Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 pentru a regla bariera epitelială și recrutarea neutrofilelor

Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 pentru a regla bariera epitelială și recrutarea neutrofilelor

ICAM-1 favorizează aderența și locomoția PMN pe membrana epitelială apicală în condiții de inflamație

În abcesele de criptă, așa cum se observă în IBD activă, PMN infiltrate în criptele intestinale sunt adesea observate în contact intim cu suprafața epitelială apicală (luminală).14 Pentru a examina interacțiunile PMN-IEC în timpul etapelor târzii ale TEM, am modelat migrația PMN de-a lungul epiteliului intestinal în condiții inflamatorii, utilizând o configurație transwell descrisă anterior.19 TEM PMN în direcția fiziologică de la bazolaterală la apicală de-a lungul IEC-urilor T84 de control sau tratate cu interferon-γ (IFNγ) a fost indusă prin adăugarea unui gradient transepitelial de N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). Expunerea IECs T84 la IFNγ (100 U ml-1, 24 h) nu a avut niciun efect semnificativ asupra funcției de barieră a IEC sau asupra expresiei și localizării subcelulare a proteinelor cheie de joncțiune JAM-A, Occludin și ZO-1 (Figura suplimentară S1 online). Tratamentul cu IFNγ nu a avut niciun efect semnificativ asupra numărului de PMN care au finalizat TEM; cu toate acestea, a crescut semnificativ numărul de PMN asociate apical (de la 8,7±1,8%, netratat, la 19,7±1,9%, IFNγ, apical, Figura 1a). În concordanță cu această creștere, numărul de PMN care nu au migrat (PMN în camera superioară, bazal) a fost redus semnificativ (∼1,5 ori) după tratamentul cu IFNγ, sugerând o rată crescută de migrare (Figura 1a). Numărul de PMN din cadrul monostratului epitelial (epith) nu a fost modificat. Imaginile confocale reprezentative de imunofluorescență confocală (Figura 1b, panourile superioare) și proiecțiile z (panourile inferioare) arată PMN asociate la nivel apical după migrarea prin monostraturile T84 stimulate cu IFNγ, dar nu și prin cele de control. Deoarece s-a demonstrat anterior că IFNγ induce expresia ICAM-1 în epiteliul inflamat,27 am emis ipoteza că, în timpul inflamației, PMN care migrează peste monostraturile epiteliale au rămas aderente la membrana apicală prin interacțiuni dependente de Mac-1 și ICAM-1 și, prin urmare, ar fi capabile de locomoție dependentă de ICAM-1, așa cum s-a observat anterior în endoteliul vascular24, 28 Confirmând constatările anterioare, tratamentul cu IFNγ (100 U ml-1, 24 h) a indus o creștere robustă și dependentă de timp a expresiei ICAM-1 (cu un vârf la 24 h după tratament, figura 1c,d) pe membrana apicală a IEC-urilor T84 (figura 1e). Acest efect a fost specific pentru IFNγ, deoarece expunerea IEC-urilor T84 și SKCO15 la factorul de necroză tumorală-α (TNFα; 10 ng ml-1) nu a reușit să inducă expresia ICAM-1 (Figura suplimentară S2A,B). S-a observat, de asemenea, o creștere a ICAM-1 în epiteliul criptă din biopsiile colonice de la pacienții cu colită ulcerativă activă, comparativ cu mucoasa sănătoasă (figura 1f). Mai mult, confirmând aderența PMN dependentă de ICAM-1 și Mac-1 la membranele apicale ale IEC, adăugarea de anticorpi de blocare a funcției anti-ICAM-1 sau anti-Mac-1 (Abs; 20 μg ml-1) a inversat creșterea indusă de IFNγ a aderenței PMN (Figura suplimentară S3A). În mod interesant, inhibarea Mac-1 a PMN a dus la o reducere mai puternică (>3 ori) a adeziunii PMN în comparație cu inhibarea ICAM-1, sugerând că Mac-1 se leagă de alți liganzi de suprafață epitelială în plus față de ICAM-1.

Am examinat în continuare dacă PMN aderate apical după ce au traversat epiteliul au prezentat locomoție apicală. Microscopia time-lapse cu contrast de fază a fost utilizată pentru a urmări și cuantifica comportamentul PMN-urilor individuale atașate la membrana apicală a IEC. PMN în absența stimulilor exogeni au prezentat puține mișcări; cu toate acestea, 59,3±7,6 % din PMN asociate la nivel apical după migrarea prin IEC au prezentat un comportament foarte mobil (figura 2a) cu distanțe medii de târâre de 65,6±6,2 μm (figura 2b). TEM a indus o creștere robustă a expresiei Mac-1 pe suprafața celulară a PMN (Figura 2c), în concordanță cu rolul său în interacțiunile apicale PMN-IEC. Este important de remarcat faptul că numărul de PMN care prezintă locomoție apicală a crescut semnificativ atunci când IEC-urile au fost stimulate cu IFNγ pentru a regla în sus ICAM-1 (88±3,6%, IFNγ, față de 59,3±7,6%, IEC netratate). În aceste condiții, PMN s-au deplasat pe distanțe semnificativ mai mari (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, IEC netratate, figura 2b) de-a lungul membranei epiteliale apicale. Confirmând rolul ICAM-1 în medierea locomoției PMN, adăugarea unui anticorp anti-ICAM-1 care blochează funcția (Ab) a inversat efectele IFNγ, reducând atât numărul, cât și distanțele parcurse de PMN (61,4±7,8% și, respectiv, 73,6±6,1 μm, Figura 2a,b). Inhibarea Mac-1 a abolit locomoția PMN aderente rămase (figura 2a și filmele suplimentare S1 și S2), confirmând un rol exclusiv al Mac-1 în acest proces. Efectele inhibării Mac-1 asupra locomoției PMN sunt evidențiate în continuare în secvențe de imagini în timp (Figura 2d) și prin traiectoriile de deplasare a șase PMN reprezentative (Figura 2e). Vitezele de târâre ale PMN au variat de la 3 la 7 μm min-1 și nu au fost semnificativ diferite pe IECs nestimulate față de IECs stimulate cu IFNγ (Figura suplimentară S3B).

Aderarea PMN la membrana epitelială apicală compromite funcția de barieră epitelială

Apoi am examinat efectele interacțiunilor PMN cu liganzii epiteliali exprimați apical asupra funcției de barieră epitelială. În aceste experimente, PMN au fost adăugate la nivel apical la IECs T84 confluente cultivate pe suporturi permeabile (dimensiunea porilor de 0,4 μm, prea mici pentru a permite PMN TEM), iar TER, ca indice al barierei epiteliale, a fost măsurat pe parcursul a 12 ore în condiții specificate. Perioada de timp de 12-h a fost selectată pentru a evita efectele PMN apoptotice asupra barierei epiteliale.29 Aderarea PMN stimulată de fMLF (100 nM) la IECs T84 a declanșat o scădere dependentă de timp a TER pe o perioadă de timp de 12-h (∼60%, Figura 3a). Este important faptul că adăugarea de PMN la membrana apicală a IECs T84 care au fost pretratate cu IFNγ, despre care am arătat că duce la o adeziune PMN dependentă de ICAM-1 îmbunătățită (Figura 1a), a dus la o scădere suplimentară a TER (∼40% în primele 2 h și ∼90% pe parcursul a 12 h). Tratamentul cu IFNγ singur nu a avut niciun efect asupra TER. Pentru a testa dacă creșterea observată a permeabilității epiteliale s-a datorat unui contact direct între celulele epiteliale și PMN, am utilizat un Ab inhibitor anti-Mac-1 (CBRM1/29, 20 μg ml-1) pentru a inhiba aderența PMN la IECs stimulate de IFNγ. Inhibarea lui Mac-1 a atenuat în mod semnificativ scăderea TER indusă de PMN după stimularea cu IFNγ (figura 3a). Este important faptul că, în experimente separate, am confirmat în continuare că scăderea TER indusă de PMN atât în monostraturile epiteliale nestimulate, cât și în cele tratate cu IFNγ, a depins de contactul direct dintre PMN și membrana epitelială apicală, și nu a fost mediată prin mecanisme paracrine. În astfel de experimente, PMN au fost adăugați în camera inferioară a transwells conținând monostraturi T84 inversate (partea apicală orientată în jos) și au fost stimulați cu fMLF (100 nM). În aceste condiții, nu a existat niciun efect al PMN asupra barierei epiteliale, evaluată prin TER (figura 3b). Expunerea monostraturilor epiteliale la 100 nM fMLF timp de 12 h nu a avut niciun efect semnificativ asupra TER.

Ligarea ICAM-1 epitelială declanșează o creștere dependentă de MLCK a permeabilității epiteliale intestinale

Am observat că o amplificare apicală a ICAM-1 a potențat semnificativ efectele adeziunii PMN dependente de Mac-1 asupra barierei epiteliale (Figura 3a). Astfel, am emis ipoteza că creșterea indusă de PMN a permeabilității monostraturilor epiteliale tratate cu IFNγ s-a datorat grupării ICAM-1 mediată de contactul cu PMN și unei inducții a evenimentelor de semnalizare dependente de ICAM-1, așa cum s-a descris anterior în endoteliul vascular.30, 31 Monostraturile IEC T84 pe suporturi permeabile au fost tratate cu IFNγ pentru a induce expresia ICAM-1, urmată de adăugarea de Abs de reticulare la ICAM-1. Am confirmat că reticulația mediată de Ab a indus gruparea ICAM-1 (Figura suplimentară S2C). După cum se arată în figura 4a, reticulația mediată de Ab a ICAM-1 a dus la o scădere în funcție de timp a TER, care s-a corelat cu creșterea fluxului paracelular de izotiocianat de fluoresceină (FITC)-dextran (3 kDa, figura 4b). Acest efect a fost specific pentru ICAM-1, deoarece încrucișarea altor molecule de suprafață epitelială, a complexului major de histocompatibilitate-1 (MHC-1; figura 4) și a ligandului PMN cunoscut, CD55 (figura suplimentară S5), nu a avut niciun efect semnificativ asupra permeabilității. În concordanță cu absența expresiei ICAM-1 pe IECs T84 nestimulate, aplicarea de Abs de reticulare pe suprafața apicală a acestor IECs în absența stimulării cu IFNγ nu a avut niciun efect asupra TER (figura suplimentară S4A). În mod similar, în concordanță cu localizarea ICAM-1 indusă de IFNγ pe membrana epitelială apicală, aplicarea de Abs de reticulare pe aspectul bazolateral al monostraturilor epiteliale nu a avut niciun efect semnificativ asupra funcției de barieră (Figura suplimentară S4B).

Am arătat anterior că evenimentele timpurii din TEM PMN (la nivelul membranei epiteliale bazolaterale) declanșează scăderi ale TER mediate de MLCK.9 S-a demonstrat că MLCK are un rol-cheie în reglarea permeabilității epiteliale prin reglarea contracției inelului de actomiozină perijuncțional prin fosforilarea lanțului ușor de reglare a miosinei II.32 Ne-am întrebat astfel dacă permeabilitatea crescută a IEC după ligatura ICAM-1 exprimată apical a fost dependentă de MLCK. Într-adevăr, reticulația mediată de Ab a ICAM-1 a dus la fosforilarea MLCK (Tyr 464), în concordanță cu activarea MLCK (Figura 4c). O astfel de activare a fost însoțită de o diminuare a pensulei apicale și a F-actinei perijuncționale (Figura 4d), ceea ce indică o reorganizare a citoscheletului de actină. Este important faptul că inhibarea fosforilării MLCK indusă de ligatura ICAM-1 în celulele T84 cu ML-7 (20 μM,33 Figura suplimentară S4C) a împiedicat reorganizarea F-actinei indusă de ICAM-1 (Figura 4d), scăderea TER (Figura 4a) și creșterea fluxului paracelular de dextran (Figura 4b). Tratamentul cu ML-7 (20 μM) singur nu a avut niciun efect asupra TER. Împreună, aceste date sugerează că, în condiții inflamatorii, contactul PMN cu suprafața apicală a celulelor epiteliale de criptă declanșează evenimente de semnalizare dependente de ICAM-1, ceea ce duce la o permeabilitate sporită.

Angajarea ICAM-1 pe membrana epitelială apicală facilitează o TEM îmbunătățită a PMN

Cum ligatura ICAM-1 exprimată apical a crescut permeabilitatea epitelială, am efectuat experimente pentru a examina dacă alterările dependente de ICAM-1 în funcția de barieră epitelială ar duce la o TEM îmbunătățită a PMN. Am investigat mai întâi dacă implicarea PMN în ICAM-1 pe membrana apicală a IEC a afectat TEM PMN în direcția bazolaterală-apicală, relevantă din punct de vedere fiziologic.34 În aceste experimente, PMN au fost stimulate să migreze prin monostraturile epiteliale, iar celulele transmigrate au fost colectate și reaplicate timp de 1 oră pe suprafața apicală a unor noi monostraturi epiteliale (2,5 × 105 PMN pe monostrat) cu sau fără pretratament cu IFNγ. După 1 h de contact PMN-epitelial, monostraturile au fost spălate fără PMN aderente și au fost utilizate pentru testele TEM PMN ulterioare în direcția bazolaterală-apicală. Introducerea apicală a PMN în monostraturile epiteliale tratate cu IFNγ, dar nu și în monostraturile epiteliale netratate, a declanșat o creștere semnificativă a TEM PMN (de 1,7 ori, figura 5a). Tratamentul cu IFNγ singur sau prezența PMN în apropierea suprafeței apicale, dar fără contact direct cu monostraturile, nu a avut niciun efect asupra TEM PMN (figura 5a). În experimentele paralele, TEM PMN a fost examinată după reticulația specifică a ICAM-1 mediată de Ab. În concordanță cu efectul reticulației ICAM-1 asupra funcției de barieră a IEC, reticulația ICAM-1 mediată de Ab pe IEC T84 tratate cu IFNγ a crescut semnificativ TEM PMN (de 1,9± ori, figura 5b) în comparație cu reticulația unei molecule de control exprimate apical, MHC-1. După cum era de așteptat, aplicarea protocoalelor de reticulare a ICAM-1 la monostraturile IEC netratate nu a avut niciun efect semnificativ asupra TEM PMN. Împreună, aceste constatări sugerează că PMN care aderă la membrana apicală (luminală) a IEC prin implicarea ICAM-1 poate declanșa modificări ale funcției de barieră epitelială și poate contribui la reglarea recrutării PMN.

Reticularea ICAM-1 a dus la activarea MLCK, sugerând contracția actinei-miosinei (figura 4). Astfel, am examinat în continuare efectele inhibării MLCK și ale inhibării forțelor contractile F-actina asupra TEM PMN în urma reticulației ICAM-1. Creșterea TEM PMN indusă de reticulația ICAM-1 a fost inversată atunci când IEC-urile au fost pretratate fie cu inhibitorul MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33), fie cu inhibitorul motorului II al miozinei, Blebbistatin (10 μM, 1 h,35 Figura 5c). Aceste constatări sugerează un rol pentru contracția actomiozinei în aval de ICAM-1 în reglarea TEM PMN. Tratamentul cu ML-7 sau Blebbistatin singur nu a avut niciun efect asupra TEM PMN (Figura 5c).

Legarea ICAM-1 mediată de Ac în lumenul intestinal murin duce la creșterea dependentă de MLCK a permeabilității epiteliale și la o recrutare îmbunătățită a PMN

Am efectuat în continuare experimente in-vivo pentru a examina efectul ligaturii ICAM-1 asupra funcției de barieră epitelială intestinală și a recrutării PMN, folosind un model de buclă intestinală de șoarece (Figura 6b). În acest model, permeabilitatea segmentelor intacte, perfuzate cu sânge, ale intestinului subțire a fost evaluată după introducerea de FITC-dextran în lumenul intestinal. După cum se arată în figura 6a, deși ICAM-1 nu a fost detectată în epiteliul nestimulat (panoul superior), administrarea intraperitoneală (i.p.) de IFNγ și TNFα (500 ng, 24 h) a dus la o inducție robustă a expresiei ICAM-1. În special, ICAM-1 indusă s-a localizat în regiunile apicale ale IEC-urilor din cripta murină deasupra Claudin-2 (Figura 6a, panoul inferior). În paralel, am observat că tratamentul cu citokine a dus la o creștere de ∼2 ori a permeabilității de 3 kDa FITC-dextran (Figura 6c).

Important este faptul că introducerea Abs de reticulare ICAM, dar nu și a Abs la proteina de control, MHC-1 în lumenul buclelor intestinale stimulate cu citokine a indus o creștere suplimentară de ∼1,5 ori mai mare a permeabilității la dextran în comparație cu tratamentul cu citokine singur (Figura 6c). Pentru a confirma faptul că creșterile permeabilității epiteliale intestinale au fost mediate în mod specific de evenimentele de semnalizare induse de ICAM-1 epitelială, am utilizat peptide derivate din domeniul citoplasmatic al ICAM-1 (peptidă ICAM-1) pentru a inhiba capacitatea ICAM-1 de a media evenimentele de semnalizare din aval. S-a demonstrat anterior în endoteliul vascular că ICAM-1, dar nu și peptida de control, a inhibat interacțiunile dintre ICAM-1 și proteinele țintă, împiedicând astfel semnalizarea dependentă de ICAM-1 fără a afecta legarea la liganzii extracelulari ai leucocitelor.22, 24 Adăugarea de ICAM-1, dar nu și a peptidei de control (100 μg ml-1, 30 min), a inhibat creșterile induse de ligatura ICAM-1 în permeabilitatea intestinală (figura 6c). S-a confirmat că Abs introduse intraluminal în buclele intestinale (nestimulate și în urma activării IFNγ/TNFα) nu traversează epiteliul, excluzând astfel o potențială contribuție indirectă a celulelor lamina propria la efectele observate (Figura suplimentară S6).

În sprijinul suplimentar al rolului MLCK în semnalizarea mediată de ICAM-1, inhibarea activării MLCK cu ajutorul ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) înainte de reticulația ICAM-1 a împiedicat creșterea permeabilității (figura 6c). Aceste date demonstrează că permeabilitatea epitelială intestinală crescută in vivo după ligatura ICAM-1 este dependentă de MLCK.

Deoarece permeabilitatea epitelială crescută este asociată cu o migrație sporită a PMN, ne-am întrebat dacă ligatura ICAM-1 ar duce la o recrutare sporită a PMN in vivo. Utilizând modelul de buclă intestinală murină, infiltrarea PMN în mucoasa intestinală și migrarea în lumen a fost indusă prin administrarea luminală a chimioattractantului CXCL1 (1 μM în 200 μl de soluție salină echilibrată Hank (HBSS)+) și cuantificată prin marcare prin imunofluorescență / microscopie confocală și analiza lichidului spălat preparat pe citospină și, respectiv, colorat cu Diff-Quik. În absența chemoattractantului, PMN nu au fost detectate în epiteliul intestinal sau în lumenul intestinal (nu se arată); cu toate acestea, administrarea luminală de CXCL1 a declanșat o migrare semnificativă a PMN în stratul epitelial (figura 7a) și o acumulare în lumenul intestinal (figura 7c). În concordanță cu creșterea permeabilității indusă de citokine, tratamentul cu IFNγ/TNFα a crescut de ∼2,2 ori numărul de PMN în epiteliul intestinal și de ∼1,7 ori în lumen. Este important de remarcat faptul că adăugarea de Abs de reticulare ICAM-1 în lumenul buclelor intestinale tratate cu citokine a crescut și mai mult (față de tratamentul cu citokine singur) numărul de PMN atât în epiteliu (∼1,6 ori, figura 7a,b), cât și în lumen (∼1,4 ori, figura 7c,d). PMN (verde) care se infiltrează în epiteliul intestinal (roșu) sunt prezentate în imagini reprezentative ale secțiunilor de țesut din buclele intestinale activate cu citokine după ligatura ICAM-1 (Figura 7b). În mod similar, PMN care au migrat în lumen după ligatura ICAM-1 sunt prezentate în imagini reprezentative ale lichidelor de spălare din buclele intestinale (figura 7d).

În concordanță cu creșterile induse de legarea ICAM-1 în permeabilitatea epitelială, migrația sporită a PMN în lumenul intestinal a fost dependentă de evenimentele de semnalizare mediate de ICAM-1 și de activarea MLCK. Atât adăugarea intraluminală a peptidei ICAM-1, dar nu și a peptidei de control (nu se arată; 100 μg ml-1, 30 min), cât și inhibarea MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) înainte de reticulația ICAM-1 mediată de Ab au inhibat complet creșterile induse de ligatura ICAM-1 în migrația PMN (figura 7a,c). Aceste constatări sugerează că implicarea ICAM-1 pe membrana epitelială intestinală apicală în condiții de inflamație compromite funcția de barieră, facilitând astfel o recrutare sporită de PMN in vivo.