Toxigena Vibrio cholerae evolution och etablering av reservoarer i akvatiska ekosystem
Resultat
Fyra departement – Artibonite, Centre, Nord-Ouest och Ouest – står för 90 % av de rapporterade kolerafallen i Haiti (9). Vi fokuserade våra ansträngningar på Ouest-departementet (Fig. 1A), en kustregion som är rik på akvatiska ekosystem där vi har isolerat toxigena V. cholerae O1 från fasta flod- och flodmynningar (Fig. 1A). Förekomsten av toxigena akvatiska V. cholerae O1 korrelerade med ökad temperatur och nederbörd men inte med antalet fekala koliforma bakterier, vilket tyder på att förekomsten inte enbart berodde på fekal kontaminering (10). Antalet fall per månad i Ouest, som varierar årligen men minskar under torrperioden och ökar under regnperioden (april till oktober), korrelerade med ökad temperatur och nederbörd (fig. 1B). Detta stämmer överens med mönster för endemisk V. cholerae O1 i Bangladesh och Peru, där säsongsbetonade kolerautbrott korrelerar med ökad förekomst av V. cholerae O1 i miljön och ökad vattentemperatur eller nederbörd (11, 12).
För att skilja mellan evolution under selektivt tryck (anpassning) eller genetisk drift beräknade vi förhållandet mellan nonsynonyma (dN) och synonyma substitutioner (dS) (dN/dS) (SI Appendix, Fig. S6 och Tabell S5). Den evolutionära dynamiken hos de kliniska isolaten drevs huvudsakligen av renande urval (dN/dS = 0,6, P < 0,001), vilket stämmer överens med ett negativt Tajimas D (-2,3, P < 0,005) och en population som upplever flaskhalsar och/eller selektiva svepningar. Negativt urval förväntas driva den redan etablerade epidemin hos människor som har nått en topp i det adaptiva landskapet under ett tidigt epidemiskt skede som drivs av diversifierande urval (14). Däremot uppvisade miljöisolat större nonsynonyma hastigheter (dN/dS = 2,1, P < 0,001), vilket är karakteristiskt för en heterogen mikrobiell population som nyligen introducerats i en ny miljö och som genomgår fixering av nytt variantdrivet diversifierande urval. I själva verket fann vi miljöspecifika molekylära avtryck i genomet hos V. cholerae som framgångsrikt replikerades och bestod i vattenmiljön. Sammanlagt sju nonsynonyma mutationer i kodande regioner, som potentiellt ger en selektiv fördel till miljöpopulationen av V. cholerae, uppstod längs ryggraden i fylogenin av miljöisolat mellan 2012 och 2015 (fig. 3 och SI Appendix, tabell S7). Tre miljöspecifika mutationer, två tidigt i ryggradets förgrening (fig. 3) och en i en inre gren (SI Appendix, tabell S7), påverkade gener i typ II-sekretionssystemet (TSSII): de allmänna sekretionsvägsproteinerna A och G samt K (SI Appendix, tabell S7). TSSII spelar en central roll för V. choleraes virulens och överlevnad i olika nischer, t.ex. akvatiska reservoarer eller mänskliga värdar (26). Andra mutationer som hittades längs interna grenar påverkade gener som är relaterade till miljöstressreaktion, kemotaxis/motilitet hos V. cholerae som svar på fluktuerande miljöindikationer, kontroll av flagellens kroklängd, biofilmsbildning i den extraintestinala miljön och exponentiell tillväxt som svar på tillgängliga näringsämnen (SI-bilaga, fig. S7 och tabell S7). Miljöisolat som framgångsrikt bidrog till den evolverande miljöledningen samlades inte bara in i närheten av sjukhus och kolerabehandlingscentraler i Gressier utan även i de närliggande Goave- och Carrefour-regionerna (fig. 3).
Evolution och anpassning av V. cholerae i haitiska vattenreservoarer. Fylogenetiskt förhållande och geografisk fördelning av 27 miljöisolat som samlats in mellan 2012 och 2015 i Haiti. Nonsynonyma mutationer som förvärvats under miljöpopulationens utveckling, rekonstruerade genom Bayesiansk inferens av förfädernas tillstånd, anges längs trädets ryggrad. De SNP som upptäcktes längs trädets stam (överlevande linje) numrerades sekventiellt från 1 till 7 för att underlätta jämförelsen med den ytterligare information som rapporteras i SI Appendix, Table S7. Kartor visar provtagningsplatserna, grupperade efter vattenkälla, märkta med gula, röda, orange och cyanfärgade prickar i Gressier-regionen, lila för Carrefour och blå i Jacmel-regionen.
Bevisen på epidemiologiska och miljömässiga evolutionära krafter som driver den haitiska epidemin motiverade oss att överväga en dynamisk modell för överföring av koleraspårning och populationsgenetik genom vattenmiljöer och värdar. Liksom i tidigare modeller av kolera från vår grupp (27) bygger vår underliggande epidemiologiska modell på ramverket susceptible-infected-recovered with reservoir (SIRW), en utvidgning av det klassiska ramverket susceptible-infected-recovered (SIR) med ett tillagt fack för patogenkoncentrationen i en akvatisk reservoar (W) (fig. 4 och SI Appendix, fig. S8 och S9). I enlighet med Kirpich et al. (27) har vi tillåtit replikation utanför värddjuret, tillsammans med säsongsbundenhet i miljööverföring, utsöndring och nedbrytning, vilket antyds av den signifikanta korrelationen mellan antalet fall och nederbörd. Utöver denna epidemiologiska formulering tog vi hänsyn till en evolutionär komponent i vår modell. Både neutral drift och selektionstryck beaktas i vår multilocusram, där vi mäter Ne genom att beräkna den genetiska mångfalden och använda koalescensmetoder (SI Appendix, Text). I överensstämmelse med andra studier antog vi en avvägning mellan överlevnadsförmåga i miljön och fitness i värdöverföring för loci som är föremål för urval. Resultaten från modellsimuleringar återger kvalitativa egenskaper hos Ne och månatliga antal fall (fig. 4A och SI Appendix, fig. S8).
Modell för blandad överföring av kolera och vaccinationsförutsägelse. (A) Ne (effektiv populationsstorlek) observerad från data (grått) och i simulering med miljöreplikation (grönt) och Ne i simulering utan miljöreplikation (violett). (B) Olika scenarier för vaccination och kontroll för modellsimuleringen med miljöreplikation, särskilt vaccinationstäckning på 64 % (hastighet 0,01 d-1), 88 % (hastighet 0,04 d-1) och 64 % med en 10-procentig ökning av den miljömässiga nedbrytningshastigheten. Här definierar vi vaccinationstäckning som den procentuella minskningen av mottagliga individer (när vi når ett ungefärligt stabilt tillstånd efter 2-3 månader av vaccination). Till skillnad från Kirpich et al. (27) och simuleringar utan miljömässig replikation (SI Appendix, Fig. S10) där 64 % vaccinationstäckning utrotar patogenen inom ett år, krävs här antingen mer vaccination (88 % täckning) eller ökat miljömässigt förfall (10 % ökning) för att kontrollera kolera i närvaro av miljömässig replikation.
För det första visar både modellutfallet och data en ökning och minskning av Ne initialt, vilket återspeglar snabb expansion följt av negativt urval efter det första utbrottet (fig. 4A). Sedan observerades en andra ökning av Ne under 2013, som var större än vad som skulle kunna förväntas enbart på grund av värdöverföring, och som orsakades av ett föregående säsongsutbrott och som sträckte sig in i en period med minskad incidens. Vår hypotes om diversifiering inom den akvatiska reservoaren ger en förklaring till detta relativa uppsving i Ne och stöds av rimliga modellsimuleringar där införandet av miljöreplikation möjliggör denna evolutionära utforskning i motsats till fall utan miljöreplikation (fig. 4A och SI Appendix, fig. S8). I synnerhet under toppen från slutet av 2012 till mitten av 2013 upptäcktes uuSNPs i följande gener i den överlevande miljöledningen: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051 gen (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C) och Vch1786_II0794 (107 C→A) (SI Appendix, Fig. S3). Mutationer i dessa gener kan ha bidragit till ökad anpassning av miljöstammar i det akvatiska ekosystemet, även om framtida in vitro-studier kommer att behövas för att undersöka deras bidrag till V. choleraes fitness. Toppen i miljöreplikation följs av en betydande nedgång i Ne som börjar före den stora lugna perioden 2014. Återigen förklarar inte fallincidensen helt och hållet omfattningen av denna nedgång. Även om flaskhalsen i populationen leder till en minskning av Ne, tyder simuleringarna på att den miljömässiga replikationen är nödvändig för att påskynda fixeringen av gener som är anpassade för att fortleva i den akvatiska reservoaren. I slutet av 2014 sprider sig miljöreservoarerna till värdarna med en ökning av antalet kliniska fall, eventuellt förstärkt av en fördelaktig värdanpassning och/eller förlust av immunitet i värdpopulationen. Omfattande simuleringar som kalibrerats med hjälp av falldata tyder på att miljöreplikation bör inkluderas i modellen för att ytterligare anpassa den observerade Ne till den observerade Ne. En viktig konsekvens av våra resultat är att replikering och anpassning inom den akvatiska reservoaren kan försvåra kontrollstrategier som är inriktade på värdöverföring. Genom att projicera framåt från 2015 i simuleringar observerade vi att vaccinering lätt kan rensa bort patogenen i avsaknad av miljöreplikation (SI Appendix, Fig. S10). För miljöanpassning och replikation som överensstämmer med det observerade Ne krävs dock att man vaccinerar en mycket större del av befolkningen eller lägger till ett ingrepp som påverkar den akvatiska reservoaren för att eliminera kolera i vår dynamiska modell med blandad överföring (fig. 4B).