The genetic variation of different developmental stages of Schistosoma japonicum: do the distribution in snails and pairing preference benefit the transmission?
Sample collection
Sample collection and experimental design are summarised in Fig. 1. De stappen van monsterverzameling worden hieronder geschetst, inclusief slakkenverzameling, verzameling van cercariae, muizeninfectie en verzameling van volwassen wormen, en verzameling van miracidia.
Flowchart van monsterverzameling en experimentele opzet
Slakkenverzameling
Oncomelania hupensis slakken werden verzameld in maart en september 2016 uit het oostelijke gebied van Dongting Lake (29° 32′ 5..25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), provincie Hunan, China. De slakken werden gelokaliseerd in sloten in 3 dorpen op een afstand van 10 km. De verzamellocatie is een moerasgebied en geen nationaal park of ander beschermd gebied of privé-terrein. De verzamelingen werden uitgevoerd met toestemming en hulp van het Instituut voor Schistosomiasisbestrijding van de provincie Hunan, China, dat toezicht houdt op de slakkenbestrijding in het gebied. Oncomelania hupensis is geen bedreigde of beschermde soort. De slakken werden teruggebracht naar het laboratorium en ingedeeld in groep A voor de slakken verzameld in maart en groep B voor de slakken verzameld in september. Na een maand gevangenschap werden de slakken gewassen en overgebracht naar individuele met water gevulde flesjes gedurende 3 uur onder licht bij 25°C, om het verschijnen van cercariae te stimuleren voor het identificeren van S. japonicum infectie. Uiteindelijk werden 20 slakken van groep A en 25 slakken van groep B geïdentificeerd als geïnfecteerd met S. japonicum.
Cercariae collectie
Nadat cercariae waren losgelaten van individuele slakken, werden sommige overgebracht naar een schaaltje met behulp van een lus en gewassen in cercariae wasoplossing (5 g/l lactalbuminehydrolysaat, 6.8 g/l NaCl, 0.4 g/l KCL, 0.2 g/l CaCl2, 0.2 g/l MgSO4-7H2O, en 1 g/l glucose) onder microscopie. Na 3 wasbeurten werden de cercariën afzonderlijk met 2 μl gesteriliseerde wasoplossing op een Whatman™ FTA-kaart (GE Healthcare, Pittsburgh, USA) gepipetteerd. Na het drogen werden de kaarten in een verzegelde plastic zak in een exsiccator bij kamertemperatuur bewaard. Ten minste 50 cercariae per slak werden individueel verzameld en op Whatman™ FTA-kaarten bewaard.
Muisinfectie met cercariae van individuele slak
Om met S. japonicum besmette slakken van één geslacht te onderscheiden, werden 2 laboratorium Kunming-muizen percutaan geïnfecteerd met 30 cercariae van elke slak per muis. In totaal werden 40 muizen geïnfecteerd voor 20 slakken van Groep A, en 50 muizen werden geïnfecteerd voor 25 slakken van Groep B. Wormen werden uit de mesenteriale aders van elke muis gehaald door perfusie met 0.9% NaCl en dissectie 7 weken later na infectie. Er werd op gelet dat de mogelijkheid van splitsing van gepaarde volwassen wormen door mechanische kracht tijdens perfusie en dissectie tot een minimum werd beperkt, waarbij 3 ervaren technici werden ingezet om de wormen zo snel mogelijk te verwerken. Elk wormenpaar werd overgebracht naar afzonderlijke buisjes om onmiddellijk te worden gewassen en gemerkt, en werd in absolute ethanol per paar bewaard zodra de wormen spontaan uit elkaar gingen. Ongepaarde wormen van elke muis werden onder microscopie gecontroleerd om het geslacht te bevestigen en vervolgens in ethanol bewaard.
Muisinfectie met cercariae gepoold van alle slakken (Methode I en II) en verzameling van volwassen wormen
Voor latere infecties bleven 17 van de 20 slakken van Groep A en 16 van de 25 van Groep B in leven en in staat om voldoende cercariae te produceren. Er werden twee verschillende cercariapooling-methoden gebruikt voor de twee slakgroepen. Voor de 17 overblijvende slakken van groep A werden alle slakken samengevoegd in een kolf met water om het uitkomen van cercariae te stimuleren (methode I). Eenendertig muizen werden vervolgens percutaan geïnfecteerd met 34 cercariae voor elke muis. Voor de infectie met 16 slakken van groep B werden 2 cercariae van elke individueel vervliegende slak samengevoegd, en de gemengde 32 cercariae werden gebruikt om een muis te infecteren (methode II), waarbij in totaal 22 muizen werden geïnfecteerd. Alle muizen werden opgeofferd om S. japonicum wormen te verzamelen 7 weken na infectie, zoals hierboven beschreven. Uiteindelijk werden 530 wormen van muizen volgens Methode I (Groep A), 484 wormen van muizen volgens Methode II (Groep B) verzameld.
Miracidia verzameling
Voordat alle geïnfecteerde muizen werden opgeofferd om volwassen wormen te verzamelen, werd de ontlasting van elke muis gedurende 7 dagen verzameld, om de door de darm uitgescheiden eitjes te concentreren voor het uitkomen van de miracidia. Ei-sediment van elke muis werd blootgesteld aan gedechloreerd water in een kolf onder licht bij 25 °C om miracidia uit te laten komen. De wondercidia werden met een pipet uit het bovenste water van elke kolf geoogst en overgebracht in een schaaltje met een wondercidiumwasoplossing (5 g/l lactalbuminehydrolysaat, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2, en 0,20 g/l NaHCO3). Na 3 wasbeurten werden de miracidia afzonderlijk met 2 μl gesteriliseerde wasoplossing op een Whatman™ FTA-kaart gepipetteerd. Na te zijn gedroogd, werd de kaart in een verzegelde plastic zak in een exsiccator bij kamertemperatuur bewaard. Er werden ten minste 50 miracidia per muizenontlasting verzameld.
Miracidia uitgebroed uit eieren gevangen in levers van besmette muizen werden ook verzameld als volgt. De lever van elke geïnfecteerde muis werd verzameld na verzameling van de volwassen worm, gehomogeniseerd in koud 1,2% NaCl, en gefiltreerd om het ei-sediment te verkrijgen. Miracidia werden uitgebroed volgens dezelfde methode als die gebruikt werd voor het ontlastingmonster. Ten slotte werden ten minste 50 miracidia per muizenlever afzonderlijk gepipetteerd en bewaard op Whatman™ FTA-kaarten.
Genomic DNA-extractie
Voor DNA van een enkel cercaria- of miracidiummonster werd een schijfje met een diameter van 2 mm verwijderd uit het midden van elk monsterpipetgebied van een Whatman™ FTA-kaart met behulp van een 2 mm Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). De schijf werd in de bodem van een 96 wells, 1,2 ml U-bottom-plaat geplaatst. Na één spoeling met 100 μl FTA-zuiveringsreagens (GE Healthcare Life Sciences) gedurende 5 minuten, gevolgd door 100 μl TE-buffer (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), werd 14 µ van 0,1 M NaOH met 0,3 mM EDTA, pH 13,0 toegevoegd aan elk putje en liet men de oplossing 5 minuten incuberen, waarna 26 µl 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,0 werd toegevoegd. Vervolgens werd de plaat gemengd door met een vortexmixer 3 keer te pulseren gedurende telkens ongeveer 10 seconden. De oplossing werd vervolgens 10 min. bij kamertemperatuur gelaten, 10 maal gepulseerd, en het eluaat werd overgebracht in een schone 96-wells plaat, en bij – 20 °C bewaard voor verder gebruik.
Van elke volwassen vrouwelijke worm werd het voorste deel, inclusief de baarmoeder, onder microscopie afgesneden om de invloed van eitjes in de baarmoeder op het genotype van de vrouwelijke worm te voorkomen. Terwijl de hele mannelijke of onvolwassen vrouwelijke wormen werden gebruikt voor DNA-extractie. Het totale genomische DNA werd uit elke worm afzonderlijk geëxtraheerd met een standaard natriumdodecylsulfaat-proteïnase K-procedure, als volgt. Elke worm werd geïncubeerd en ontdooid in 400 pi extractiebuffer met 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, en 100 mg / ml proteinase K, bij 56 ° C gedurende 1 uur met voorzichtig mengen. Het DNA in de oplossing werd geëxtraheerd met de standaard fenol/chloroformzuivering, gevolgd door 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en ethanol-precipitatie. DNA-pellets werden gewassen in 70% ethanol, aan de lucht gedroogd, en geresuspendeerd in 20 μl TE (pH 8,0), opgeslagen bij – 20 ° C als ruw DNA-extract van volwassen worm voor verder gebruik.
PCR amplificatie en microsatelliet genotypering
Om te bevestigen dat er genomisch DNA aanwezig was in de FTA-kaart elutie of ruw extract van ethanol opgeslagen monster, werd het 28S ribosomaal DNA-gen fragment geamplificeerd uit DNA-oplossing van een enkele cercaria, miracidium, of volwassen worm, met behulp van de volgende primers: forward (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) en reverse (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR’s werden uitgevoerd met de Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads in een 96-wells plaat (GE Healthcare Life Sciences, VS). Voor elke korrel werd 2 µl FTA-elutie van één larve of 0,5 µl ruw extract van één worm toegevoegd, met 1 µl van elke primer, en water tot een eindvolume van 25 µl. De amplificatie werd uitgevoerd met het volgende programma: 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 95 °C, 30 seconden bij 60 °C en 40 seconden bij 72 °C; en een laatste extensiestap bij 72 °C gedurende 7 minuten. De reacties werden vervolgens gecontroleerd door 5 µl op een 2% agarose TAE gel uit te voeren.
Kleine genotypering werd uitgevoerd voor 30 cercariae, 30 miracidia, en 30 wormen die willekeurig werden gekozen, om een optimaal multiplex microsatelliet loci panel voor PCR amplificatie te construeren. Twintig loci, ontwikkeld en gevalideerd in eerdere studies en uit ons laboratorium, werden gecontroleerd. Uiteindelijk werden 9 microsatelliet loci (Additional file 1: tabel S1) geselecteerd om het panel te vormen. Microsatelliet loci voor elk DNA-monster werden gegenotypeerd met behulp van de Type-it Microsatelliet PCR kit (Qiagen, Manchester, UK) met de multiplex van 9 loci. De voorwaartse primer van elk paar werd gelabeld met een geschikte fluorescerende kleurstof, waaronder 6-FAM, HEX, TAMRA en ROX (aanvullend bestand 1: tabel S1). PCR-reacties werden bereid in een 96-well PCR-plaat met 6,25 µl 2 × master mix, 1,25 ul Q-oplossing, 0,5 ul primers (10 uM), 2 ul DNA-sjabloon, en 2,5 ul ddH 2 O, en vervolgens uitgevoerd in een Bio-Rad thermocycler met het volgende programma: 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door 35 cycli van 30 s bij 95 °C, 90 s bij 60 °C en 3 min bij 72 °C, gevolgd door een laatste extensiestap bij 60 °C gedurende 45 min. PCR-reacties werden gecontroleerd door 5 µl op een 2% TAE agarose gel te laten lopen, en succesvolle amplificaties werden naar Sangon Biotech (Shanghai, China) gestuurd voor fragmentanalyse op een ABI3100 genetische analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genotypes werden gescoord met behulp van een microsatelliet plugin van Geneious 11.0 . Alle monsters werden tweemaal geamplificeerd en gegenotypeerd om de afwijking te beperken. In totaal werden genotypes van 346 cercariae, 701 volwassen wormen, en 393 miracidia gegenereerd voor de volgende analyses.
Genetische diversiteit analyses
Genetische diversiteit van elke locus werd geschat in alle gegenotypeerde cercariae door het berekenen van het waargenomen aantal allelen (Na), het effectief aantal allelen (Ae) in GenAlEx 6.5 en allelic richness (Ar) en gen diversiteit (Hs) in hierfstat ver. 0.04-22 , waaronder 156 cercariën van 20 slakken van groep A en 190 cercariën van 25 slakken van groep B. Afwijking van het Hardy-Weinberg-evenwicht (HWE) voor elke locus werd getest met de Chi-kwadraat toets in GenAlEx, en de linkage disequilibrium test tussen loci werd berekend in SHEsis.
De Na, Ae, Ar en Hs werden voor verschillende populaties tijdens het proces van muizeninfectie als volgt berekend. Voor de cercariapopulaties die bij de infectie werden gebruikt, werden 132 cercariae van 17 slakken van groep A (gebruikt in methode I) en 122 cercariae van 16 slakken van groep B (gebruikt in methode II) geëvalueerd. Na genotypering en filtering van gegevens van lage kwaliteit, werden ten minste 5 paren volwassen wormen (indien aanwezig) en alle ongepaarde wormen van elke muis succesvol gegenotypeerd. In totaal ging het om 357 wormen van muizen in Methode I (met cercariae van 17 samengevoegde slakken van Groep A), 344 wormen van muizen in Methode II (met gelijk gemengde cercariae van 16 individuele slakken van Groep B). Daarnaast werd de genetische diversiteit van volwassen wormen in elke muis geschat om de allelische consistentie van volwassen wormen tussen muizen in Methode I en II afzonderlijk te controleren. Voor miracidiumpopulaties werd de genetische diversiteit van miracidia uit lever en ontlasting berekend op supra-populatieniveau (miracidia uit levers of ontlasting van alle muizen), omdat van elke muis slechts 3-4 miracidia uit lever of ontlasting werden gegenotypeerd, waaronder 93 miracidia uit levers (3 per muis) en 124 miracidia uit ontlasting (4 per muis) bij Methode I, en 88 miracidia uit zowel levers als ontlasting (4 per muis afzonderlijk) bij Methode II.
Analyse van moleculaire variantie (AMOVA)
De genetische differentiatie van alle gegenotypeerde cercariae van Groep A en Groep B werd geschat met behulp van AMOVA in Arlequin ver. 3.5.2.2 . Na uitsluiting van slakken die niet voor muizenbesmettingen gebruikt werden, werd de differentiatie tussen 132 cercariae van 17 slakken in Groep A (voor Methode I) en 122 cercariae van 16 slakken in Groep B (voor Methode II) getest. Na infectie werd de differentiatie tussen 357 volwassen wormen in Methode I en de oorspronkelijke cercariapopulatie (132 cercariae uit groep A) getest. Ook werden de 344 wormen van methode II vergeleken met de 122 cercariae van groep B. Bovendien werd de variatie van volwassen wormen tussen 31 muizen van methode I en volwassen wormen tussen 22 muizen van methode II afzonderlijk geëvalueerd. Voor miracidia werd de genetische differentiatie getest tussen 93 miracidia uit levers en 124 miracidia uit ontlasting in Methode I, en hetzelfde voor 88 miracidia uit zowel levers als ontlasting in Methode II.
Gezinsanalyse voor singletons van cercariae met niMLGs
Het aantal cercariële genotypen van elke slak werd geteld. Aangezien het moeilijk is typefouten of somatische mutatie tijdens de sporocyst-vermenigvuldiging te onderscheiden van het oorspronkelijke miracidiumgenotype, werd een groep cercariagenotypes met minder dan 2 foutief gematchte allelen geïdentificeerd als niMLGs en toegewezen aan een lineage die bij elke slak van hetzelfde miracidium was afgeleid. Ten slotte werd het aantal miracidia dat genetische klonen in elke slak tot stand bracht, geëvalueerd op basis van het stamnummer met behulp van het R-pakket allelematch ver. 2.5 .
Omdat cercariae met niMLGs in één slak werden verondersteld van één miracidium afkomstig te zijn, werd één van de genotypes (singleton) voor niMLGs toegewezen om een groep cercariae te vertegenwoordigen die afkomstig waren van een miracidium met de functie amCluster in allelematch, om de gefilterde dataset voor verwantschapsanalyse tussen miracidia te produceren. Vervolgens werd de verwantschap tussen singletons (miracidia) geschat met behulp van de correlatiecoëfficiënt voor de allelgrootte (I′) volgens Streiff in SPAGeDi ver. 1.5a op intra-snail en inter-snail niveau voor 20 slakken in groep A en 25 slakken in groep B, om na te gaan of aggregatie van miracidia in één slak gecorreleerd was met de genetische overeenkomst van miracidia.
Allele verdeling voor cercaria subsets van de verschillende aantallen slakken
De niet-uniforme genetische verdeling van cercariae onder slakken impliceert dat de steekproefgrootte van slakkengastheren de allele verdeling van de cercaria suprapopulatie (cercariae van alle slakken) zou beïnvloeden. Na, de basisindex voor het aangeven van de genrijkdom van een populatie, werd verder geëvalueerd voor elke locus in verschillende cercariae subsets door willekeurig verschillende aantallen slakken te selecteren. Slakken werden willekeurig geselecteerd bij elk gegeven aantal slakken, dat werd ingesteld van 1 tot maximaal in elke groep met behulp van de basisfunctie sample in R, met 100 herhalingen. Bij elk replicaat werd het aantal cercariae in elke slak op 5 gesteld, wat bepaald werd op basis van de praktische haalbaarheid en het gemiddelde aantal gegenotypeerde cercariae in elke slak in deze studie. De genotypes van cercariae voor hetzelfde aantal slakken werden samengevoegd, en de Na werd vervolgens geschat voor elke locus met de functie nb.alleles in het R-pakket hierfstat. De relativiteit tussen genetische diversiteit en het aantal slakken werd geëvalueerd door de kleinste steekproefgrootte van slakken te berekenen wanneer 50% en 95% van de totale Na werd vastgesteld.
Genetische afstand tussen vrouwelijke en mannelijke volwassen wormen
Om een mogelijke genetische voorkeur voor S. japonicum tijdens de paring te detecteren, werd de inter-individuele genetische afstand Dsw tussen het mannetje en vrouwtje van elk paar in individuele muizen gemeten met Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), en vergeleken met die tussen de gepaarde vrouwelijke en ongepaarde wormen (indien beschikbaar, ongepaarde is meestal mannelijke) in dezelfde gastheer.
Vaderschapsidentificatie voor miracidia
De allelfrequenties van alle volwassen wormen en miracidia in elke muis werden geanalyseerd en berekend met de Allele Frequency Analysis-functie in Cervus 3.0 . Alle 9 loci werden uiteindelijk beoordeeld als geschikte markers voor verdere afstammingsanalyse met een gecombineerde niet-uitsluitingswaarschijnlijkheid van minder dan 0,01%. De functie Simulation of Parentage Analysis werd toegepast op basis van de allelfrequentie, om het oplossend vermogen van codominante loci en kritische waarden van de log-likelihood (LOD) te schatten, met de volgende aannamen: 10.000 nakomelingen (miracidia) voor elke individuele muis; 10 kandidaat moeders en vaders in elke muis (geschatte steekproefgrootte volgens het aantal volwassen wormen verzameld in een gastheer); het aandeel kandidaten werd ingesteld op 100% van de gegenotypeerde volwassen wormen; andere opties werden standaard ingesteld. Tenslotte werden beide uitgangen van de Allel Frequency Analysis en de Simulation of Parentage Analysis gebruikt in de Parentage Analysis module, om elke nakomeling aan zijn meest waarschijnlijke ouders toe te wijzen. De ouders die meer dan 2 allelen hadden die niet overeenkwamen met de nakomelingen werden uitgesloten, en de ouders met de grootste LOD werden beschouwd als de meest waarschijnlijke ouders.
Statistische analyse
Alle gegevens die in deze studie voor statistische analyse werden gebruikt, zijn continue gegevens. Significantie van verschil op genetische diversiteitsindices (Na, Ae, Ar en Hs) van loci, verwantschapscoëfficiënt (I′), en inter-individuele genetische afstand (Dsw) tussen twee groepen werden geëvalueerd met het significantieniveau van 0,05. Eerst werd de normale verdeling van de datasets gecontroleerd met de Sharpiro-Wilk test. Vervolgens werd een gepaarde-steekproeven/onafhankelijke t-toets uitgevoerd als de gegevensreeksen normaal verdeeld waren. Zo niet, dan werden de Wilcoxon signed-rank test en de Mann-Whitney U-test toegepast voor de verwante/onafhankelijke steekproeven. De Bonferroni-correctie werd gebruikt om de P-waarde bij meervoudige vergelijkingen te corrigeren.