Framställning av humant albumin hos grisar genom CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Human serumalbumin (HSA) är det vanligaste plasmaproteinet som har kritiska homeostatiska funktioner i människans fysiologi, bland annat upprätthållandet av det onkotiska trycket i plasma, reglering av distributionen av kroppsvätskor, transport av små molekyler etc1. Det förskrivs vid ett antal allvarliga sjukdomar som t.ex. leversvikt och traumatisk chock2. På grund av bristen på mänskligt blod och de risker som är förknippade med mänskligt blod har man länge sökt efter alternativ produktion av humant albumin. Rekombinant HSA-produktion har tidigare försökts hos grisar genom dominant transgenuttryck i form av albumin-GFP-fusion3. Vid transgena metoder är det dock problematiskt att separera och rena rHSA på grund av förekomsten av endogent albumin från svin. Genom att utnyttja CRISPR/Cas9-systemets förmåga att modifiera arvsmassan försökte vi framställa rHSA hos grisar genom att slå in humant albumin cDNA i grisarnas albuminlocus. Genom att infoga humant ALB cDNA plus SV40 polyA-signalssekvensen (totalt 2368 bp) i grisens Alb-lokus omedelbart nedströms startkoden förväntar vi oss att humant ALB kommer att uttryckas under grisens endogena albumin transkriptionskontroll och samtidigt blockera uttrycket av grisens endogena albumin (fig. 1a). Vi utformade ett sgRNA som är riktat mot startkodonregionen (omedelbart 5′ av och inklusive ATG) och genererade ett målfragment (donator för homolog rekombination) med insatsen flankerad av 1 kb homologisekvenser på båda sidor (fig. 1a). Eftersom den 5′-homologsekvens som används i donatorn löper fram till startkodonet innehåller den sgRNA-sekvensen och kan därför vara måltavla för sgRNA som donator eller för knockin-allelen efter homolog rekombination. För att förhindra detta har vi infört 6 bp (gccacc) i sgRNA-sekvensen precis före startkodonet. sgRNA transkriberades in vitro, renades och injicerades i de befruktade oocyterna tillsammans med Cas9 mRNA4 och den cirkulära vektorn som innehåller målfragmentet. Källan till oocyter var Bama minipig5. De injicerade embryona odlades i 1-2 timmar innan de implanterades i brunstsynkroniserade honor. ~300 embryon implanterades i 10 honor varav 5 blev dräktiga och födde totalt 16 levande valpar. Valparna fick standardvård och visade inga tecken på ovanliga hälsoproblem.
Knockin av humant ALB till svinets Alb locus.
(a) Schematisk bild av knockin-strategin. (b) Genotypning av grundarna. PRC-primers illustreras i (a). (c) Sekvenseringsresultat av de PCR-produkter som erhållits med primerparet e/f (a). Produkterna klonades och upp till 12 kloner (för #9) sekvenserades.
Vi klippte öronspetsarna av de 16 smågrisarna när de var cirka 4 veckor gamla och erhöll genomiskt DNA för genotypning. För att avgöra om vi hade lyckats med knockin bedömde vi både 5′- och 3′-änden av insättningsstället. Vi använde två primerpar, a/b och c/d (fig. 1a). Primer a är utanför 5′-ändan av den homologi som användes och b är på human ALB (insatsen); c är på human ALB och d utanför 3′-ändan av homologin. Som framgår av figur 1b har alla 16 smågrisar den avsedda knockin-allelen. Vi klonade och sekvenserade alla amplifierade DNA-fragment. De var de förväntade homologa rekombinationsprodukterna (fig. S1). Därefter fastställde vi vildtypsallelens status hos dessa smågrisar. Primerna e och f (som ingår i inslaget) (fig. 1a) bör amplifiera ett fragment på 705 bp från vildtypslocus och ett fragment på 3085 bp från knockin-allelen. Som förväntat genererade alla dem 3085 bp-fragmentet. Oväntat nog kunde vi dock få fram det uppenbara 705 bp-fragmentet från vildtypen från endast 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 och 15) av de 16 proverna, medan resten genererade svaga produkter runt 700 bp (fig. 1b). Den uppenbara avsaknaden av wildtype-allelen hos vissa smågrisar tyder på att knockin kan ha skett på båda allelerna. Alternativt kan vildtypsallelen ha redigerats på ett sådant sätt att primer a-sekvensen har tagits bort, vilket leder till att vildtypsallelen inte kan amplifieras. Det var faktiskt så att redigering av vildtypsallelen skedde eftersom storleken på de amplifierade fragmenten skiljde sig från de förutspådda 705 bp hos vissa smågrisar (fig. 1b). För att bekräfta detta klonade och sekvenserade vi alla amplifierade fragment. Som framgår av fig. 1c redigerades alla, även om vissa bara hade några få baspars förändringar (därför verkade de vara på 705 bp). Bland dessa redigerade alleler är de som hittades hos smågris #10 och #12 av intresse. Den i #10 var resultatet av att en sträcka på 29 bp (från ATG till 3′-slutet) av grissekvensen ersattes med 36 bp (6 bp 5′ från ATG och 26 bp efteråt) av donatorsekvensen. Det är oklart hur detta skedde. I #12 finns det två olika redigerade alleler, vilket innebär att det totala antalet alleler uppgår till tre, vilket tyder på mosaikism hos denna smågris, vilket inte är ovanligt eftersom mosaikism ofta har hittats hos djur som genererats genom injektion av Cas9/sgRNA6,7,8,9,10 i zygoter.
För att avgöra om off-targeting hade inträffat med sgRNA:t valde vi fyra topppotentiella off-targetingplatser baserat på förslag från CRISPR-designverktyget (http://tools.genome-engineering.org) och amplifierade fragment som innehöll dessa platser från öronspetsens genomiska DNA från smågris nr 14. Fragmenten utsattes för T4EN I-analys4. Som framgår av figur S2 hittades ingen redigering utanför måltavlan. Vi kunde dock inte utesluta möjligheten att off-target-redigering skedde i andra loci eller hos de övriga 15 transgena grisarna. Trots detta är det osannolikt att de redigerade loci, även om det förekom off-target-redigering, skulle vara problematiska för vårt syfte att producera rHSA, så länge de inte stör välfärden hos dessa transgena grisar.
När vi hade visat att vi lyckats knockinera den mänskliga ALB, försökte vi fastställa om humant albumin kunde detekteras i blodplasman hos dessa knockinade smågrisar. Som framgår av figur 2a innehöll alla smågrisar humant albumin i sin blodplasma som kunde påvisas med de antikroppar som var specifika mot humant albumin, om än i varierande nivåer, vilket sannolikt är ett resultat av minst två faktorer, huruvida båda allelerna är knockin och omfattningen av mosaikism (särskilt i levern). Nivån i nr 7 är mycket låg och syns först efter lång exponering av blottet, trots den uppenbara avsaknaden av vildtypen av grisen Alb-allelen (fig. 1a). Generellt sett är nivåerna mycket lägre än i serum från vuxna människor. Det är känt att koncentrationen av blodalbumin hos grisar ökar med åldern och når en nivå som liknar den hos vuxna människor vid 6 månaders ålder11.
Analys av humant ALB i blodet.
(a) Western blot-detektion av humant albumin i blodet hos grundläggningsgrisar. 0,5 μl plasma från varje grundare separerades på SDS-PAGE och analyserades. Plasma från mänskligt blod (0,5 μl efter spädning 30 gånger) användes som positiv kontroll. C, plasma från en vildtypgris. (b) Illustration av tryptiska peptider (grönt) som detekterats med mass-spec-analys. (c) Semikvantifiering av två tryptiska peptider från albumin från människa och gris genom att mäta toppområdena för varje peptid. Rött markerar de aminosyrarester som är specifika för gris.
För att bekräfta att den rHSA som upptäcktes i plasman hos våra knockin-grisar med antikroppar verkligen är humant albumin, utsatte vi två plasmaprover (gris 2 och 6) för masspektralanalys. #2 är uppenbarligen homozygot för knockin-allelen och #6 innehåller en knockin- och en mutantallel (frameshift) (fig. 1). 0,5 μl plasma separerades på SDS-PAGE och proteiner runt 70 KD smältes i gelet med trypsin. De tryptiska peptiderna eluerades ur gelen, torkades och upplöstes på nytt för separation genom vätskekromatografi och masspektrometrisk analys. För grisling nr 2 kunde vi påvisa 14 unika tryptiska peptider av humant ALB och 15 för grisling nr 6 (fig. 2b). M/Z-spektra för humanpeptid FKDLGEENFK och grispeptid FKDLGEQYFK (båda från smågris nr 2) visas i figur S3. Två peptider valdes ut för kvantifiering genom att mäta topparna. I överensstämmelse med resultaten från västblottningen var dessa två peptider mycket rikligare (~5 gånger) i #2 än i #6 (fig. 2c). Dessa resultat visar att den rHSA som påvisas av antikropparna är äkta humant albumin.
Genotypning av det DNA som isolerats från öronspetsarna visar att både nr 2 och nr 6 inte innehåller någon vildtyp av gris-Alb-allel, antingen inte närvarande eller redigerad (fig. 1b,c). Vi kunde dock fortfarande upptäcka tryptiska peptider från grisalbumin i båda proverna, men i mycket lägre abundans (fig. 2c). Intressant nog var abundansen av grispeptider ungefär densamma mellan de två proverna, trots att abundansen av humana peptider skiljde sig mycket åt. Dessa resultat tyder på att båda smågrisarna innehåller ett liknande antal hepatocyter av vildtyp (eller heterozygota) som är ansvariga för den gris-ALB som upptäcktes i blodet hos dessa två smågrisar. Det är dock möjligt att sådana celler som innehåller vildtypsallel inte finns eller finns i en extremt låg procentandel i öronspetsarna så att vildtypsallelen inte skulle kunna PCR-amplifieras. Vidare visade Southern blot-analys med en intern sond (3′ hälften av CDS för humant ALB) att det fanns ytterligare en insättning av donatorsekvensen hos smågrisarna nr 1, 4 och 5 (fig. S4). Alla dessa komplikationer kommer inte att vara ett problem i syfte att producera rekombinant humant albumin eftersom knockin-allelen kan renas genom backcrossing.
För att avgöra om knockin-allelen kan överföras till nästa generation korsade vi #2 (hane, homozygot) med #5 (hona, heterozygot) när de blev reproduktivt mogna. Sex valpar föddes ur korsningen. Fyra av dem (nr 1, 3, 4 och 6) är homozygota för knockin-allelen (AlbH/H, H betecknar människa) och två (nr 2 och 5) heterozygota (AlbP/H, P betecknar gris) (fig. 3a). #5 och 6 dog av diarré cirka 2 veckor efter födseln. Vi analyserade humant albuminuttryck i blodet hos de återstående smågrisarna vid 4 veckors ålder. Som framgår av figur 3b har alla grisar humant albumin i blodet. Intressant nog var nivån av humant albumin hos det heterozygota djuret (nr 2) mycket lägre än hos de homozygota. Vi vet inte om detta är ett resultat av individuell variation eller om knockin-allelen på något sätt undertrycks av vildtypsallelen.
Germline överföring av knockin-allelen.
(a) PCR-genotypning av F1-avkomman. De primers som användes var desamma som i figur 1. (b) Western blot-detektion av humant albumin i blodet från F1-grisarna. 0,5 μl plasma från varje smågris separerades på SDS-PAGE och analyserades. C, plasma från en vildtypgris. M, molekylviktsmarkör.
Vi visar här den framgångsrika generationen av grisar som bär på humant ALB cDNA som är knockat i svinets Alb locus. Detta är ett steg längre än den enkla genredigering i zygoter av gris som nyligen rapporterats av Hai et al.12 och oss13. Stora domesticerade djur har använts som bioreaktorer för biomedicinska proteinprodukter14,15,16,17,18,19,20. Vanligtvis har de kodande sekvenserna för dessa proteiner förts in slumpmässigt tillsammans med nödvändiga transkriptionskontrollelement i genomet som transgener, vilket är förknippat med många komplikationer, bl.a. att transgenuttrycket är kortvarigt. Vår demonstration av att homolog rekombination kan ske mycket effektivt i grisens zygoter öppnar dörren för utveckling av allt bättre bioreaktorer och djurstammar med fler och mer önskvärda egenskaper.