E-cadherin binder till desmoglein för att underlätta sammansättning av desmosomer
1) Denna artikel behandlar mekanismen för cadherin-medierad reglering av sammansättning av desmosomer. Även om granskarna håller med om att arbetet är potentiellt spännande, tog de upp flera viktiga frågor. För det första är alla överens om att modellen måste testas genom att undersöka samlokalisering i celler som uttrycker cadherinmutanten.
Vi tackar granskarna för att de föreslår dessa viktiga experiment. Som beskrivs i vårt detaljerade svar till granskarna har vi nu testat de olika Ecad-mutationernas roll när det gäller att hindra rekrytering av Dsg2 i keratinocyter. Vi uttryckte Ecad WT i full längd och Ecad-mutanter (L175D, K14E och W2A-K14E) i Ecad-knockout, Pcad-knockdown muskeratinocyter (EKO/PKD) och analyserade Dsg2-rekrytering till platser för intercellulära kontakter. Dessa resultat bekräftar att aminosyra L175 på Ecad, medierar Dsg2-interaktioner och underlättar tidig desmosomkomplexbildning i celler. Våra experiment avslöjar också att desmosomförening initieras vid platser för Ecad trans homodimerisering.
2) Det finns också farhågor om tillförlitligheten hos samlokaliseringsdata i figur 5. Det behövs en mer rigorös analys för att visa att samlokalisering av E-cadherin och desmoplakin förekommer i mycket större utsträckning än vad som skulle kunna förväntas av slumpen.
I fält identifieras desmosomerna genom storleken och järnvägsspårets utseende på DP-färgning i SIM-bilder. Som beskrivs i vårt svar till granskarna använde vi detta etablerade tillvägagångssätt för att lokalisera desmosomer. Dessutom betonar vi nu att vi inte mäter kolokalisering utan snarare rekryteringen av olika cadheriner (Ecad och Dsg) till områden av membranet som uppvisar detta mönster.
3) För det andra antar modelleringen att L175 utgör en del av gränssnittet, men utan bedömning av stökiometri kan det inte uteslutas att förlusten av bindning är en indirekt effekt av förlusten av cis-dimerisering. Modelleringen betraktas också som svag eftersom inga komplementära gränssnitt på Dsg2 testades. Utan sådana data måste den molekylära modelleringen betraktas som mycket spekulativ.
Som beskrivits i vårt detaljerade svar till granskarna visar tidigare beräkningssimuleringar och biofysiska experiment att Ecad cis-dimerbildning kräver föregående trans-dimerisering. Följaktligen kan Ecads inte binda till ytan som fristående, förbildade cis-dimerer. Detta gör det ytterst osannolikt att de uppmätta bindningsinteraktionerna sker mellan Ecads cis-dimerer och Dsg2. Vi håller dock med granskarna om att resultaten av den molekylära dockningen är ganska svaga. Vi har därför eliminerat dessa modelleringsresultat från manuskriptet.
4) Slutligen, som påpekats av recensent 3, även om de stöds av dessa tillägg, förklarar modellen och diskussionsavsnittet inte riktigt hur E-cadherin reglerar desmosomer.
Baserat på våra nya cellulära struktur-funktionsdata föreslår vi nu en modell där sammansättningen av desmosomerna underlättas både av de direkta cis-interaktionerna mellan Ecad och Dsg2 och trans-bindningen av motsatt Ecad. I vår modell fungerar trans-homodimeriseringen av Ecad från motsatta celler som en rumslig ledtråd för att samordna desmosomernas sammansättning. Ecad bildar därefter cis-dimerkomplex med Dsg2 för att initiera desmosomföreningen. Modellen presenteras och diskuteras i det nya manuskriptet.
Reviewer #1:
1) AFM-experimenten med enmolekylära AFM-experiment är den mest solida delen av artikeln. När jag läser författarna utesluter de dock inte möjligheten att de bindningshändelser de observerar kan bero på interaktioner mellan förbildade E-cadherin cis-dimerer. Stökiometrin för interaktionen är viktig att fastställa, eftersom om bindning till Dsg2 involverade krävde en E-cadherin cis-dimer, skulle det ändra tolkningen av resultatet att L175D-mutationen blockerar Dsg2/E-cad-interaktionen. Ett sådant scenario skulle också ifrågasätta giltigheten av dockningssimuleringarna. Enligt min tolkning är den låga sannolikheten för bindning per kontakt mellan AFM-spetsen och ytan ett svagt bevis för att bindningen nödvändigtvis återspeglar interaktionen mellan två monomerer, och det är inte heller den låga genomsnittliga tätheten av cadherinmolekyler på ytan. Vidare är cadherinerna immobiliserade med streptavidin, som har flera biotinbindningsställen.
Av dessa skäl anser jag att det är viktigt att bevisa att heterodimerisering sker mellan monomerer. För att göra detta skulle jag rekommendera att systematiskt mäta spetsens interaktionssannolikhet med ytan som en funktion av den areella yttätheten av E-cadherin på täckglasytan. Om interaktionen verkligen kräver monomeriskt E-cadherin bör denna mätning skala linjärt med tillsatt E-cadherin, åtminstone vid låga densiteter. Denna specifika mätning är dock inte nödvändig – vilken mätning som helst som fastställer stökiometrin duger.
Förra datorsimuleringar (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) har visat att Ecad cis-homodimerisering kräver föregående Ecad trans-dimerbildning. På samma sätt har tidigare FRET-mätningar av enstaka molekyler visat att det inte är möjligt att bilda fristående Ecad cis-dimerer, även när Ecad-monomerer placeras nära varandra i cis-orientering (Zhang et al., 2009). Sammantaget tyder dessa resultat på att Ecads i våra experiment inte kan immobiliseras på AFM-spetsen eller substratet som förbildade cis-dimerer. Följaktligen beror Ecad-L175D-mutantens misslyckande att interagera med Dsg2 inte på avsaknaden av Ecads cis-dimerisering. Vi diskuterar nu detta i underavsnittet ”Leu 175 mediates Ecad and Dsg2 interactions” i manuskriptet.
Tyvärr tillåter tekniska begränsningar inte det proteinstökiometriexperiment som recensenten föreslår. I våra experiment använder vi proteinytetätheter som gör det möjligt för oss att entydigt identifiera enskilda bindningshändelser från motsvarande sträckning av PEG-tetrar. Om cadherinytans täthet ökas, som recensenten föreslår, ökar sannolikheten för samtidiga flera Ecad-bindningshändelser, vilket gör en kvantitativ analys av sannolikheten för proteinbindning otillförlitlig. Av denna anledning (tillsammans med den inneboende svagheten i vår dockningsanalys) har vi uteslutit proteinodlingssimuleringarna från manuskriptet.
Slutligt, i det reviderade manuskriptet, använder vi nu klusteranalys för att gruppera de enskilda molekylära lossningshändelserna för dynamisk kraftspektroskopi (DFS). Vi har nyligen visat att den K-means klusteralgoritm som vi använde, kraftigt förbättrar uppskattningen av kinetiska parametrar i DFS (Yen och Sivasankar, 2018). Följaktligen är de livslängder som vi nu rapporterar för Ecad/Dsg2-, Dsc2/Dsg2- och Dsc2/Dsc2-interaktioner mer tillförlitliga.
2) Dockningssimuleringarna är intressanta, men ger enligt min mening svaga bevis för den specifika bindningsgeometri som författarna föreslår. Jag rekommenderar starkt att författarna är mer försiktiga i tolkningen och presentationen av dessa resultat, eller alternativt presenterar ytterligare data, t.ex. EM-bilder, som stöder eller motbevisar beräkningsresultatet.
Vi håller med recensenten om att data från proteindockningen är svaga. Vi har därför eliminerat dessa resultat från manuskriptet.
3) Tyvärr är SIM-bilderna inte övertygande som de nu presenteras. I synnerhet är det inte tydligt vad som räknas som en ”desmosom” i författarnas analys (figur 5B). Det skulle krävas en mer sofistikerad behandling av kolokalisering för att fastställa poängen att E-cadherin och desmoplakin kolokaliserar och att denna kolokalisering minskar när korsningarna mognar.
I tidigare studier (Stahley et al., 2016a, 2016b) har vi utnyttjat DP:s ”järnvägsspår”-utseende, vilket avslöjas av superupplösande avbildning, för att definiera desmosomer med immunofluorescens (som visas i figur 3A). Andra inom området har också använt ”järnvägsspår”-morfologi för att identifiera desmosomer i SIM-bilder (se t.ex: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). Storleken och organisationen av dessa strukturer, som avslöjas av SIM, är helt i överensstämmelse med klassiska EM-definitioner av desmosomer. Vi mätte pixelintensiteten för de två cadherinerna (Ecad eller Dsg2) inom dessa strukturer med hjälp av standardiserad bildanalys. Viktigt är att vi inte försöker hävda samlokalisering. Snarare mäter vi rekrytering av cadherin till membran domäner som uppvisar DP rail road track färgningsmönster. Vi inser att det ibland är svårt att urskilja järnvägsspår vid tidiga tidpunkter. Av denna anledning var den tidigaste tidpunkt som vi ansåg att vi kunde identifiera bona fine rail road track staining vid 1 timme. Dessutom gör vi bara mätningar på platser där vi kan observera spårmönster, snarare än DP-punkter. Slutligen stämmer vårt resultat att Ecad finns i framväxande desmosomer överens med klassiska immun-EM-experiment som visar att Ecad kan lokaliseras till desmosomer (Jones, 1988). Därför känner vi oss säkra på vår förmåga att identifiera desmosomer och mäta relativa nivåer av de två cadherinerna vid olika tidpunkter.
4) Jag överlåter denna sista punkt till redaktören. Enligt min åsikt fastställer kolokaliseringsdata, även om de tas för sanna, inte funktionell relevans. Det skulle vara mycket trevligt att se ett knockdown/rekonstitutionsförsök med L175D E-cadherin. Prediktionen är att denna molekyl aldrig skulle kolokalisera med desmoplakin, oavsett ålder på korsningen. Ett brott mot denna förutsägelse skulle kasta tvivel på författarnas favoriserade modell.
Baserat på recensentens förslag har vi nu utfört experiment för att direkt testa rollen för de olika Ecad extracellulära domänmutationerna när det gäller att hindra rekrytering av DP och Dsg2 i keratinocyter. Dessa data beskrivs i underavsnittet ”Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly”. Motsvarande bilder visas i figur 5 och i figur 5-figurtillägg 1. De metoder som användes beskrivs i avsnittet ”Isolering, odling, transfektion och konfokal avbildning av primära keratinocyter”. För dessa experiment använde vi EKO/PKD-muskeratinocyter, som praktiskt taget inte uttrycker några klassiska cadheriner. Vi har tidigare visat att dessa EKO/PKD-keratinocyter inte kan samla AJs och desmosomer på grund av förlusten av alla klassiska cadheriner (Michels et al., 2009). Dessa celler gör det således möjligt för oss att direkt bedöma Ecad-mutanternas förmåga att i) initiera AJ-bildning och ii) bedöma deras förmåga att rekrytera desmosomala komponenter till platser där den första cellcellskontakten bildas.
Då vi var intresserade av att bedöma Ecad-mutanternas förmåga att rekrytera desmosomala proteiner tidigt under bildandet av korsningar, uttryckte vi antingen Ecad WT i full längd eller mutanter i EKO/PKD-keratinocyter och analyserade DP- och Dsg2-rekrytering till ställen för intercellulära kontakter med hjälp av konfokalmikroskopi. För att undersöka rekryteringen vid olika stadier av korsningsbildning och mognad fixerades keratinocyter och immunfärgades för DP, Dsg och Ecad vid tre tidpunkter efter Ca2+-omkopplingen (3 timmar, 6 timmar och 18 timmar).
Våra data visade att 3 timmar efter Ca2+-omkopplingen var 93 % av WT-Ecad anrikad i blixtlåsliknande tidiga AJ:er vid platser för intercellulära kontakter. Däremot bildade endast 48 % av L175D-Ecad transfekterade keratinocyter AJ-blixtlås, sannolikt på grund av försämrad Ecad cis-dimerbildning (figur 5 A, B). Vid dessa tidiga tidpunkter efter Ca2+-omkopplingen var 66 % och 91 % av WT-Ecad-zipperkontakterna positiva för Dsg2 respektive DP (figur 5 A, C, D, E). När cellerna tilläts engagera sig i Ca2+ -beroende intercellulär vidhäftning i 18 timmar ökade de junktionella lokaliseringarna av Ecad-Dsg2 och Ecad-DP till 97 % respektive 100 % (figur 5 A, C, D, E). Däremot visade endast 39 % av L175-inducerade zipperkontakter Dsg2-rekrytering 3 timmar efter byte till högt Ca2+ vilket ökade till 65 % vid 18 timmar (figur 5 A, C), vilket bekräftar att en direkt interaktion mellan Ecad och Dsg2 krävs för effektiv rekrytering av Dsg2 till tidiga intercellulära kontakter. På samma sätt var endast 28 % av L175D-Ecad-mutantens etablerade intercellulära kontakter positiva för DP efter 3 timmar, vilket ökade till 72 % efter 18 timmar, vilket tyder på en kompensatorisk mekanism i senare skeden (figur 5 D, E).
För att bekräfta att den observerade effekten av L175D-mutationen inte berodde på hindrad AJ-bildning transfekterade vi EKO/PKD-keratinocyterna med Ecad-K14E-mutanten i full längd som avskaffar X-dimerbildningen och fångar Ecad i en strängbytesdimerkonformation. Våra data visade att endast 4 % av de transfekterade kontaktcellerna bildade dragkedjor vid tidiga (3 timmar) tidpunkter efter att ha bytt till högt Ca2+ med endast 24 % av de transfekterade kontaktcellerna som uppvisade dragkedjor vid sena (18 timmar) tidpunkter (figur 5 A, B, figur 5-figurtillägg 1), vilket bekräftar att K14 är nödvändig för effektiv AJ-bildning och därmed för att etablera intercellulär kontakt. De få K14E AJ:er som bildades rekryterade dock Dsg2, och särskilt DP, mer effektivt än L175D (figur 5 A, C, E, figur 5-figurtillägg 1). Detta resultat bekräftade att den försenade rekryteringen av Dsg2 till intercellulära kontakter inte berodde på Ecad L175D:s oförmåga att effektivt bilda AJ:er utan snarare på avsaknaden av direkt interaktion mellan Ecad och Dsg2. Eftersom det aldrig förekom någon samlokalisering av DP och Ecad i avsaknad av dragkedjor (figur 5-figurtillägg 1), tyder data också på att Ecad trans-interaktioner föregår Ecad/Dsg2-interaktioner. Denna slutsats stärks ytterligare av vår upptäckt att ingen DP-rekrytering observerades vid upphävande av Ecad trans-adhesion, och därmed zippers, genom att transfektera Ecad-DM i full längd (W2A-K14E dubbelmutant, figur 5-figure supplement 1) i EKO/PKD keratinocyter. Sammantaget bekräftar dessa resultat att aminosyran L175 medierar Dsg2-interaktioner och underlättar tidig desmosomkomplexbildning i celler.
Reviewer #2:
1) Upptäckten att E-cadherinrest L175 är kritisk för interaktion med Dsg2 är spännande. Inga interagerande partnerrester har dock identifierats. Under denna omständighet verkar det osäkert att förutsäga en konformation för E-cadherin/Dsg2-interaktion genom dockning; det verkar osäkert att den förutsagda konformationen relaterar till den sanna bundna konformationen.
Vi håller med recensenten om att data om proteindockning är spekulativa och har därför eliminerat dessa resultat från manuskriptet.
2) Det finns endast en svag koppling den föreslagna Dsg2/E-cadherin-interaktionen till biologin för desmosomernas sammansättning. Ändå verkar författarna ha en tydlig väg framåt. De hävdar att närvaron av E-cadherin i desmosomerna som håller på att växa fram (experimentellt bedömd genom samfärgning för desmoplakin i figur 5) är ett bevis för den roll som Dsg2/E-cadherin-associationen som de har identifierat spelar. Nu när de har identifierat en mutant som förhindrar denna förening bör experimenten i figur 5 som utförs med mutanten leda till andra resultat. Detta experiment skulle väsentligt öka stringensen i denna artikel.
Som beskrivet i svar 4 till recensent 1, uttryckte vi Ecad WT i full längd och Ecad-mutanter i EKO/PKD keratinocyter och analyserade Dsg2- och DP-rekrytering till platser för intercellulära kontakter. Dessa resultat bekräftar att aminosyran L175 medierar Dsg2-interaktioner och underlättar tidig desmosomkomplexbildning i celler. Dessa data beskrivs i underavsnittet ”Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly” i manuskriptet. Motsvarande bilder visas i figur 5 och i figur 5-figurtillägg 1. De använda metoderna beskrivs i underavsnittet ”Isolation, culture, transfection and confocal imaging of primary keratinocytes”.
Reviewer #3:
1) Detta manuskript identifierar och karakteriserar en molekylär interaktion mellan E-cadherin och Desmoglein 2 med hjälp av isolerade proteiner och visar en ökad kolokalisering mellan dessa två molekyler i keratinocyter tidigt under desmosomassammansättning. Detta är potentiellt mycket intressanta observationer som kan förklara hur klassiska cadheriner kontrollerar sammansättningen av desmosomer. Även om detta är väl dokumenterat av flera grupper i litteraturen är de underliggande mekanismerna fortfarande mestadels okända. Deras slutsats ”Our integrated single molecule experiments, protein-protein docking predictions and cell based super resolution imaging show that Ecad/Dsg2 interactions play an important role in early desmosome assembly” som anges i början av diskussionsavsnittet är dock en ganska kraftig överdrift med tanke på att interaktionen bygger på karakterisering på isolerade extracellulära domäner och statisk om än högupplöst mikroskopi. Inget experiment görs för att visa att när man stör denna interaktion försämras verkligen desmosomuppbyggnaden, vilket enligt min åsikt skulle vara det minsta för att göra denna uppsättning data riktigt intressant och relevant för en bred publik.
Som beskrivet i svar 4 till recensent 1 har vi nu uttryckt Ecad WT i full längd och Ecad-mutanter i EKO/PKD keratinocyter och visat att aminosyran L175 medierar Dsg2-interaktioner och underlättar tidig desmosombildning i cellerna, vilket bedöms genom DP-rekrytering. Dessa data beskrivs i avsnittet ”Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly” i manuskriptet. Motsvarande bilder visas i figur 5 och i figur 5-figurtillägg 1. De använda metoderna beskrivs i underavsnittet ”Isolation, culture, transfection and confocal imaging of primary keratinocytes”.
2) Också mot bakgrund av att interaktionen är kalciumoberoende medan klassisk cadherinberoende tidig desmosommontering kräver närvaron av kalcium (vilket inte diskuteras överhuvudtaget).
Vi tackar recensenten för denna insiktsfulla kommentar. Som beskrivs i underavsnittet ”Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly”, avslöjar konfokal avbildning av muterad Ecad som uttrycks i muskeratinocyter nu att desmosomassammansättning initieras vid platser för Ca2+ -beroende Ecad trans homodimerisering. Baserat på våra data föreslår vi en modell där sammansättning av desmosomer underlättas både av direkta cis-interaktioner mellan Ecad och Dsg2 och trans-bindning av motsatt Ecad. I vår modell fungerar transhomodimeriseringen av Ecad från motsatta celler som en rumslig ledtråd för att samordna desmosomernas sammansättning. Ecad bildar därefter cis-dimerkomplex med Dsg2. När Dsg2 väl är lokaliserad i den ursprungliga desmosomen dissocieras den från Ecad och binder till Dsc2 för att bilda mogna desmosomer. Eftersom Dsc2/Dsg2-komplexet har en längre livslängd än både Ecad/Dsg2-komplexet och Dsc2/Dsc2-komplexet, möjliggör detta troligen robust cellcellsadhesion och gör det möjligt för den mogna desmosomen att motstå mekanisk kraft. Denna modell beskrivs i figur 6 och i avsnittet Diskussion.
3) Eftersom detta är en helt ny interaktion med låg affinitet är det förmodligen svårt att göra några interaktionsanalyser i samband med celler där den ena cellen uttrycker E-cadherin och den andra Dsg2 för att undersöka om det finns någon interaktion. Men eftersom deras data delvis bygger på modellering bör författarna också generera en mutant där A125 och A124 är muterade för att ge mycket bättre bevis för existensen av den föreslagna y-dimeren.
Då resultaten av proteindockningen inte är robusta har vi nu eliminerat dessa data från manuskriptet. Våra experiment med EKO/PKD keratinocyter som visar att mutation av aminosyran L175 på Ecad försämrar rekryteringen av Dgs2 och särskilt DP till platser för tidig kontaktbildning, visar dock att Ecad-L175 underlättar desmosombildningen i cellerna, vilket bekräftar våra biofysikaliska resultat.
Sammanfattning:
Recensenterna anser att även om de biofysikaliska uppgifterna är övertygande, så krävs det en mer rigorös kvantitativ analys för att stödja slutsatserna som dras från uppgifterna i figurerna 3 och 5. I princip kan dessa problem åtgärdas med ytterligare dataanalyser snarare än experiment, och i detta fall skulle vi överväga ett reviderat manuskript.
Vi tackar redaktören för denna uppmuntrande granskning. Som beskrivs nedan tar vårt reviderade manuskript upp alla de framhävda frågorna.
1) Slutsatsen att E-cadherin-Dsg-interaktionen behövs för den initiala desmosombildningen bygger på att kolokaliseringen av Dsg och E-cadherin minskar när korsningen mognar. I figur 3 är det dock inte tydligt om den observerade kolokaliseringen med DP är signifikant utöver vad som förväntas av slumpen eller om den härrör från tidsberoende förändringar i E-cadherins subcellulära lokalisering som är orelaterade till korsningens mognad. I figur 3C belyser kontrollexperiment som visas i den högra panelen samlokalisering av Dsg2 och DP – kända Desmosomkomponenter – och visar en nära överensstämmelse i fluorescenssignaler vid alla tre tidpunkterna. Medan uttrycket av E-cadherin och DP i de vänstra panelerna däremot verkar överlappa varandra i viss utsträckning, visar de inte den korrespondens i signalerna som observerades för kontrollexperimenten. Svaret på de ursprungliga granskningspunkterna i detta ämne (t.ex. granskare 1, punkt 3) fokuserar på att definiera en desmosom, men tar inte upp ovanstående punkt.
Vi vill förtydliga att vi inte mäter samlokalisering utan i stället rekryteringen av antingen Ecad eller Dsg2 till områden av membranet som uppvisar DP:s ”järnvägsspår”-mönster. För att göra detta tydligare har vi nu ändrat det reviderade manuskriptet för att betona att Ecad är ”berikad i begynnande desmosomer” snarare än att vara ”utesluten från mogna desmosomer”.
För att direkt bemöta granskarens farhågor om vår mätning av Ecad-anrikning i desmosomer visar vi nu att de relativa nivåerna av Ecad längs hela cellgränsen (Ecad:DP-förhållandet vid cellgränserna) förblir oförändrade över tid. Dessa data bekräftar att Ecad-anrikningen inom DP-spår vid tidiga tidpunkter är specifik för desmosomala områden av membranet och är signifikant utöver vad som förväntas av en slumpmässig slump eller på grund av förändringar i E-cadherinlokaliseringen som inte är relaterade till korsningsmognad. Data visas i figur 3-figurtillägg 1 och beskrivs i underavsnittet ”Ecad is present in nascent desmosomes but not in mature desmosomes”.
Finally, since the line-scans shown in Figure 3 were confusing, we have eliminated the line-scans from the revised manuscript. I stället visar vi nu i figur 3B flera representativa bilder av desmosomala regioner i mänskliga keratinocyter som odlats i media med högt Ca2+ i 1, 3 eller 18 timmar. Dessa resultat understryker det viktigaste ”take-away”-budskapet i figur 3C: Ecad-nivåerna är berikade i begynnande desmosomer, med relativa nivåer som minskar när desmosomerna mognar.
2) Liknande farhågor väcktes angående figur 5, som ska visa att Ecad L175 är nödvändig för effektiv intercellulär Dsg2-rekrytering och desmosomassammansättning. Bilderna i panel A visar verkligen en dramatisk skillnad i Dsg2- och DP-lokalisering i förhållande till WT- eller mutantcadherin. Medan Dsg2 och DP samlokaliseras med WT eller K14E Ecad vid korsningar, förblir de i separata punkter som flankerar L175D Ecad-korsningen och samlokaliseras inte med den. Det är dock oklart vad författarna kvantifierade för att testa betydelsen av denna fenotyp. I B, vad är ”% av korsningen som bildar kontakter”? Hur definieras en kontakt? Vilka korsningar mäter de? AJ eller desmosomer? I C och E, vad menar de med % Dsg2- eller DP-positiva junctions? Hur definierades korsningar?
Vi har nu lagt till en figurpanel (figur 5-figurtillägg 1A) för att illustrera de kvantifieringskriterier och korsningskategorier som användes i vår analys. Denna panel visar exempel på celler som transfekterats med Ecad-mutant som inte (vänster panel) eller som (höger panel) visar intercellulär AJ-bildning. För Dsg2- eller DP-rekrytering kvantifierade vi endast de intercellulära gränssnitt där AJ-blixtlås observerades. I insatserna i figurpanelen visar vi exempel på AJ-positiva kontakter som antingen är positiva för DP eller negativa för DP.
I underavsnittet ”Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly” i manuskriptet anger vi nu att transfekterade keratinocyters förmåga att bilda AJ:er först bedömdes genom att det bildades ”blixtlåsliknande” Ecad-mönster vid intercellulära kontakter. Vi har tidigare visat att dessa blixtlås representerar tidiga AJs och rekryterar AJ-markörproteiner som vinculin (Rübsam et al., 2017). Vi undersökte endast intercellulära gränssnitt med AJ-zippers, för deras förmåga att rekrytera Dsg2 och DP till dessa kontakter. Viktigt är att vi aldrig har observerat någon anrikning av desmosomala komponenter vid intercellulära kontakter i avsaknad av AJ-blixtlås (Michels et al., 2009).
Som beskrivet i svar 3a nedan diskuterar vi nu i avsnittet Diskussion att även om Dsg2 och DP visar en viss samlokalisering vid Ecad-positiva blixtlås inom 3 timmar, så finns det också en icke överlappande färgning av korsningspunkterna, vilket tyder på att AJ:s och desmosomerna redan börjar segregera i separata intercellulära korsningar. Vi kvantifierade inte denna samlokalisering i vårt manuskript, eftersom huvudpoängen med våra experiment var att visa L175:s relevans för att rekrytera Dsg2 till intercellulära gränssnitt och underlätta desmosombildning (vilket illustreras av DP-rekrytering till intercellulära kontakter). Vi anser att fördröjningen i rekrytering mellan WT, L175-mutanten och K14-mutanten, som kvantifieras i figur 5, illustrerar denna punkt.
3) Det finns också ändringar i avsnittet Introduktion och diskussion som behövs för att ta itu med punkterna ovan samt tillgängligheten till artikeln:
a) Relaterat till vara punkter ovan, kopplingen mellan in vitro-bindningsexperiment och den föreslagna biologiska rollen verkar svag baserat på lokaliseringsstudier som avslöjar överlappande men inte verkligt samlokaliserade färgningsmönster. Författarna måste förklara detta fynd; kanske är samlokaliseringen dynamisk och/eller är endast en delmängd av E-cadherinmolekylerna bundna till Dsg2. Denna punkt behöver åtminstone diskuteras för att rationalisera resultaten av lokaliseringsexperimenten med den föreslagna modellen.
På grund av Ecad/Dsg2-interaktionernas övergående karaktär förväntas desmosomala proteiner som rekryteras till korsningar snabbt separeras från Ecad. Följaktligen förväntas bilder av intercellulära gränsytor ha både överlappande och separata färgningsmönster för Ecad och desmosomala proteiner. I överensstämmelse med detta, även om Dsg2 och DP visar en viss samlokalisering vid Ecad-positiva dragkedjor (figur 5), observeras en betydande icke överlappande färgning av korsningar, även inom de första tre timmarna. Detta tyder på att AJs och desmosomer snabbt segregeras till distinkta intercellulära junktioner. Vi anger nu detta i avsnittet Diskussion.
b) I början av avsnittet Diskussion hävdar författarna att de: ”identifierar två kritiska händelser som initierar och främjar en effektiv desmosomassammansättning: (i) stabil transhomodimerisering av Ecad, och (ii) den direkta heterofila bindningen av Ecad och Dsg2 ektodomäner. Våra data visar att sammansättningen av desmosomerna inleds på platser där Ecad transhomodimeriseras. Därefter binder Ecad och Dsg2 via en bevarad Leu 175 på Ecads cis-bindningsgränssnitt och bildar kortlivade heterofila komplex som lokaliseras till tidiga desmosomer och effektivt rekryterar desmosomala proteiner till platser där intercellulära kontakter bildas. När desmosomerna mognar dissocieras Dsg2 från Ecad och bildar stabila bindningar med Dsc2 för att förmedla robust vidhäftning.” – Detta stycke blandar observationer, tolkningar och hypotetiska modeller och är som sådant missvisande. De bör separera sammanfattningen av resultat från tolkning och deras modell.
Som föreslagits av granskarna har vi eliminerat tolkningarna från det första stycket i avsnittet Diskussion och sammanfattar nu endast resultaten.
c) Författarna skriver i abstrakt och introduktion ”Ecad interagerar med Dsg2 via en bevarad Leu 175 på Ecad cis-bindningsgränssnittet”. – Författarna bör inte anta att läsarna är bekanta med E-cad homofila interaktioner och bör förklara detta explicit.
I sammanfattningen står det nu: ”Tidigare studier visar att E-cadherin (Ecad), ett adhesivt protein som interagerar i både trans- och ciskonformationer, underlättar desmosomassammansättning via en okänd mekanism.”
I inledningen står det dessutom nu: Eftersom Ecad interagerar lateralt för att bilda cis-dimerer på samma cellyta (Harrison et al., 2011) medan Ecad-molekyler från motsatta celler interagerar i en trans-sträng-swap dimer-konformation (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2002), 2007; Vendome et al., 2011) och en trans X-dimerkonformation (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010) använde vi mutanter som specifikt upphäver antingen Ecads trans- eller cis-interaktioner och testade deras bindning till antingen Dsg2 eller Dsc2′. Slutligen, i inledningen, anger vi nu att ”Tidigare strukturella studier har visat att L175 medierar homofil Ecad cis dimerisering (Harrison et al., 2011)”.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013