PMC
DISCUSSION
Den modell som används för DNA-syntesen innehåller alla de proteiner som behövs för att stödja varje fas i DNA-replikationsprocessen, och dessa proteiner har en storlek på mellan 20 och 240 kDa under de nuvarande testförhållandena, och de kan utföra alla faser av DNA-replikationsprocessen in vitro . I den här studien karakteriserades den syntet-associerade DNA-primasaktiviteten genom att undersöka syntesen och förlängningen av RNA-primers som katalyseras in vitro av DNA-syntet. Resultaten av våra funktionella analyser visar att den syntomexponerade DNA-primasaktiviteten i P4-fraktionen som härrör från bröstcancerceller är 30 gånger högre än i råa extrakt av bröstcancerceller. P4-fraktionen, som innehåller DNA-syntesen, härrörde från de kombinerade nukleära och cytoplasmatiska lösliga proteinfraktionerna från MCF7-celler och användes för att utföra SV40-dna-replikationsanalysen in vitro. Aktiviteterna hos DNA-polymeras α och δ och DNA-primas i P4-fraktionen är 20-40 gånger högre än i råcellsextrakt, vilket gör den till ett användbart verktyg för dessa studier eftersom den är fullt kompetent att stödja syntesen och förlängningen av RNA-primers i ett in vitro-modellsystem som har visat sig stödja alla faser av DNA-replikationsprocessen.
DNA-primas uppvisar en unik processivitet vid syntesen och förlängningen av RNA-primers. Denna processivitet definieras av en konkurrens mellan tillägget av nästa korrekta nukleotid och dissociation av primer-mallkomplexet . DNA-primas är det enda enzym som kan syntetisera RNA-primers under initieringen av DNA-syntesen . Ingen av de enskilda primasunderenheterna kan på egen hand syntetisera eller förlänga en RNA-primer . Syntesen innehåller båda primasunderenheterna (dvs. p49 och p58) och kan katalysera syntesen av RNA-primers in vitro med hjälp av en exogen poly(dT)-mall. Syntesen syntetiserar en funktionell RNA-primer av enhetslängd (7-10 nt). Dessa RNA-primers hydrolyseras fullständigt av RNas till korta fragment på 1-4 bp, men de hydrolyseras inte av DNas. Den utmärkande egenskapen hos det syntomexponerade primaset, som skiljer det från ett isolerat DNA-primas, är dess specifika förmåga att förlänga RNA-primern för att bilda en DNA-primersträng. Syntesen av en DNA-primersträng kräver också DNA-polymerasaktivitet utöver DNA-primasaktivitet. DNA-polymerasaktiviteten kopplas normalt om för att starta förlängningen av en RNA-primer efter syntesen av primern. Endast RNA-primers ≥7 nukleotider långa utnyttjas av polymeraset; oavsett dNTP-koncentrationen . Syntesen och förlängningen av enhetslånga RNA-primer kräver således inte bara primas utan involverar även DNA-polymeras α-underenhet p180 , och syntesen innehåller mycket aktiva DNA-polymeraser som katalyserar inkorporeringen av desoxyribonukleotider för att förlänga RNA-primern. RNA-primers förlängs av de till syntomen associerade polymeraserna från en DNA-RNA-oligoprimer med en längd på 20-40 nt (DNA-primer). DNA-primersträngar innehåller två komponenter: (1) en ribonukleotid på 10 nt och (2) en desoxyribonukleotid på 20-40 nt. RNas och DNas hydrolyserar separat de lämpliga komponenterna i DNA-primersträngarna vilket resulterar i en förkortning men ofullständig hydrolys av DNA-primersträngen.
Ett annat kännetecken för syntesen är den snabba syntesen och de skilda storlekarna av RNA-primer- och DNA-primersträngen. Syntesen katalyserar syntesen av både en RNA-primer och en DNA-primersträng snabbt, och steady-state nivåer verkar ackumuleras inom (5-15 min). Storlekarna på den enhetslånga RNA-primeren (7-10 nt) och DNA-primersträngen (20-40 nt) som katalyseras av DNA-syntesen förblir alltid konstanta, oavsett syntesens koncentration eller reaktionstid. Denna studie av DNA-primasaktivitetens mekanism innebär att syntesen av RNA-primers, som katalyseras av det till syntesen associerade primaset, sker via en långsam initiering, snabb polymerisering och ”intelligent” terminering av primern . DNA-primas binder till DNA-mallen och inleder långsamt syntesen av en dinukleotid. Efter syntesen av dinukleotiden läggs ytterligare NTP:er snabbt till den dinukleotid som polymeriserats av DNA-primas. DNA-primasaktiviteten kännetecknas av att varje RNA-primer syntetiseras i en enda ”explosion” av aktivitet, snarare än genom distributiv syntes . När enhetslånga primörer på 7-10 nt har genererats fungerar primasmallen som en termineringssignal och hämmar ytterligare RNA-syntes. Denna hämning beror på genereringen av en stabil primer-mall, som sannolikt förblir associerad med pol α-primaskomplexet. Intressant nog liknar de DNA-primersträngar som syntetiseras av DNA-syntesen in vitro de syntes-katalyserade RNA-primerna som syntetiseras in vitro. Syntesen av en DNA-primersträng når snabbt steady state-nivåer och storleken på DNA-primersträngen förblir relativt konstant (mellan 20 och 40 nt), oavsett reaktionstid eller koncentrationen av syntomen som används under syntesreaktionen. Syntesen av DNA-primersträngen kräver DNA-polymeras α-aktivitet förutom DNA-primas . Våra resultat tyder på att den syntesassocierade polymeras α-aktiviteten också kännetecknas av en snabb polymerisering och ”intelligent” terminering vid syntesen av DNA-primersträngen. Syntesen, med egenskapen snabb polymerisering och intelligent DNA-primersträngsavslutning, skiljer sig från syntesen som medicineras av Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymeras I under förlängningen av RNA-primeren. I motsats till syntesen är RNA-primerförlängningen som katalyseras av polymeras I starkt beroende av reaktionstidens längd. En ökning av reaktionstiden ökar signifikant mängden och storleken på de förlängda RNA-primerna.
Två potentiella mekanismer har föreslagits för att förklara övergången från primersyntes till primerförlängning under DNA-replikationsprocessen . Den första föreslår att primas-polymeraskomplexet dissocieras från primermallen och återassocieras med polymerasets aktiva plats. Den andra föreslår att växlingen sker i en intrastrand-translokation av pol α-primaskomplexet från den aktiva platsen för primas till den aktiva platsen för polymeras α. Denna växling innebär inte att pol α-primaskomplexet dissocieras från DNA-mallen. Våra experiment visar att polymeras I-katalyserad RNA-primerförlängning hämmas av höga koncentrationer av DNA-syntesen. Klenow-fragmentets förmåga att förlänga en RNA-primer beror på syntesen av RNA-primers som katalyseras av syntesen, som också behöver en tillgänglig bindningsplats vid RNA-primers terminus. Därför kräver Klenow-fragmentet av E. coli polymeras I att primas-polymeraskomplexet dissocieras från primermallen. Höga koncentrationer av syntesen konkurrerar dock med polymeras I om bindningsstället på primermallen så att förlängningen av RNA-primern hämmas. Syntomen bildar ett dödligt komplex vid RNA-primersens terminus, vilket leder till att Klenow-fragmentet inte kan delta i RNA-primersens förlängningsprocess. Detta resultat tyder på att polymeras-primaskomplexet i DNA-syntesen måste dissociera från primermallen efter syntesen av RNA-primern. Vårt resultat visar att syntesen ökar storleken på den enhetslånga RNA-primeren när reaktionstemperaturen sänks. En sänkning av reaktionstemperaturen ökar effektiviteten i växlingen av polymeras-primaskomplexet och minskar denatureringen av primer-mallen . Dessutom innehåller DNA-primasets p49-underenhet den katalytiska RNA-polymerasaktiviteten, som behövs för att öka storleken på enhetslängden RNA-primer . Våra resultat tyder därför på att DNA-syntesen har den lämpliga RNA-polymerasaktivitet som behövs för att bilda RNA-primerade DNA-fragment.
Den kinetiska analysen av initiering och förlängning av RNA-primers visar att det syntesassocierade DNA-primaset är ett långsamt och relativt svagt enzym när det gäller mallbindning . DNA-primas är också ett felbenäget nukleinsyrepolymeras eftersom detta enzym har en mycket dålig nukleotiddiskrimineringsförmåga, vilket resulterar i felinkorporering av nukleotider . Vår analys av den enzymatiska kinetiken för DNA-primasaktiviteten i samband med syntesen skulle därför kunna användas för att fastställa förhållandet mellan syntetiska hastigheter och felfrekvenser under syntesen av RNA-primer. Den diskontinuerliga syntesen av DNA-fragment (Okazaki) på replikationsgaffelns eftersläpande sträng är en viktig biokemisk process under DNA-replikationen. För att säkerställa en effektiv samordning mellan den kontinuerliga syntesen av DNA på den ledande strängen och den diskontinuerliga syntesen av DNA på den eftersläpande strängen kräver DNA-primas en exakt tidsbestämd serie enzymatiska steg som kontrollerar syntesen av RNA-primers. En kinetisk studie av ett multiproteinreplikeringskomplex från bakteriofag T7 visar att primaset fungerar som en molekylär broms och tillfälligt stoppar utvecklingen av replikationsgaffeln. På grund av den fysiska interaktionen mellan DNA-polymeras δ och pol α tyder det resultat som presenteras av Lee et al. på att DNA-primas kan förhindra att syntesen av den ledande strängen går före syntesen av den eftersläpande strängen under de långsamma enzymatiska stegen på den eftersläpande strängen.
Varier olika eukaryotiska DNA-replikeringsmodeller har använts för att studera DNA-primasets funktion. Replikationssystemet med kärnmatris av helcellslysat har använts för att undersöka syntesen och fördelningen av nativ RNA-primer och RNA-primerat nascent DNA i eukaryotiska cellkärnor med hjälp av endogen kärnmatrisbunden dubbelsträngad DNA-mall . RNA-primers är nära knutna till kärnmatrixen i snabbt prolifererande däggdjursceller . RNA-primers är kovalent knutna till nyligen replikerat DNA för att bilda RNA-primerat nascent DNA. RNA-primerat DNA bryts ned till några oligoribonukleotider med en längd på ~10 nt efter DNase-desintroduktion , och minst 94 % av de ursprungliga RNA-primerna och det RNA-primerade nascenta DNA:t befinner sig i kärnans olösliga matrisfraktion. RNA-primörer med en längd på 8-10 nt som finns i samband med kärnmatrixen utgör <1 % av det totala RNA:t i cellen, vilket gör det mycket svårt att undersöka RNA-primörer och RNA-primmat nascent DNA i cellens kärnmatrixfraktion på grund av den mycket låga koncentrationen av RNA-primörer och den relativt stora mängden annat RNA. Dessutom är isoleringen av RNA-primers och RNA-primerat nascent DNA från radionukleotidmärkta helcellslysat ett komplicerat och icke-trivialt reningsförfarande när det tillämpas på analysen av kärnmatrisreplikationsmodellmedierad RNA-primersyntes. Däremot innehåller den DNA-syntes som renats från de kombinerade kärn- och cytoplasmafraktionerna mycket aktivt DNA-primas och DNA-polymeraser, och stöder fullt ut syntesen av nativa RNA-primers in vitro med hjälp av en dubbelsträngad SV40-ursprung som innehåller en DNA-mall. De DNA-syntetiserade RNA-primers som syntetiseras av DNA-syntesen är av normal längd (10-20 nukleotider) och verkar fungera korrekt för att stödja primerförlängning av DNA-polymeras. Dessa RNA-primörer kan lätt förlängas för att bilda RNA-primerat nascent DNA på 100-200 nt. Den diskontinuerliga syntesen av DNA-fragment (Okazaki) på replikationsgaffelns eftersläpande sträng är en viktig biokemisk process som är involverad i DNA-replikationen, och fullständiga RNA-primerade DNA-fragment (Okazaki) som syntetiseras av DNA-syntesen har också en längd på cirka 100-200 nukleotider. Vi observerade att DNA-syntesen kan syntetisera olika RNA-primade produkter som varierar i storlek från 10 till 200 nt i längd. Detta kan anses vara rimligt, eftersom naturliga RNA-primörer och RNA-primerat nascent DNA också är av denna ungefärliga längd. Ovanstående observation, att syntesen av RNA-primer och RNA-primerat nascent DNA, som katalyseras av DNA-syntesen, i huvudsak är likvärdig med den studie som publicerades med hjälp av replikationsmodellen för kärnmatrisen i helcellslysat , tyder på att DNA-syntesen är ett utmärkt modellsystem som kan utföra en fysiologiskt meningsfull DNA-replikationsprocess in vitro.
DNA-syntesen-modellen är därför ett unikt och värdefullt redskap för studiet av DNA-primasets funktion. Primasmedierad syntes och förlängning av RNA-primersyntes och förlängning som utförs av DNA-syntesen liknar i hög grad den som utförs av andra cellfria replikationsmodeller. Synthesemodellen stöder syntesen och förlängningen av RNA-primers in vitro med hjälp av exogena enkelsträngade DNA-mallar samt supercoiled dubbelsträngat DNA som innehåller ett intakt SV40 replikationsursprung. Därför har DNA-syntesen full kapacitet att förmedla syntesen och förlängningen av RNA-primers in vitro och kan underlätta den fortsatta undersökningen av de mekanismer som initierar DNA-syntesen i eukaryota celler. Tillsammans tyder våra resultat på att synthesemodellen utgör ett unikt verktyg för att studera interaktionen mellan DNA-primas och andra replikationsproteiner under DNA-replikationsprocessen.