (Figura 5-figura supliment 1), datele sugerează, de asemenea, că interacțiunile trans Ecad preced interacțiunile Ecad/Dsg2. Această concluzie este întărită și mai mult de constatarea noastră că nu a fost observată nicio recrutare DP la abolirea adeziunii trans Ecad și, prin urmare, a fermoarelor, prin transfectarea Ecad-DM de lungime completă (mutant dublu W2A-K14E, Figura 5-figura supliment 1) în keratinocitele EKO/PKD. Luate împreună, aceste rezultate confirmă faptul că aminoacidul L175 mediază interacțiunile Dsg2 și facilitează formarea timpurie a complexului desmosomal în celule.
Revizorul nr. 2:
1) Constatarea că reziduul L175 al E-cadherinei este esențial pentru interacțiunea cu Dsg2 este intrigantă. Cu toate acestea, nu sunt identificate reziduuri partenere de interacțiune. În această circumstanță, prezicerea unei conformații pentru interacțiunea E-cadherină/Dsg2 prin docking pare precară; pare nesigur că conformația prezisă se referă la adevărata conformație legată.
Suntem de acord cu recenzentul că datele de andocare a proteinei sunt speculative și, prin urmare, am eliminat aceste rezultate din manuscris.
2) Există doar o legătură firavă între interacțiunea Dsg2/E-cadherin propusă și biologia asamblării desmosomului. Cu toate acestea, autorii par să aibă o cale clară de urmat. Aceștia susțin că prezența E-cadherinei în desmosomii născuți (evaluată experimental prin colorația pentru desmoplakin în figura 5) este o dovadă a rolului asociației Dsg2/E-cadherină pe care au identificat-o. Acum că au identificat un mutant care împiedică această asociere, experimentele din figura 5 efectuate cu acest mutant ar trebui să conducă la rezultate diferite. Acest experiment ar adăuga substanțial la rigoarea acestei lucrări.
Așa cum este descris în răspunsul 4 la recenzentul 1, am exprimat Ecad WT de lungime completă și mutanți Ecad în keratinocite EKO/PKD și am analizat recrutarea Dsg2 și DP la locurile de contact intercelular. Aceste rezultate confirmă faptul că aminoacidul L175 mediază interacțiunile Dsg2 și facilitează formarea timpurie a complexelor desmosome în celule. Aceste date sunt descrise în subsecțiunea „Ecad L175 este esențial pentru o recrutare intercelulară eficientă a Dsg2 și pentru asamblarea desmosomului” din manuscris. Imaginile corespunzătoare sunt prezentate în figura 5 și în figura 5-figura supliment 1. Metodele utilizate sunt descrise în subsecțiunea „Izolarea, cultivarea, transfecția și imagistica confocală a keratinocitelor primare”.
Revizorul #3:
1) Acest manuscris identifică și caracterizează o interacțiune moleculară între E-cadherină și Desmogleina 2 folosind proteine izolate și arată o colocalizare crescută între aceste două molecule în keratinocite la începutul asamblării desmosomului. Acestea sunt observații potențial foarte interesante care pot explica modul în care cadherinele clasice controlează asamblarea desmosomilor. Deși acest lucru este bine documentat de mai multe grupuri în literatura de specialitate, mecanismele care stau la bază sunt încă în mare parte necunoscute. Cu toate acestea, concluzia lor „Experimentele noastre integrate cu o singură moleculă, predicțiile de andocare proteină-proteină și imagistica de superrezoluție bazată pe celule arată că interacțiunile Ecad/Dsg2 joacă un rol important în asamblarea timpurie a desmosomului”, menționată la începutul secțiunii Discuții, este o exagerare destul de puternică, având în vedere că interacțiunea se bazează pe caracterizarea domeniilor extracelulare izolate și pe microscopia statică, deși de înaltă rezoluție. Nu se face niciun experiment pentru a demonstra că, atunci când se perturbă această interacțiune, asamblarea desmosomului este într-adevăr afectată, ceea ce, în opinia mea, ar fi minimul pentru a face acest set de date cu adevărat interesant și relevant pentru un public larg.
Așa cum am descris în răspunsul 4 la recenzentul 1, am exprimat acum Ecad WT de lungime completă și mutanți Ecad în keratinocite EKO/PKD și am arătat că aminoacidul L175 mediază interacțiunile Dsg2 și facilitează formarea timpurie a desmosomului în celule, evaluată prin recrutarea DP. Aceste date sunt descrise în subsecțiunea „Ecad L175 este esențial pentru o recrutare intercelulară eficientă a Dsg2 și pentru asamblarea desmosomului” din manuscris. Imaginile corespunzătoare sunt prezentate în figura 5 și în figura 5-figură supliment 1. Metodele utilizate sunt descrise în subsecțiunea „Izolarea, cultivarea, transfecția și imagistica confocală a keratinocitelor primare”.
2) De asemenea, având în vedere faptul că interacțiunea este independentă de calciu, în timp ce asamblarea timpurie a desmosomului dependentă de cadherină clasică necesită prezența calciului (care nu este discutată deloc).
Îi mulțumim recenzentului pentru acest comentariu perspicace. Așa cum este descris în subsecțiunea „Ecad L175 este esențial pentru recrutarea eficientă a Dsg2 intercelulară și asamblarea desmosomului”, imagistica confocală a Ecad mutant exprimat în keratinocite de șoarece dezvăluie acum că asamblarea desmosomului este inițiată la locurile de homodimerizare trans Ecad trans dependentă de Ca2+. Pe baza datelor noastre, propunem un model prin care asamblarea desmosomului este facilitată atât de interacțiunile directe cis ale Ecad și Dsg2, cât și de legarea trans a Ecad opuse. În modelul nostru, homodimerizarea trans a Ecad din celulele opuse servește ca un indiciu spațial pentru a coordona asamblarea desmosomului. Ulterior, Ecad formează complexe cis dimerice cu Dsg2. Odată localizat în desmosomul nativ, Dsg2 se disociază de Ecad și se leagă de Dsc2 pentru a forma desmosomi maturi. Deoarece complexul Dsc2/Dsg2 are o durată de viață mai lungă decât complexul Ecad/Dsg2 și complexul Dsc2/Dsc2, acest lucru permite probabil o aderență celulă-celulă robustă și permite desmosomului matur să reziste la forța mecanică. Acest model este descris în figura 6 și în secțiunea Discuții.
3) Deoarece aceasta este o interacțiune complet nouă, de afinitate scăzută, este probabil greu de realizat teste de interacțiune în contextul celulelor în care o celulă exprimă E-cadherină și cealaltă Dsg2 pentru a examina dacă există vreo interacțiune. Cu toate acestea, deoarece datele lor se bazează parțial pe modelare, autorii ar trebui, de asemenea, să genereze un mutant în care A125 și A124 sunt mutați pentru a oferi dovezi mult mai bune pentru existența propunerii de y-dimeri.
Din moment ce rezultatele docking-ului proteic nu sunt robuste, am eliminat acum aceste date din manuscris. Cu toate acestea, experimentele noastre cu keratinocite EKO/PKD care arată că mutația aminoacidului L175 de pe Ecad afectează recrutarea Dgs2 și în special a DP la locurile de formare timpurie a contactului, demonstrează că Ecad-L175 facilitează formarea desmosomului în celule, confirmă rezultatele noastre biofizice.
Rezumat:
Revizorii consideră că, deși datele biofizice sunt convingătoare, este nevoie de o analiză cantitativă mai riguroasă pentru a susține concluziile făcute din datele din figurile 3 și 5. În principiu, aceste preocupări pot fi abordate cu o analiză suplimentară a datelor, mai degrabă decât cu experimente și, în acest caz, am lua în considerare un manuscris revizuit.
Le mulțumim editorului pentru această recenzie încurajatoare. Așa cum este descris mai jos, manuscrisul nostru revizuit abordează toate problemele evidențiate.
1) Concluzia că interacțiunea E-cadherină-Dsg este necesară pentru formarea inițială a desmosomului se bazează pe colocalizarea Dsg și E-cadherinei care scade pe măsură ce joncțiunea se maturizează. Cu toate acestea, în figura 3 nu este clar dacă colocalizarea observată cu DP este semnificativă dincolo de cea așteptată din întâmplare sau provine din modificări dependente de timp în localizarea subcelulară a E-cadherinei care nu au legătură cu maturarea joncțiunii. În figura 3C, experimentele de control prezentate în panoul din dreapta evidențiază colocalizarea Dsg2 și DP – componente cunoscute ale Desmosomei – și arată o corespondență strânsă a semnalelor de fluorescență la toate cele trei momente de timp. În schimb, deși expresia E-cadherinei și a DP din panourile din stânga pare să se suprapună într-o oarecare măsură, acestea nu prezintă corespondența semnalelor observată pentru experimentele de control. Răspunsul la punctele inițiale de revizuire pe această temă (de exemplu, recenzentul 1, punctul 3) se concentrează pe definirea unui desmosom, dar nu abordează punctul de mai sus.
Am dori să clarificăm faptul că nu măsurăm colocalizarea, ci mai degrabă recrutarea fie a Ecad, fie a Dsg2 în regiuni ale membranei care prezintă un model de „cale ferată” DP. Pentru a face acest lucru mai clar, am modificat acum manuscrisul revizuit pentru a sublinia faptul că Ecad este „îmbogățit în desmosomii născuți”, mai degrabă decât să fie „exclus din desmosomii maturi”.
Pentru a răspunde în mod direct preocupărilor recenzenților cu privire la măsurarea noastră a îmbogățirii Ecad în desmosomi, arătăm acum că nivelurile relative ale Ecad de-a lungul întregii granițe celulare (raportul Ecad:DP la granițele celulare) rămân neschimbate în timp. Aceste date confirmă faptul că îmbogățirea Ecad în cadrul căilor ferate DP la primele momente de timp este specifică regiunilor desmosomale ale membranei și este semnificativă dincolo de ceea ce se așteaptă prin hazard sau din cauza schimbărilor în localizarea E-cadherinei care nu au legătură cu maturizarea joncțiunii. Datele sunt prezentate în Figura 3-figura supliment 1 și sunt descrise în subsecțiunea „Ecad este prezentă în desmosomii născuți, dar nu și în desmosomii maturi”.
În cele din urmă, deoarece scanările liniare prezentate în Figura 3 au fost derutante, am eliminat scanările liniare din manuscrisul revizuit. În schimb, în Figura 3B, prezentăm acum mai multe imagini reprezentative ale regiunilor desmosomale din keratinocitele umane cultivate în medii cu conținut ridicat de Ca2+ timp de 1, 3 sau 18 ore. Aceste rezultate subliniază principalul mesaj „de reținut” din Figura 3C: Nivelurile Ecad sunt îmbogățite în desmosomii născuți, nivelurile relative scăzând pe măsură ce desmosomii ajung la maturitate.
2) Au fost exprimate preocupări similare cu privire la Figura 5, care se presupune că arată că Ecad L175 este esențială pentru recrutarea eficientă a Dsg2 intercelulară și pentru asamblarea desmosomului. Imaginile din panoul A arată într-adevăr o diferență dramatică în ceea ce privește localizarea Dsg2 și DP în raport cu cadherina WT sau mutantă. În timp ce Dsg2 și DP se colocalizează împreună cu WT sau K14E Ecad la joncțiuni, ele rămân în punctaje separate care flanchează joncțiunea L175D Ecad și nu se colocalizează cu aceasta. Cu toate acestea, nu este clar ce au cuantificat autorii pentru a testa semnificația acestui fenotip. În B, ce înseamnă „% de joncțiune care formează contacte”? Cum se definește un contact? Ce joncțiuni măsoară ei? AJ sau desmosomii? În C și E, ce înțeleg ei prin „% de joncțiuni Dsg2 sau DP pozitive”? Cum au fost definite joncțiunile?
Am adăugat acum un panou de figuri (Figura 5-supliment de figură 1A) pentru a ilustra criteriile de cuantificare și categoriile de joncțiuni care au fost utilizate în analiza noastră. Acest panou prezintă exemple de celule transfectate cu Ecad mutant care nu prezintă (panoul din stânga) sau prezintă (panoul din dreapta) formarea AJ intercelulare. Pentru recrutarea Dsg2 sau DP, am cuantificat doar acele interfețe intercelulare în care au fost observate fermoare AJ. În inserțiile din panoul din figură, arătăm exemple de contacte AJ pozitive care sunt fie pozitive pentru DP, fie negative pentru DP.
În subsecțiunea „Ecad L175 este esențială pentru recrutarea intercelulară eficientă a Dsg2 și asamblarea desmosomului” din manuscris, precizăm acum că abilitatea keratinocitelor transfectate de a forma AJ a fost evaluată mai întâi prin formarea de modele de tip „fermoar” ale Ecad la contactele intercelulare. Am arătat anterior că aceste fermoare reprezintă AJ-uri timpurii și recrutează proteine marker AJ, cum ar fi vinculina (Rübsam et al., 2017). Am examinat doar interfețele intercelulare cu fermoare AJ, pentru capacitatea lor de a recruta Dsg2 și DP la aceste contacte. Este important faptul că nu am observat niciodată o îmbogățire a componentelor desmosomale la contactele intercelulare în absența fermoarelor AJ (Michels et al., 2009).
Așa cum este descris în răspunsul 3a de mai jos, discutăm acum în secțiunea Discuții că, deși Dsg2 și DP prezintă o anumită colocalizare la fermoarele pozitive Ecad în decurs de 3 ore, există, de asemenea, o colorare joncțională care nu se suprapune, sugerând că AJ-urile și desmosomii încep deja să se segregheze în joncțiuni intercelulare distincte. Nu am cuantificat această colocalizare în manuscrisul nostru, deoarece scopul principal al experimentelor noastre a fost de a arăta relevanța lui L175 pentru recrutarea Dsg2 la interfețele intercelulare și facilitarea formării desmosomului (așa cum este ilustrat de recrutarea DP la contactele intercelulare). Credem că întârzierea în recrutare între WT, mutantul L175 și mutantul K14, care este cuantificată în figura 5, ilustrează acest aspect.
3) Există, de asemenea, modificări ale secțiunii Introducere și discuții necesare pentru a aborda punctele de mai sus, precum și accesibilitatea lucrării:
a) Legat de punctele de mai sus, legătura dintre experimentele de legare in vitro și rolul biologic propus pare firavă pe baza studiilor de localizare care dezvăluie modele de colorare suprapuse, dar nu cu adevărat colocalizate. Autorii trebuie să explice această constatare; poate că colocalizarea este dinamică și/sau doar un subset de molecule de E-cadherină este legat de Dsg2. Acest punct trebuie cel puțin discutat pentru a raționaliza rezultatele experimentelor de localizare cu modelul propus.
Datorită naturii tranzitorii a interacțiunilor Ecad/Dsg2, este de așteptat ca proteinele desmosomale recrutate la joncțiuni să se segregheze rapid de Ecad. În consecință, se așteaptă ca imaginile interfețelor intercelulare să aibă atât modele de colorare a Ecad și a proteinelor desmosomale suprapuse, cât și separate. În acord, deși Dsg2 și DP prezintă o anumită colocalizare la fermoarele pozitive Ecad (figura 5), se observă o colorare semnificativă care nu se suprapune la nivelul joncțiunilor, chiar și în primele 3 ore. Acest lucru sugerează că AJ-urile și desmosomii se segregă rapid în joncțiuni intercelulare distincte. Precizăm acum acest lucru în secțiunea Discuții.
b) La începutul secțiunii Discuții, autorii susțin că:
b) La începutul secțiunii Discuții, autorii susțin că:: „identifică două evenimente critice care inițiază și promovează asamblarea eficientă a desmosomului: (i) homodimerizarea trans stabilă a Ecad și (ii) legarea heterofilă directă a ectodomenelor Ecad și Dsg2. Datele noastre demonstrează că asamblarea desmosomului este inițiată la locurile de homodimerizare trans Ecad. Ulterior, Ecad și Dsg2 se leagă prin intermediul unui Leu 175 conservat pe interfața de legare cis a Ecad și formează complexe eterofile de scurtă durată care se localizează în desmosomii timpurii și recrutează eficient proteinele desmosomale în locurile de formare a contactelor intercelulare. Pe măsură ce desmosomii se maturizează, Dsg2 se disociază de Ecad și formează legături stabile cu Dsc2 pentru a media aderența robustă.” – Acest paragraf amestecă observații, interpretări și modele ipotetice și, ca atare, este înșelător. Ar trebui să separe rezumatul rezultatelor de interpretare și de modelul lor.
Așa cum au sugerat recenzenții, am eliminat interpretările din primul paragraf al secțiunii Discuții și acum rezumăm doar rezultatele.
c) Autorii scriu în Rezumat și Introducere „Ecad interacționează cu Dsg2 prin intermediul unui Leu 175 conservat pe interfața de legare cis a Ecad”. – Autorii nu ar trebui să presupună că cititorii sunt familiarizați cu interacțiunile homofile E-cad și ar trebui să explice acest lucru în mod explicit.
În Rezumat, se afirmă acum că „Studiile anterioare demonstrează că E-cadherina (Ecad), o proteină adezivă care interacționează în ambele conformații trans și cis, facilitează asamblarea desmosomului printr-un mecanism necunoscut”.
În plus, în Introducere, se afirmă acum: „E-cadherina (Ecad), o proteină adezivă care interacționează în ambele conformații trans și cis, facilitează asamblarea desmosomului printr-un mecanism necunoscut: „Deoarece Ecad interacționează lateral pentru a forma dimeri cis pe aceeași suprafață celulară (Harrison et al., 2011), în timp ce moleculele Ecad din celule opuse interacționează într-o conformație de dimer trans strand-swap (Boggon et al., 2002; Parisini et al, 2007; Vendome et al., 2011) și o conformație trans X-dimer (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), am utilizat mutanți care suprimă în mod specific fie interacțiunile trans, fie cele cis ale Ecad și am testat legătura acestora cu Dsg2 sau Dsc2′. În cele din urmă, în introducere, precizăm acum că „Studiile structurale anterioare au arătat că L175 mediază dimerizarea cis homofilică a Ecad (Harrison et al., 2011)”.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013.