Den genetiska variationen av olika utvecklingsstadier av Schistosoma japonicum: gynnar spridningen i sniglar och parningspreferens överföringen?
Provsamling
Provsamlingen och den experimentella utformningen sammanfattas i fig. 1. Steg i provinsamlingen beskrivs nedan, inklusive insamling av sniglar, insamling av cerkarier, insamling av infektion hos möss och vuxna maskar samt insamling av miracidier.
Flödesschema över provinsamling och experimentell utformning
Snigelinsamling
Oncomelania hupensis-sniglar samlades in i mars och september 2016 från det östra området av Dongtingsjön (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), Hunanprovinsen, Kina. Sniglarna hittades i diken i tre byar på ett avstånd av 10 km. Insamlingsplatsen är en sumpmark och inte en nationalpark eller annat skyddat område eller privat mark. Insamlingarna genomfördes med tillstånd och hjälp av institutet för kontroll av schistosomiasis i Hunanprovinsen, Kina, som övervakar snigelkontrollen i området. Oncomelania hupensis är inte en utrotningshotad eller skyddad art. Sniglarna togs tillbaka till laboratoriet och klassificerades som grupp A för de sniglar som samlades in i mars och grupp B för de sniglar som samlades in i september. Efter en månads fångenskap tvättades sniglarna och överfördes till enskilda vattenfyllda flaskor under 3 timmar i ljuset vid 25 °C för att stimulera uppkomsten av cerkarier för identifiering av S. japonicum-infektion. Slutligen identifierades 20 sniglar från grupp A och 25 sniglar från grupp B som infekterade med S. japonicum.
Cerkarieinsamling
När cerkarier frigjorts från enskilda sniglar överfördes några av dem till en skål med hjälp av en slinga och tvättades i cerkarietvättlösning (5 g/l laktalbuminhydrolysat, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O och 1 g/l glukos) under mikroskopering. Efter tre tvättar pipetterades cerkarierna individuellt med 2 μl steriliserad tvättlösning på ett Whatman™ FTA-kort (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Efter torkning förvarades korten i en förseglad plastpåse i en exsickator i rumstemperatur. Minst 50 cerkarier per snigel samlades in individuellt och förvarades på Whatman™ FTA-kort.
Musinfektion med cerkarier från en enskild snigel
För att särskilja S. japonicum-infekterade sniglar av ett enda kön infekterades 2 laboratoriemöss av typen Kunming perkutant med 30 cerkarier från varje snigel per mus. Totalt infekterades 40 möss för 20 sniglar i grupp A och 50 möss infekterades för 25 sniglar i grupp B. Maskarna hämtades från mesenterialvenerna hos varje mus genom perfusion med 0,9 % NaCl och dissektion 7 veckor senare efter infektion. Man var noga med att minimera risken för att parade vuxna maskar splittras på grund av mekanisk kraft under perfusion och dissektion, och man använde tre erfarna tekniker för att bearbeta maskarna så snabbt som möjligt. Varje par av maskar överfördes till separata rör för tvättning och märkning omedelbart, och förvarades i absolut etanol i par när de separerades spontant. Opartade maskar från varje mus kontrollerades under mikroskopi för att bekräfta könet och förvarades sedan i etanol.
Musinfektion med cerkarier poolade från alla sniglar (metod I och II) och insamling av vuxna maskar
För efterföljande infektioner förblev 17 av 20 sniglar från grupp A och 16 av 25 sniglar från grupp B vid liv och kunde producera tillräckligt med cerkarier. Två olika metoder för att samla in cerkarier användes för de två grupperna av sniglar. För de 17 återstående sniglarna i grupp A samlades alla sniglar i en kolv med vatten för att stimulera framväxten av cerkarier (metod I). Trettioen möss infekterades sedan perkutant med 34 cerkarier per mus. För infektionen med 16 sniglar i grupp B samlades 2 cerkarier från varje snigel som avges individuellt, och de blandade 32 cerkarierna användes för att infektera en mus (metod II), med upprepning för att totalt infektera 22 möss. Alla möss offrades för att samla in S. japonicummaskar 7 veckor efter infektionen enligt beskrivningen ovan. Slutligen samlades 530 maskar från möss med metod I (grupp A), 484 maskar från möss med metod II (grupp B) in.
Miracidiainsamling
Innan alla infekterade möss offrades för att samla in vuxna maskar, samlades avföring från varje mus in under 7 dagar, för att koncentrera ägg som utsöndras genom tarmen för miracidiekläckning. Äggsediment från varje mus exponerades för deklorerat vatten i en kolv under ljus vid 25 °C för att kläcka miracidier. Miracidier skördades från det övre vattnet i varje kolv med en pipett och överfördes till en skål med tvättlösning för miracidier (5 g/l laktalbuminhydrolysat, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 och 0,20 g/l NaHCO3). Efter tre tvättar pipetterades miracidierna individuellt med 2 μl steriliserad tvättlösning på ett Whatman™ FTA-kort. Efter torkning förvarades kortet i en förseglad plastpåse i en exsickator i rumstemperatur. Minst 50 miracidier per musavföring samlades in.
Miracidier som kläckts från ägg som fångats i lever från infekterade möss samlades också in på följande sätt. Levern från varje infekterad mus samlades in efter insamling av vuxna maskar, homogeniserades i kallt 1,2 % NaCl och filtrerades för att få fram äggsedimentet. Miracidier kläcktes med samma metod som för avföringsprovet. Slutligen pipetterades minst 50 miracidier per muslever individuellt och förvarades på Whatman™ FTA-kort.
Genomisk DNA-extraktion
För DNA från ett enskilt cerkarie- eller miracidieprov avlägsnades en skiva med en diameter på 2 mm från mitten av varje pipetteringsområde för provet på ett Whatman™ FTA-kort med hjälp av en 2 mm Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Skivan placerades i botten av en 96 brunnar, 1,2 ml U-bottenplatta. Efter en tvätt med 100 μl FTA-reningsreagens (GE Healthcare Life Sciences) i 5 minuter följt av 100 μl TE-buffert (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) tillsattes 14 µ 0,1 M NaOH med 0,3 mM EDTA, pH 13,0, till varje brunn och lösningen lades i inkubation i 5 minuter, varefter 26 µl 0,1 M Tris-HCl-buffert, pH 7,0 tillsattes. Därefter blandades plattan genom att pulsera med en vortexblandare 3 gånger i ungefär 10 s vardera. Lösningen lämnades sedan i rumstemperatur i 10 min, pulsåtervirvlades 10 gånger och eluatet överfördes till en ren 96-hålsplatta och förvarades vid – 20 °C för vidare användning.
För enskilda vuxna maskar klipptes den främre delen, inklusive livmodern, bort under mikroskopi från varje vuxen honmask för att undvika att äggen i livmodern påverkar genotypen hos honmasken. Medan hela hanmaskar eller omogna honmaskar användes för DNA-extraktion. Det totala genomiska DNA:t extraherades individuellt från varje mask med hjälp av ett standardförfarande med natriumdodecylsulfat-proteinas K enligt följande. Varje mask inkuberades och tinades upp i 400 μl extraktionsbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS och 100 mg/ml proteinas K, vid 56 °C i 1 timme med försiktig blandning. DNA i lösningen extraherades med hjälp av standardrening med fenol/klorform, följt av 3 M natriumacetat (pH 5,2) och etanolutfällning. DNA-pellets tvättades i 70 % etanol, lufttorkades och resuspenderades i 20 μl TE (pH 8,0) och förvarades vid – 20 °C som rått DNA-extrakt från vuxen mask för vidare användning.
PCR-amplifiering och mikrosatellitgenotypning
För att bekräfta att genomiskt DNA fanns i FTA-kortets eluering eller i råextrakt från etanolförvarat prov amplifierades genfragmentet 28S ribosomalt DNA från DNA-lösningen från en enskild cerkarie, miracidium eller vuxen mask, med hjälp av följande primers: Framåt (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) och bakåt (5′-GCT CAA CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR-analyserna utfördes med hjälp av Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR-beads i en 96-väggsplatta (GE Healthcare Life Sciences, USA). För varje pärla tillsattes 2 µl FTA-eluering från en enskild larv eller 0,5 µl råextrakt från en enskild mask, med 1 µl av varje primer och vatten till en slutvolym på 25 µl. Amplifikationen genomfördes med följande program: 95 °C i 5 minuter, följt av 40 cykler med 30 sekunder vid 95 °C, 30 sekunder vid 60 °C och 40 sekunder vid 72 °C samt ett sista förlängningssteg vid 72 °C i 7 minuter. Reaktionerna kontrollerades sedan genom att 5 µl kördes på en TAE-gel med 2 % agaros.
Genotypning i liten skala utfördes för 30 cerkarier, 30 miracidier och 30 maskar som valdes slumpmässigt, för att konstruera en optimal panel av multiplexa mikrosatellitloci för PCR-amplifiering. Tjugo loci som utvecklats och validerats i tidigare studier och från vårt laboratorium kontrollerades. Slutligen valdes 9 mikrosatellitloci (Additional file 1: Table S1) ut för att bilda panelen. Mikrosatellitloci för varje DNA-prov genotypades med hjälp av Type-it Microsatellite PCR-kit (Qiagen, Manchester, Storbritannien) med multiplex av nio loci. Den framåtriktade primern i varje par märktes med ett lämpligt fluorescerande färgämne, inklusive 6-FAM, HEX, TAMRA och ROX (Additional file 1: Table S1). PCR-reaktionerna förbereddes i en PCR-platta med 96 brunnar med hjälp av 6,25 µl 2× master mix, 1,25 μl Q-lösning, 0,5 μl primers (10 μM), 2 μl DNA-mall och 2,5 μl ddH2O, som sedan utfördes i en Bio-Rad termocyklare med följande program: 95 °C i 5 minuter, följt av 35 cykler med 30 s vid 95 °C, 90 s vid 60 °C och 3 minuter vid 72 °C, följt av ett sista förlängningssteg vid 60 °C i 45 minuter. PCR-reaktionerna kontrollerades genom att 5 µl kördes på en 2 % TAE-agarosgel, och lyckade amplifieringar skickades till Sangon Biotech (Shanghai, Kina) för fragmentanalys på en genetisk analysator ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genotyperna bedömdes med hjälp av ett mikrosatellitplugin i Geneious 11.0 . Alla prover amplifierades och genotypades två gånger för att minska avvikelsen. Totalt genererades genotyper av 346 cerkarier, 701 vuxna maskar och 393 miracidier för följande analyser.
Analyser av genetisk mångfald
Den genetiska mångfalden för varje locus uppskattades i alla genotypade cerkarier genom att beräkna det observerade antalet alleler (Na), det effektiva antalet alleler (Ae) i GenAlEx 6.5 och allelrikedomen (Ar) och gendiversiteten (Hs) i hierfstat ver. 0.04-22 , inklusive 156 cerkarier från 20 sniglar i grupp A och 190 cerkarier från 25 sniglar i grupp B. Avvikelsen från Hardy-Weinberg-jämvikt (HWE) för varje locus testades med Chi-square-testet i GenAlEx, och testet för kopplingsdifferens mellan loci beräknades i SHEsis .
Na, Ae, Ar och Hs beräknades för olika populationer under infektionsprocessen av möss enligt följande. För de cerkariepopulationer som användes vid infektionen utvärderades 132 cerkarier från 17 sniglar i grupp A (som användes i metod I) och 122 cerkarier från 16 sniglar i grupp B (som användes i metod II). Efter genotypning och filtrering av data av låg kvalitet lyckades genotypning av minst fem par vuxna maskar (när de fanns) och alla oparade maskar från varje mus. Totalt 357 maskar från möss i metod I (med användning av cerkarier från 17 sammanslagna sniglar i grupp A) och 344 maskar från möss i metod II (med användning av lika blandade cerkarier från 16 enskilda sniglar i grupp B) ingick. Dessutom uppskattades den genetiska mångfalden av vuxna maskar i varje mus för att kontrollera den alleliska överensstämmelsen hos vuxna maskar bland möss i metod I och II separat. För miracidiepopulationer beräknades den genetiska mångfalden av miracidier från lever och avföring på överpopulationsnivå (miracidier från lever eller avföring från alla möss), eftersom endast 3-4 miracidier från lever eller avföring i varje mus genotypades, inklusive 93 miracidier från lever (3 per mus) och 124 miracidier från avföring (4 per mus) i metod I, och 88 miracidier från både lever och avföring (4 per mus separat) i metod II.
Analys av molekylär varians (AMOVA)
Den genetiska differentieringen av alla genotypade cerkarier från grupp A och grupp B uppskattades med hjälp av AMOVA i Arlequin ver. 3.5.2.2 . Efter att ha uteslutit sniglar som inte använts för infektion av möss testades differentieringen mellan 132 cerkarier från 17 sniglar i grupp A (för metod I) och 122 cerkarier från 16 sniglar i grupp B (för metod II). Efter infektion testades differentieringen mellan 357 vuxna maskar i metod I och den ursprungliga cerkariepopulationen (132 cerkarier från grupp A). Även de 344 maskarna i metod II testades mot de 122 cerkarierna från grupp B. Dessutom utvärderades variationen av vuxna maskarier bland 31 möss i metod I och vuxna maskarier bland 22 möss i metod II separat. För miracidier testades den genetiska differentieringen mellan 93 miracidier från lever och 124 miracidier från avföring i metod I, och samma sak för 88 miracidier från både lever och avföring i metod II.
Släktskapsanalys för singletoner av cerkarier med niMLGs
Antalet genotyper av cerkarier från varje snigel räknades. Eftersom det är svårt att skilja typningsfel eller somatisk mutation under sporocystförökning från den ursprungliga miracidiumgenotypen, identifierades en grupp cerkariegenotyper med färre än 2 mismatchade alleler som niMLGs och tilldelades en härstamning som härstammar från samma miracidium i varje snigel. Slutligen utvärderades antalet miracidier som etablerade genetiska kloner i varje snigel utifrån antalet linjer med hjälp av R-paketet allelematch ver. 2.5 .
Då cerkarier med niMLG i en snigel antogs härstamma från ett miracidium , tilldelades en av genotyperna (singleton) för niMLG att representera en grupp cerkarier som härstammade från ett miracidium med funktionen amCluster i allelematch, för att få fram det filtrerade datasetet för släktskapsanalysen mellan mirakarier. Därefter uppskattades släktskapet mellan singletons (miracidier) med hjälp av korrelationskoefficienten för allelstorlek (I′) enligt Streiff i SPAGeDi ver. 1.5a inom och mellan sniglar för 20 sniglar i grupp A och 25 sniglar i grupp B, för att ta reda på om det fanns en korrelation mellan en grupp av miracidier i en snigel och den genetiska likheten mellan miracidierna.
Allelfördelning för delmängder av cerkarier från olika antal sniglar
Den ojämna genetiska fördelningen av cerkarier bland sniglar innebär att provstorleken på snigelvärdarna skulle påverka allelfördelningen av cerkariernas suprapopulation (cerkarier från alla sniglar). Na, det grundläggande indexet för att indikera genmängden i en population, utvärderades vidare för varje lokus i olika delmängder av cerkarier genom att slumpmässigt välja ut olika antal sniglar. Sniglarna valdes ut slumpmässigt för varje givet antal sniglar, som ställdes in från 1 till maximalt antal i varje grupp med hjälp av basfunktionen sample i R, med 100 upprepningar. I varje upprepning fastställdes antalet cerkarier i varje snigel till 5, vilket bestämdes i enlighet med den praktiska genomförbarheten och det genomsnittliga antalet cerkarier som genotypats i varje snigel i denna studie. Cerkariernas genotyper för samma antal sniglar slogs samman, och Na uppskattades sedan för varje locus med funktionen nb.alleles i R-paketet hierfstat. Relativiteten mellan den genetiska mångfalden och antalet sniglar utvärderades genom att beräkna den minsta provstorleken av sniglar när 50 % och 95 % av den totala Na sattes.
Genetiskt avstånd mellan vuxna hon- och hanmaskar
För att upptäcka en potentiell genetisk preferens för S. japonicum under parning, mättes det interindividuella genetiska avståndet Dsw mellan hanen och honan i varje par hos enskilda möss med Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/) och jämfördes med det mellan den parade honan och oparade maskar (om tillgängligt, oparade är oftast hanar) i samma värd.
Paternitetsidentifiering för miracidier
Allelfrekvenserna för alla vuxna maskar och miracidier i varje mus analyserades och beräknades med hjälp av funktionen Allele Frequency Analysis i Cervus 3.0 . Alla 9 loci bedömdes slutligen som lämpliga markörer för vidare analys av släktskap med en kombinerad sannolikhet för att inte uteslutas på mindre än 0,01 %. Funktionen Simulation of Parentage Analysis tillämpades på grundval av allelfrekvensen för att uppskatta upplösningsförmågan hos kodominanta loci och kritiska värden för log-likelihood (LOD) med följande antaganden: 10 000 avkommor (miracidier) för varje enskild mus, 10 kandidatmödrar och -fäder i varje mus (uppskattad provstorlek enligt antalet vuxna maskar som samlats in i en värddjur), andelen kandidater sattes till 100 % av genotypade vuxna maskar, andra alternativ var standardinställda. Slutligen hänvisades båda resultaten från Allelfrekvensanalysen och Simulering av föräldraanalysen till modulen Föräldraanalys för att tilldela varje avkomma till dess mest sannolika föräldrar. De föräldrar som har mer än 2 alleler som inte stämmer överens med avkomman uteslöts, och de som hade den största LOD:n ansågs mest troliga som föräldrar.
Statistisk analys
Alla data som används i den statistiska analysen i den här studien är kontinuerliga data. Signifikansen av skillnaden på genetiska diversitetsindex (Na, Ae, Ar och Hs) för loci, släktskapskoefficient (I′) och interindividuellt genetiskt avstånd (Dsw) mellan två grupper utvärderades med signifikansnivån 0,05. Först kontrollerades datasetens normalfördelning med Sharpiro-Wilk-testet. Parvisa prov/oberoende t-test tillämpades sedan när datamängderna var normalfördelade. I annat fall tillämpades Wilcoxon signed-rank-testet och Mann-Whitney U-testet för de relaterade/oberoende proverna. Bonferroni-korrigering användes för att korrigera P-värdet vid flera jämförelser.