Producerea de albumină umană la porci prin CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA in Swine Albumin Locus in the Zygotes
Serumalbumina umană (HSA) este cea mai abundentă proteină plasmatică care joacă funcții homeostatice critice în fiziologia umană, inclusiv menținerea presiunii oncotice plasmatice, reglarea distribuției fluidelor corporale, transportul moleculelor mici, etc1. Este prescrisă pentru o serie de boli grave, cum ar fi insuficiența hepatică și șocul traumatic2. Din cauza lipsei de rezerve de sânge uman și a riscurilor asociate cu sângele uman, s-a căutat de mult timp o producție alternativă de albumină umană. Producția de HSA recombinantă a fost încercată anterior la porci prin exprimarea transgenei dominante sub forma fuziunii albumină-GFP3. Cu toate acestea, în abordările transgenice, din cauza prezenței albuminei porcine endogene, separarea și purificarea rHSA sunt problematice. Profitând de puterea sistemului CRISPR/Cas9 în modificarea genomului, am încercat să producem rHSA la porci prin introducerea ADNc de albumină umană în locusul albuminei porcine. Prin inserția ADNc ALB uman ALB plus secvența de semnal SV40 polyA (2368 bp în total) în locusul Alb de porc imediat în aval de codonul de pornire, ne așteptăm ca ALB uman să fie exprimat sub controlul transcripțional al albuminei endogene de porc și, în același timp, să blocheze expresia albuminei endogene de porc (Fig. 1a). Am proiectat un sgRNA care vizează regiunea codonului de pornire (imediat la 5′ de ATG și incluzând ATG) și am generat un fragment de direcționare (donator pentru recombinarea omoloagă) cu inserția flancată de secvențe de homologie de 1 kb pe ambele părți (Fig. 1a). Deoarece secvența de homologie 5′ utilizată în donator merge până la codonul de pornire, aceasta conține secvența sgRNA și, prin urmare, poate fi țintită de sgRNA ca donator sau de alela knockin după recombinare omologă. Pentru a împiedica acest lucru, am inserat 6 bp (gccacc) în secvența sgRNA chiar înainte de codonul de pornire. ARNg a fost transcris in vitro, purificat și injectat în ovocitele fertilizate împreună cu ARNm4 Cas9 și cu vectorul circular care conține fragmentul de direcționare. Sursa de ovocite a fost Bama minipig5. Embrionii injectați au fost cultivați timp de 1-2 ore înainte de a fi implantați în femele sincronizate cu estrul. ~300 de embrioni au fost implantați la 10 femele, dintre care 5 au rămas gestante și au adus pe lume un total de 16 pui vii. Puii au beneficiat de îngrijire standard și nu au prezentat semne de probleme de sănătate neobișnuite.
Knockin al ALB uman în locusul Alb porcin.
(a) Diagrama strategiei knockin. (b) Genotiparea fondatorilor. Amorsele PRC sunt ilustrate în (a). (c) Rezultatele secvențierii produselor PCR obținute cu perechea de primer e/f (a). Produsele au fost clonate și până la 12 clone (pentru #9) au fost secvențiate.
Am tăiat vârfurile urechilor celor 16 purcei când aceștia aveau aproximativ 4 săptămâni și am obținut ADN genomic pentru genotipare. Pentru a determina dacă am reușit să facem knockin, am evaluat ambele capete 5′ și 3′ ale situsului de inserție. Am utilizat două perechi de amorse, a/b și c/d (Fig. 1a). Primerul a se află în afara capătului 5′ al omologiei utilizate și b se află pe ALB uman (inserția); c se află pe ALB uman și d în afara capătului 3′ al omologiei. După cum se arată în Fig. 1b, toți cei 16 purcei sunt purtători ai alelei knockin dorite. Am clonat și secvențiat toate fragmentele de ADN amplificate. Acestea au fost produsele de recombinare omoloagă așteptate (Fig. S1). În continuare, am determinat statutul alelei de tip sălbatic la acești purcei. Amorsele e și f (conținute în inserție) (Fig. 1a) ar trebui să amplifice un fragment de 705 pb din locusul de tip sălbatic și un fragment de 3085 pb din alela knockin. Așa cum era de așteptat, toate au generat fragmentul de 3085 bp. Cu toate acestea, în mod neașteptat, am putut obține fragmentul aparent de 705 bp de tip sălbatic doar din 7 (nr. 5, 6, 9, 10, 12, 13 și 15) din cele 16 probe, restul generând produse slabe de aproximativ 700 bp (Fig. 1b). Lipsa aparentă a alelei de tip sălbatic la unii purcei sugerează că este posibil ca knockin-ul să se fi produs pe ambele alele. Alternativ, alela de tip sălbatic ar fi putut fi editată în așa fel încât secvența de amorsare a să fie ștearsă, ceea ce a dus la eșecul amplificării alelei de tip sălbatic. Într-adevăr, a avut loc o editare a alelei de tip sălbatic, deoarece dimensiunea fragmentelor amplificate a fost diferită de cea preconizată de 705 bp la unii purcei (Fig. 1b). Pentru a confirma acest lucru, am clonat și secvențiat toate fragmentele amplificate. După cum se arată în Fig. 1c, toate au fost editate, deși unele dintre ele aveau doar câteva modificări de câteva perechi de baze (prin urmare, păreau a fi la 705 bp). Printre aceste alele editate, cele găsite la purcelușul #10 și #12 sunt de interes. Cea de la nr. 10 a fost produsul înlocuirii unei porțiuni de 29 pb (de la ATG spre capătul 3′) din secvența porcului cu 36 pb (6 pb la 5′ de ATG și 26 pb după) din secvența donatoare. Nu este clar cum s-a întâmplat acest lucru. În #12, există două alele editate diferite, ceea ce face ca numărul total de alele să fie de 3, indicând mozaicism la acest purceluș, ceea ce nu este neobișnuit, deoarece mozaicismul a fost adesea întâlnit la animalele generate prin injectarea în zigot a Cas9/sgRNA6,7,8,8,9,10.
Pentru a determina dacă a avut loc off-targeting cu sgRNA, am ales 4 situsuri de top potențial off-target pe baza sugestiilor din instrumentul de proiectare CRISPR (http://tools.genome-engineering.org) și am amplificat fragmente care conțin aceste situsuri din ADN genomic din vârful urechii purcelușului #14. Fragmentele au fost supuse testului T4EN I4. După cum se arată în Fig. S2, nu s-a constatat nicio editare în afara țintei. Cu toate acestea, nu am putut elimina posibilitatea ca editarea în afara țintei să se fi produs în alți loci sau la ceilalți 15 porci transgenici. Cu toate acestea, chiar dacă a existat o editare off-target, este puțin probabil ca loci editați să fie problematici pentru scopul nostru de a produce rHSA, atâta timp cât nu interferează cu bunăstarea acestor porci transgenici.
După ce am demonstrat succesul knockin al ALB uman, am încercat să determinăm dacă albumina umană poate fi detectată în plasma sanguină a acestor purcei knockin. După cum se arată în Fig. 2a, toți purceii conțineau albumină umană în plasma lor sanguină, detectabilă cu anticorpii specifici împotriva albuminei umane, deși la niveluri variabile, ceea ce este probabil rezultatul a cel puțin doi factori, dacă ambele alele sunt knockin și gradul de mozaicism (în special în ficat). Nivelul din #7 este foarte scăzut, vizibil doar după o expunere îndelungată a blot-ului, în ciuda lipsei aparente a alelei Alb de porc de tip sălbatic (Fig. 1a). În general, nivelurile sunt mult mai scăzute decât cele din serurile umane adulte. Se știe că concentrația de albumină din sânge la porci crește odată cu vârsta, ajungând la un nivel similar cu cel de la oamenii adulți la vârsta de 6 luni11.
Analiza ALB umană în sânge.
(a) Detectarea prin Western blot a albuminei umane în sângele purceilor fondatori. 0,5 μl de plasmă de la fiecare fondator a fost separată pe SDS-PAGE și analizată. Plasma din sânge uman (0,5 μl după ce a fost diluată de 30 de ori) a fost utilizată ca martor pozitiv. C, plasmă de la un porc de tip sălbatic. (b) Ilustrație a peptidelor triptice (verde) detectate cu analiza spectrometrică de masă. (c) Semicantificarea a două peptide triptice din albumina umană și de porc prin măsurarea zonelor de vârf ale fiecărei peptide. Roșu marchează reziduurile de aminoacizi care sunt specifice porcului.
Pentru a confirma că rHSA detectată în plasma purceilor noștri knockin cu anticorpi este cu adevărat albumină umană, am supus două probe de plasmă (purcelușii nr. 2 și nr. 6) la analiza spectrală de masă. #Nr. 2 este aparent homozigot pentru alela knockin, iar #6 conține o alelă knockin și una mutantă (frameshift) (Fig. 1). 0,5 μl de plasmă a fost separată pe SDS-PAGE, iar proteinele în jurul valorii de 70 KD au fost digerate în gel cu tripsină. Peptidele triptice au fost eluate din gel, uscate și redisolvate pentru a fi separate prin cromatografie lichidă și analiză spectrometrică de masă. Pentru purcelușul nr. 2, am putut detecta 14 peptide triptice ALB umane unice și 15 pentru nr. 6 (Fig. 2b). Spectrele M/Z pentru peptida umană FKDLGEENFK și peptida porcină FKDLGEQYFK (ambele de la purcelul nr. 2) au fost prezentate în Fig. S3. Două peptide au fost alese pentru cuantificare prin măsurarea zonelor de vârf. În concordanță cu rezultatele Western Blot, aceste două peptide au fost mult mai abundente (de ~5 ori) la #2 decât la #6 (Fig. 2c). Aceste rezultate demonstrează că rHSA detectată de anticorpi este albumina umană autentică.
Genotiparea ADN-ului izolat din vârfurile urechilor indică faptul că atât #2 cât și #6 nu conțin nici o alelă Alb de porc de tip sălbatic, fie că nu este prezentă, fie că este editată (Fig. 1b,c). Cu toate acestea, am putut detecta în continuare peptide triptice din albumina de porc în ambele probe, dar la o abundență mult mai mică (Fig. 2c). În mod interesant, abundența peptidelor de porc a fost aproximativ aceeași între cele două probe, în ciuda faptului că abundența peptidelor umane a fost foarte diferită. Aceste rezultate sugerează că ambii purcei conțin un număr similar de hepatocite de tip sălbatic (sau heterozigot) care sunt responsabile pentru ALB de porc detectat în sângele celor doi purcei. Cu toate acestea, este posibil ca astfel de celule care conțin alele de tip sălbatic să nu existe sau să existe într-un procent extrem de scăzut în vârfurile urechilor, astfel încât alela de tip sălbatic să nu poată fi amplificată prin PCR. Mai mult, analiza Southern blot cu o sondă internă (jumătatea 3′ a CDS ALB uman) a indicat prezența unei inserții suplimentare a secvenței donatoare la purceii nr. 1, 4 și 5 (Fig. S4). Toate aceste complicații nu vor reprezenta o problemă în scopul producerii de albumină umană recombinantă, deoarece alela knockin poate fi purificată prin încrucișare inversă.
Pentru a determina dacă alela knockin poate fi transmisă la următoarea generație, am încrucișat porcii #2 (mascul, homozigot) cu #5 (femelă, heterozigotă) atunci când au devenit maturi din punct de vedere reproductiv. Din această încrucișare s-au născut 6 pui. 4 dintre ei (#1, 3, 4 și 6) sunt homozigoți pentru alela knockin (AlbH/H, H semnifică om) și 2 (#2 și 5) heterozigoți (AlbP/H, P semnifică porc) (Fig. 3a). #5 și 6 au murit de diaree la aproximativ 2 săptămâni după naștere. Am analizat expresia albuminei umane în sângele purceilor rămași la vârsta de 4 săptămâni. După cum se arată în Fig. 3b, toți au albumină umană în sânge. În mod interesant, nivelul de albumină umană la animalul heterozigot (#2) a fost mult mai mic decât la homozigoți. Nu știm dacă acesta este rezultatul unei variații individuale sau dacă alela knockin este cumva suprimată de alela de tip sălbatic.
Transmiterea pe linie germinală a alelei knockin.
(a) Genotiparea PCR a descendenților F1. Primerii utilizați au fost aceiași ca în Fig. 1. (b) Detectarea prin Western blot a albuminei umane în sângele purceilor F1. 0,5 μl de plasmă de la fiecare purceluș a fost separată pe SDS-PAGE și analizată. C, plasmă de la un porc de tip sălbatic. M, marker de greutate moleculară.
Demonstrăm aici generația reușită de porci purtători de ADNc ALB uman bătut în locusul Alb porcin. Acesta este un pas mai departe decât simpla editare genetică în zigoții de porc raportată recent de Hai et al.12 și de noi13. Animalele domestice mari au fost folosite ca bioreactoare pentru produse proteice biomedicale14,15,16,16,17,18,19,20. De obicei, secvențele codificatoare ale acestor proteine au fost inserate aleatoriu, împreună cu elementele necesare de control al transcripției, în genom sub formă de transgene, ceea ce este asociat cu multe complicații, inclusiv cu natura pe termen scurt a expresiei transgenei. Demonstrația noastră că recombinarea omoloagă poate avea loc foarte eficient în zigoții de porc deschide ușa pentru dezvoltarea unor bioreactoare din ce în ce mai bune, precum și a unor tulpini de animale cu trăsături din ce în ce mai dezirabile.
.