E-kadherin se váže na desmoglein a usnadňuje tak sestavení desmosomu
1) Tento článek se zabývá mechanismem regulace sestavení desmosomu zprostředkovaného kadherinem. Přestože se recenzenti shodují na tom, že práce je potenciálně vzrušující, vznesli několik závažných otázek. Zaprvé se všichni shodují na tom, že model musí být testován zkoumáním kolokace v buňkách exprimujících mutantní kadherin.
Děkujeme recenzentům za návrh těchto důležitých experimentů. Jak je popsáno v naší podrobné odpovědi recenzentům, testovali jsme nyní roli různých mutací Ecad při bránění náboru DSg2 v keratinocytech. Expresovali jsme plnou délku Ecad WT a mutanty Ecad (L175D, K14E a W2A-K14E) v myších keratinocytech s vyřazeným Ecad a Pcad (EKO/PKD) a analyzovali jsme nábor Dsg2 do míst mezibuněčných kontaktů. Tyto výsledky potvrzují, že aminokyselina L175 na Ecad zprostředkovává interakce Dsg2 a usnadňuje tvorbu časných desmosomových komplexů v buňkách. Naše experimenty také ukazují, že sestavování desmosomů je iniciováno v místech transhomodimerizace Ecad.
2) Existují také obavy ohledně spolehlivosti údajů o kolokaci na obrázku 5; je zapotřebí důkladnější analýzy, která by prokázala, že ke kolokaci E-cadherinu a desmoplakinu dochází mnohem častěji, než by se dalo očekávat náhodou.
V terénu se desmosomy identifikují podle velikosti a vzhledu kolejnicového barvení DP na snímcích SIM. Jak je uvedeno v naší odpovědi recenzentům, použili jsme tento zavedený přístup k lokalizaci desmosomů. Kromě toho nyní zdůrazňujeme, že neměříme kolokalizaci, ale spíše nábor různých kadherinů (Ecad a Dsg) do oblastí membrány, které vykazují tento vzor.
3) Za druhé, modelování předpokládá, že L175 tvoří část rozhraní, ale bez posouzení stechiometrie nelze vyloučit, že ztráta vazby je nepřímým účinkem ztráty cis dimerizace. Modelování je rovněž považováno za slabé, protože nebyla testována žádná komplementární rozhraní na Dsg2. Bez takových údajů je třeba molekulární modelování považovat za vysoce spekulativní.
Jak je popsáno v naší podrobné odpovědi recenzentům, předchozí počítačové simulace a biofyzikální experimenty ukazují, že tvorba cis-dimerů Ecad vyžaduje předchozí trans dimerizaci. V důsledku toho se Ecad nemůže vázat na povrch jako samostatný, předem vytvořený cis-dimer. Proto je velmi nepravděpodobné, že by k naměřeným vazebným interakcím docházelo mezi cis-dimery Ecad a Dsg2. Nicméně souhlasíme s recenzenty, že výsledky molekulárního dokování jsou poměrně slabé. Proto jsme tyto výsledky modelování z rukopisu vyřadili.
4) A konečně, jak poznamenal recenzent 3, i kdyby byly podpořeny těmito doplňky, model a část Diskuse ve skutečnosti nevysvětlují, jak E-cadherin reguluje desmosomy.
Na základě našich nových údajů o buněčné struktuře a funkci nyní navrhujeme model, podle kterého je sestavování desmosomů usnadněno jak přímými cis interakcemi Ecad a Dsg2, tak trans vazbou protilehlého Ecad. V našem modelu slouží trans homodimerizace Ecad z protilehlých buněk jako prostorový signál pro koordinaci sestavování desmosomů. Ecad následně vytváří cis-dimerové komplexy s Dsg2, které iniciují sestavení desmosomu. Tento model je představen a diskutován v novém rukopise.
Recenzent #1:
1) Jednomolekulární experimenty AFM jsou nejsolidnější částí článku. Při mém čtení však autoři nevylučují možnost, že jimi pozorované vazebné události mohou být způsobeny interakcemi mezi předem vytvořenými cis-dimery E-cadherinu. Je důležité stanovit stechiometrii interakce, protože pokud by vazba na DSg2 vyžadovala účast cis-dimeru E-cadherinu, změnilo by to interpretaci výsledku, že mutace L175D blokuje interakci Dsg2/E-cad. Takový scénář by také zpochybnil platnost simulací dokování. Podle mého výkladu je nízká pravděpodobnost vazby na kontakt hrotu AFM s povrchem slabým důkazem toho, že vazba nutně odráží interakci dvou monomerů, ani nízká průměrná hustota molekul kadherinu na povrchu. Dále jsou kadheriny imobilizovány streptavidinem, který má více vazebných míst pro biotin.
Z těchto důvodů se domnívám, že je důležité prokázat, že mezi monomery dochází k heterodimerizaci. Za tímto účelem bych doporučil systematicky měřit pravděpodobnost interakce hrotu s povrchem v závislosti na plošné hustotě E-kadherinu na povrchu krycího sklíčka. Pokud interakce skutečně vyžaduje monomerní E-cadherin, mělo by toto měření lineárně škálovat s přidaným E-cadherinem, alespoň při nízkých hustotách. Toto specifické měření však není nutné – postačí jakékoli měření, které stanoví stechiometrii.
Předchozí počítačové simulace (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) ukázaly, že homodimerizace Ecad cis vyžaduje předchozí tvorbu Ecad trans-dimerů. Podobně předchozí měření FRET s jednou molekulou ukázala, že není možné vytvořit samostatné cis-dimery Ecad, a to ani v případě, že jsou monomery Ecad umístěny v těsné blízkosti v cis orientaci (Zhang et al., 2009). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že v našich experimentech nelze Ecad imobilizovat na hrot AFM nebo substrát jako předem vytvořené cis-dimery. V důsledku toho není selhání interakce mutanta Ecad-L175D s Dsg2 způsobeno absencí cis-dimerizace Ecad. Tuto skutečnost nyní diskutujeme v podkapitole „Leu 175 zprostředkovává interakce Ecad a Dsg2“ rukopisu.
Technická omezení bohužel neumožňují provést stechiometrický experiment s proteinem, který recenzent navrhuje. V našich experimentech používáme povrchové hustoty proteinů, které nám umožňují jednoznačně identifikovat jednotlivé vazebné události z odpovídajícího protažení PEG tetherů. Pokud se zvýší povrchová hustota kadherinů, jak navrhuje recenzent, zvýší se pravděpodobnost současného výskytu více vazebných událostí Ecad, což činí kvantitativní analýzu pravděpodobnosti vazby proteinů nespolehlivou. Z tohoto důvodu (spolu s vnitřní slabostí naší analýzy dokování) jsme z rukopisu vyloučili simulace dokování proteinů.
Nakonec, v revidovaném rukopisu nyní používáme klastrovou analýzu pro seskupení událostí rozpojení jednotlivých molekul pro dynamickou spektroskopii sil (DFS). Nedávno jsme ukázali, že algoritmus shlukování K-means, který jsme použili, výrazně zlepšuje odhad kinetických parametrů při DFS (Yen a Sivasankar, 2018). V důsledku toho jsou doby života, které nyní uvádíme pro interakce Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 a Dsc2/Dsc2, spolehlivější.
2) Simulace dokování jsou zajímavé, ale podle mého názoru poskytují slabé důkazy pro specifickou geometrii vazby, kterou autoři navrhují. Důrazně bych autorům doporučil, aby byli při interpretaci a prezentaci těchto výsledků opatrnější, případně aby předložili další údaje, například EM snímky, které podpoří nebo vyvrátí výpočetní výsledek.
Souhlasíme s recenzentem, že údaje o dokování proteinů jsou slabé. Proto jsme tyto výsledky z rukopisu vyřadili.
3) Snímky SIM bohužel nejsou v současné podobě přesvědčivé. Zejména není jasné, co se v analýze autorů počítá za „desmosom“ (obrázek 5B). Bylo by zapotřebí sofistikovanějšího zpracování kolokalizace, aby se prokázalo, že E-kadherin a desmoplakin kolokalizují a že tato kolokalizace klesá s tím, jak spoje dozrávají.
V předchozích studiích (Stahley et al., 2016a, 2016b) jsme využili vzhledu „kolejnicové dráhy“ DP, jak byl odhalen zobrazením se superrozlišením, k definování desmosomů pomocí imunofluorescence (jak je znázorněno na obrázku 3A). Jiní odborníci v této oblasti také použili morfologii „kolejnic“ k identifikaci desmosomů na snímcích SIM (viz např: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). Velikost a uspořádání těchto struktur, jak je odhalila SIM, plně odpovídá klasickým EM definicím desmosomů. Pomocí standardní analýzy obrazu jsme změřili intenzitu pixelů pro dva kadheriny (Ecad nebo Dsg2) v těchto strukturách. Důležité je, že se nesnažíme tvrdit, že jde o kolokaci. Spíše měříme nábor kadherinů do membránových domén, které vykazují vzorce barvení DP rail road track. Jsme si vědomi toho, že v časných časových bodech je někdy obtížné rozeznat stopy kolejnic. Z tohoto důvodu jsme se domnívali, že nejčasnější čas, kdy jsme mohli identifikovat bona fine rail road track staining, byl 1 hodina. Kromě toho provádíme měření pouze v místech, kde můžeme pozorovat vzory železničních stop, nikoliv DP puncta. A konečně, naše zjištění, že Ecad je přítomen v rodících se desmosomech, je v souladu s klasickými imuno-EM experimenty, které ukazují, že Ecad se může lokalizovat v desmosomech (Jones, 1988). Proto jsme si jisti naší schopností identifikovat desmosomy a měřit relativní hladiny obou kadherinů v různých obdobích.
4) Tento poslední bod ponechávám na uvážení redakce. Podle mého názoru údaje o kolokalizaci, i kdybychom je považovali za pravdivé, nestanovují funkční význam. Bylo by velmi pěkné vidět knockdown/rekonstituční experiment s L175D E-cadherinem. Předpokládá se, že tato molekula by se s desmoplakinem nikdy kolokalizovat nemohla, bez ohledu na stáří spoje. Porušení této předpovědi by zpochybnilo model, který autoři upřednostňují.
Na základě návrhu recenzenta jsme nyní provedli experimenty, které přímo testují roli různých mutací extracelulární domény Ecad při bránění náboru DP a Dsg2 v keratinocytech. Tato data jsou popsána v podsekci „Ecad L175 je nezbytná pro účinný mezibuněčný nábor Dsg2 a sestavení desmosomu“. Příslušné obrázky jsou uvedeny na obrázku 5 a na obrázku 5-figure supplement 1. Použité metody jsou popsány v podkapitole „Izolace, kultivace, transfekce a konfokální zobrazování primárních keratinocytů“. Pro tyto experimenty jsme použili myší keratinocyty EKO/PKD, které prakticky neexprimují klasické kadheriny. Již dříve jsme ukázali, že tyto EKO/PKD keratinocyty nejsou schopny sestavovat AJ a desmosomy v důsledku ztráty všech klasických kadherinů (Michels et al., 2009). Tyto buňky nám tedy umožňují přímo posoudit schopnost mutantů Ecad i) iniciovat tvorbu AJ a ii) posoudit jejich schopnost rekrutovat složky desmosomů do míst počátečního vytváření buněčného kontaktu.
Protože nás zajímalo posouzení schopnosti mutantů Ecad rekrutovat desmosomální proteiny v rané fázi tvorby spojů, exprimovali jsme buď Ecad WT v plné délce, nebo mutanty v keratinocytech EKO/PKD a analyzovali jsme rekrutování DP a Dsg2 do míst mezibuněčných kontaktů pomocí konfokální mikroskopie. Abychom prozkoumali nábor v různých fázích tvorby a zrání spojů, byly keratinocyty fixovány a imunobarveny na DP, Dsg a Ecad ve třech časových bodech po přepnutí Ca2+ (3 hodiny, 6 hodin a 18 hodin).
Naše data ukázala, že 3 hodiny po přepnutí Ca2+ bylo 93 % WT-Ecad obohaceno v zipu podobných časných AJ v místech mezibuněčných kontaktů. Naproti tomu pouze 48 % keratinocytů transfekovaných L175D-Ecad tvořilo zipy AJ, pravděpodobně v důsledku zhoršené tvorby cis-dimerů Ecad (obr. 5 A, B). V těchto časných časových bodech po přepnutí Ca2+ bylo 66 % a 91 % WT-Ecad zipových kontaktů pozitivních na Dsg2 a DP (obr. 5 A, C, D, E). Když se buňky nechaly zapojit do mezibuněčné adheze závislé na Ca2+ po dobu 18 hodin, zvýšila se junkční lokalizace Ecad-Dsg2 a Ecad-DP na 97 %, resp. 100 % (obr. 5 A, C, D, E). Naproti tomu pouze 39 % zipových kontaktů indukovaných L175 vykazovalo 3 hodiny po přepnutí na vysoký Ca2+ nábor Dsg2, který se po 18 hodinách zvýšil na 65 % (obr. 5 A, C), což potvrzuje, že pro účinný nábor Dsg2 do časných mezibuněčných kontaktů je nutná přímá interakce mezi Ecad a Dsg2. Podobně bylo po 3 hodinách pouze 28 % mezibuněčných kontaktů vytvořených mutantou L175D-Ecad pozitivních na DP, což se po 18 hodinách zvýšilo na 72 %, což naznačuje kompenzační mechanismus v pozdějších fázích (obr. 5 D, E).
Abychom potvrdili, že pozorovaný účinek mutace L175D nebyl způsoben ztíženou tvorbou AJ, transfekovali jsme keratinocyty EKO/PKD mutantem Ecad-K14E v plné délce, který ruší tvorbu X-dimerů a zachycuje Ecad v konformaci dimeru s výměnou vláken. Naše údaje ukázaly, že pouze 4 % transfekovaných kontaktních buněk tvořila zipy v časných časových bodech (3 hodiny) po přepnutí na vysokou hladinu Ca2+ a pouze 24 % transfekovaných kontaktních buněk vykazovalo zipy v pozdních časových bodech (18 hodin) (obr. 5 A, B, obr. 5-figure supplement 1), což potvrzuje, že K14 je nezbytný pro účinnou tvorbu AJ, a tedy i pro navázání mezibuněčného kontaktu. Několik málo vytvořených AJ K14E však rekrutovalo Dsg2, a zejména DP, účinněji než L175D (obr. 5 A, C, E, obr. 5-figure supplement 1). Tento výsledek potvrdil, že opožděný nábor Dsg2 do mezibuněčných kontaktů není důsledkem neschopnosti Ecad L175D účinně tvořit AJ, ale spíše absencí přímé interakce mezi Ecad a Dsg2. Vzhledem k tomu, že v nepřítomnosti zipů nikdy nedošlo ke společné lokalizaci DP a Ecad (obr. 5-figure supplement 1), data také naznačují, že trans interakce Ecad předchází interakci Ecad/Dsg2. Tento závěr je dále podpořen naším zjištěním, že po zrušení trans adheze Ecad, a tedy i zipů, transfekcí Ecad-DM plné délky (dvojitý mutant W2A-K14E, obr. 5-figure supplement 1) v keratinocytech EKO/PKD nebyl pozorován žádný nábor DP. Celkově tyto výsledky potvrzují, že aminokyselina L175 zprostředkovává interakci s Dsg2 a usnadňuje tvorbu časných desmosomových komplexů v buňkách.
Recenzent č. 2:
1) Zjištění, že zbytek L175 E-kadherinu je kritický pro interakci s Dsg2, je zajímavé. Nebyla však identifikována žádná interagující partnerská rezidua. Za těchto okolností se předpovídání konformace pro interakci E-cadherin/Dsg2 pomocí dokování jeví jako nejisté; zdá se, že není jisté, zda se předpovězená konformace vztahuje ke skutečné vázané konformaci.
Souhlasíme s recenzentem, že údaje o dokování proteinů jsou spekulativní, a proto jsme tyto výsledky z rukopisu vyřadili.
2) Existuje pouze slabá souvislost navrhované interakce Dsg2/E-kadherinu s biologií sestavování desmosomů. Přesto se zdá, že autoři mají jasnou cestu vpřed. Tvrdí, že přítomnost E-kadherinu ve vznikajících desmosomech (experimentálně hodnoceno pomocí společného barvení na desmoplakin na obrázku 5) je důkazem role asociace Dsg2/E-kadherinu, kterou identifikovali. Nyní, když identifikovali mutanta, který této asociaci brání, by experimenty z obrázku 5 provedené s tímto mutantem měly vést k odlišným výsledkům. Tento experiment by podstatně zvýšil rigoróznost tohoto článku.
Jak je popsáno v odpovědi 4 recenzentovi 1, exprimovali jsme Ecad WT v plné délce a mutanty Ecad v keratinocytech EKO/PKD a analyzovali jsme nábor Dsg2 a DP do míst mezibuněčných kontaktů. Tyto výsledky potvrzují, že aminokyselina L175 zprostředkovává interakce Dsg2 a usnadňuje časnou tvorbu desmosomových komplexů v buňkách. Tyto údaje jsou popsány v podkapitole „Ecad L175 je nezbytná pro účinný mezibuněčný nábor Dsg2 a sestavení desmosomu“ rukopisu. Příslušné obrázky jsou uvedeny na obrázku 5 a na obrázku 5-figure supplement 1. Použité metody jsou popsány v podkapitole „Izolace, kultivace, transfekce a konfokální zobrazování primárních keratinocytů“.
Recenzent č. 3:
1) Tento rukopis identifikuje a charakterizuje molekulární interakci mezi E-cadherinem a Desmogleinem 2 pomocí izolovaných proteinů a ukazuje zvýšenou kolokalizaci mezi těmito dvěma molekulami v keratinocytech na počátku sestavování desmosomu. Jedná se o potenciálně velmi zajímavá pozorování, která mohou vysvětlit, jak klasické kadheriny řídí sestavování desmosomů. Ačkoli je to v literatuře dobře zdokumentováno několika skupinami, základní mechanismy jsou stále většinou neznámé. Nicméně jejich závěr „Our integrated single molecule experiments, protein-protein docking predictions and cell based super resolution imaging show that Ecad/Dsg2 interactions play an important role in early desmosome assembly“ uvedený na začátku části Discussion je poměrně silně nadsazený vzhledem k tomu, že interakce je založena na charakterizaci na izolovaných extracelulárních doménách a statické, i když vysoce rozlišující mikroskopii. Není proveden žádný experiment, který by ukázal, že při narušení této interakce je sestavování desmosomů skutečně narušeno, což by podle mého názoru bylo minimum k tomu, aby tento soubor dat byl skutečně zajímavý a relevantní pro široké publikum.
Jak je popsáno v odpovědi 4 recenzentovi 1, nyní jsme exprimovali plnou délku Ecad WT a mutanty Ecad v keratinocytech EKO/PKD a prokázali jsme, že aminokyselina L175 zprostředkovává interakci s Dsg2 a usnadňuje časnou tvorbu desmosomů v buňkách, jak je hodnoceno pomocí náboru DP. Tyto údaje jsou popsány v podkapitole „Ecad L175 je nezbytná pro účinný mezibuněčný nábor Dsg2 a sestavování desmosomů“ rukopisu. Příslušné obrázky jsou uvedeny na obrázku 5 a na obrázku 5-figure supplement 1. Použité metody jsou popsány v podkapitole „Izolace, kultivace, transfekce a konfokální zobrazování primárních keratinocytů“.
2) Také s ohledem na skutečnost, že interakce je nezávislá na vápníku, zatímco klasické kadherin dependentní časné sestavení desmosomu vyžaduje přítomnost vápníku (což není vůbec diskutováno).
Děkujeme recenzentovi za tuto zasvěcenou poznámku. Jak je popsáno v podkapitole „Ecad L175 je nezbytný pro účinný mezibuněčný nábor Dsg2 a sestavení desmosomu“, konfokální zobrazování mutantního Ecad exprimovaného v myších keratinocytech nyní ukazuje, že sestavení desmosomu je iniciováno v místech Ca2+ závislé trans homodimerizace Ecad. Na základě našich údajů navrhujeme model, podle kterého je sestavování desmosomů usnadněno jak přímými cis interakcemi Ecad a Dsg2, tak trans vazbou opačných Ecad. V našem modelu slouží trans homodimerizace Ecad z protilehlých buněk jako prostorový signál pro koordinaci sestavování desmosomů. Ecad následně vytváří cis dimerní komplexy s Dsg2. Po lokalizaci v nativním desmosomu se Dsg2 oddělí od Ecad a naváže se na Dsc2 za vzniku zralého desmosomu. Jelikož komplex Dsc2/Dsg2 má delší životnost než komplex Ecad/Dsg2 i komplex Dsc2/Dsc2, umožňuje to pravděpodobně robustní adhezi mezi buňkami a umožňuje zralému desmosomu odolávat mechanické síle. Tento model je popsán na obrázku 6 a v části Diskuse.
3) Vzhledem k tomu, že se jedná o zcela novou interakci s nízkou afinitou, je pravděpodobně obtížné provádět jakékoliv interakční testy v kontextu buněk, v nichž jedna buňka exprimuje E-cadherin a druhá Dsg2, aby bylo možné zkoumat, zda k nějaké interakci dochází. Jelikož jsou však jejich údaje částečně založeny na modelování, měli by autoři také vytvořit mutanta, ve kterém jsou mutovány A125 a A124, aby poskytli mnohem lepší důkaz o existenci navrhovaných y-dimerů.
Protože výsledky dokování proteinů nejsou robustní, vyřadili jsme nyní tyto údaje z rukopisu. Nicméně naše experimenty s keratinocyty EKO/PKD, které ukazují, že mutace aminokyseliny L175 na Ecad zhoršuje nábor Dgs2 a zejména DP do míst tvorby časných kontaktů, prokazují, že Ecad-L175 usnadňuje tvorbu desmosomů v buňkách, potvrzují naše biofyzikální výsledky.
Shrnutí:
Recenzenti se domnívají, že biofyzikální údaje jsou sice přesvědčivé, ale k podpoře závěrů učiněných na základě údajů na obrázcích 3 a 5 je zapotřebí důkladnější kvantitativní analýzy. V zásadě lze tyto obavy řešit spíše další analýzou dat než experimenty a v tomto případě bychom zvážili revidovaný rukopis.
Děkujeme redakci za tuto povzbudivou recenzi. Jak je popsáno níže, náš revidovaný rukopis řeší všechny zdůrazněné problémy.
1) Závěr, že interakce E-cadherin-Dsg je nutná pro počáteční tvorbu desmosomů, je založen na kolokalizaci Dsg a E-cadherinu, která se snižuje s dozráváním spoje. Na obrázku 3 však není jasné, zda je pozorovaná kolokalizace s DP významná nad rámec očekávaný náhodou, nebo vzniká v důsledku časově závislých změn v subcelulární lokalizaci E-kadherinu, které nesouvisí se zráním spoje. Na obrázku 3C kontrolní experimenty zobrazené v pravém panelu zdůrazňují kolokaci Dsg2 a DP – známých složek desmosomu – a ukazují těsnou shodu fluorescenčních signálů ve všech třech časových bodech. Naproti tomu exprese E-cadherinu a DP v levých panelech se sice do jisté míry překrývají, ale nevykazují takovou shodu v signálech, jaká byla pozorována u kontrolních experimentů. Odpověď na původní body recenze na toto téma (např. recenzent 1, bod 3) se zaměřuje na definici desmosomu, ale nezabývá se výše uvedeným bodem.
Rádi bychom objasnili, že neměříme kolokaci, ale namísto toho nábor buď Ecad, nebo Dsg2 do oblastí membrány, které vykazují vzor „železniční dráhy“ DP. Aby to bylo jasnější, upravili jsme nyní revidovaný rukopis tak, aby zdůrazňoval, že Ecad je „obohacen v rodících se desmosomech“, a ne že je „vyloučen ze zralých desmosomů“.
Abychom přímo reagovali na obavy recenzentů týkající se našeho měření obohacení Ecad v desmosomech, ukazujeme nyní, že relativní hladiny Ecad podél celé buněčné hranice (poměr Ecad:DP na buněčných hranicích) zůstávají v průběhu času nezměněny. Tyto údaje potvrzují, že obohacení Ecad v rámci DP kolejnic v časných časových bodech je specifické pro desmosomální oblasti membrány a je významné nad rámec očekávaný náhodou nebo v důsledku změn v lokalizaci E-cadherinu, které nesouvisí se zráním spojů. Tato data jsou uvedena na obrázku 3-figure supplement 1 a jsou popsána v podsekci „Ecad je přítomen v nascentních desmosomech, ale ne ve zralých desmosomech“.
Konec, protože liniové skeny uvedené na obrázku 3 byly matoucí, odstranili jsme tyto liniové skeny z revidovaného rukopisu. Místo toho nyní na obrázku 3B ukazujeme několik reprezentativních snímků desmosomálních oblastí v lidských keratinocytech kultivovaných v médiu s vysokým obsahem Ca2+ po dobu 1, 3 nebo 18 hodin. Tyto výsledky zdůrazňují hlavní sdělení obrázku 3C:
2) Podobné obavy byly vyjádřeny v souvislosti s obrázkem 5, který má ukazovat, že Ecad L175 je nezbytný pro účinný mezibuněčný nábor Dsg2 a sestavování desmosomů. Obrázky v panelu A skutečně ukazují dramatický rozdíl v lokalizaci Dsg2 a DP ve srovnání s WT nebo mutovaným kadherinem. Zatímco Dsg2 a DP se kolokují s WT nebo K14E Ecad na spojích, zůstávají v oddělených punctech obklopujících spoj L175D Ecad a nelokalizují se s ním. Není však jasné, co autoři k testování významu tohoto fenotypu kvantifikovali. V části B, co je to „% spojů tvořících kontakty“? Jak je definován kontakt? Jaké spoje měří? AJ nebo desmosomy? V bodech C a E, co mají na mysli pod pojmem % Dsg2 nebo DP pozitivních spojů? Jak byly definovány spoje?
Nyní jsme přidali panel obrázků (obr. 5-figure supplement 1A), který ilustruje kritéria kvantifikace a kategorie spojů, které byly použity v naší analýze. Tento panel ukazuje příklady buněk transfekovaných mutantem Ecad, které nevykazují (levý panel) nebo vykazují (pravý panel) tvorbu mezibuněčných AJ. Pro nábor Dsg2 nebo DP jsme kvantifikovali pouze ta mezibuněčná rozhraní, u nichž byly pozorovány zipy AJ. Ve vložených obrázcích na panelu ukazujeme příklady AJ pozitivních kontaktů, které jsou buď pozitivní pro DP, nebo negativní pro DP.
V podkapitole „Ecad L175 je nezbytný pro účinný mezibuněčný nábor Dsg2 a sestavování desmosomů“ rukopisu nyní uvádíme, že schopnost transfekovaných keratinocytů tvořit AJ byla nejprve hodnocena podle tvorby „zipů“ Ecad na mezibuněčných kontaktech. Již dříve jsme ukázali, že tyto zipy představují rané AJ a rekrutují markerové proteiny AJ, jako je vinculin (Rübsam et al., 2017). Zkoumali jsme pouze mezibuněčná rozhraní se zipy AJ, a to z hlediska jejich schopnosti rekrutovat na tyto kontakty Dsg2 a DP. Důležité je, že jsme nikdy nepozorovali obohacení desmosomálních složek na mezibuněčných kontaktech v nepřítomnosti zipů AJ (Michels et al., 2009).
Jak je popsáno v odpovědi 3a níže, nyní v části Diskuse diskutujeme, že ačkoli Dsg2 a DP vykazují během 3 hodin určitou kolokaci na zipech pozitivních na Ecad, dochází také k nepřekrývajícímu se barvení spojů, což naznačuje, že AJ a desmosomy se již začínají segregovat do samostatných mezibuněčných spojů. Tuto kolokaci jsme v našem rukopise nekvantifikovali, protože hlavním smyslem našich experimentů bylo ukázat význam L175 pro rekrutování Dsg2 na mezibuněčná rozhraní a usnadnění tvorby desmosomů (což ilustruje rekrutování DP na mezibuněčné kontakty). Domníváme se, že zpoždění v náboru mezi WT, mutantem L175 a mutantem K14, které je kvantifikováno na obrázku 5, tento bod ilustruje.
3) V části Úvod a Diskuse jsou také nutné úpravy, které se týkají výše uvedených bodů a také přístupnosti článku:
a) Souvisí s výše uvedenými body, souvislost mezi vazebnými experimenty in vitro a navrhovanou biologickou úlohou se zdá být slabá na základě lokalizačních studií, které odhalují překrývající se, ale nikoli skutečně kolokabilní vzorce barvení. Autoři musí toto zjištění vysvětlit; možná je kolokace dynamická a/nebo je na Dsg2 vázána pouze podmnožina molekul E-cadherinu. Tento bod je přinejmenším třeba prodiskutovat, aby bylo možné racionalizovat výsledky lokalizačních experimentů s navrhovaným modelem.
Vzhledem k přechodné povaze interakcí Ecad/Dsg2 se očekává, že desmosomální proteiny rekrutované do spojů se rychle oddělí od Ecad. V důsledku toho se očekává, že obrazy mezibuněčných rozhraní budou mít jak překrývající se, tak oddělené vzorce barvení Ecad a desmosomálních proteinů. Ve shodě s tím, ačkoli Dsg2 a DP vykazují určitou kolokaci na Ecad-pozitivních zipech (obr. 5), je pozorováno významné nepřekrývající se barvení spojů, a to i během prvních 3 hodin. To naznačuje, že AJ a desmosomy se rychle segregují do samostatných mezibuněčných spojů. Nyní to uvádíme v části Diskuse.
b) Na začátku části Diskuse autoři tvrdí, že:
: „identifikují dvě kritické události, které iniciují a podporují efektivní sestavení desmosomů: (i) stabilní trans homodimerizaci Ecad a (ii) přímou heterofilní vazbu ektodomén Ecad a Dsg2. Naše data ukazují, že sestavení desmosomu je iniciováno v místech trans homodimerizace Ecad. Následně se Ecad a Dsg2 vážou prostřednictvím konzervovaného Leu 175 na cis vazebném rozhraní Ecad a vytvářejí krátkodobé heterofilní komplexy, které se lokalizují v časných desmosomech a účinně rekrutují desmosomální proteiny do míst tvorby mezibuněčných kontaktů. Když desmosomy dozrají, Dsg2 disociuje od Ecad a vytváří stabilní vazby s Dsc2, které zprostředkovávají robustní adhezi.“ – Tento odstavec směšuje pozorování, interpretaci a hypotetické modely a jako takový je zavádějící. Měli by oddělit shrnutí výsledků od interpretace a svého modelu.
Podle návrhu recenzentů jsme z prvního odstavce části Diskuse odstranili interpretace a nyní pouze shrnují výsledky.
c) Autoři v abstraktu a úvodu píší: „Ecad interaguje s Dsg2 prostřednictvím konzervovaného Leu 175 na vazebném rozhraní Ecad cis.“. – Autoři by neměli předpokládat, že čtenáři znají homofilní interakce E-cad, a měli by to explicitně vysvětlit.
V Abstraktu nyní uvádíme: „Předchozí studie ukazují, že E-cadherin (Ecad), adhezivní protein, který interaguje v trans i cis konformacích, usnadňuje sestavování desmosomů prostřednictvím neznámého mechanismu.“
V Úvodu nyní dále uvádíme: „V tomto případě se jedná o adhezivní protein: „Vzhledem k tomu, že Ecad interaguje laterálně a vytváří cis-dimery na stejném povrchu buňky (Harrison et al., 2011), zatímco molekuly Ecad z protilehlých buněk interagují v trans konformaci dimeru s výměnou vláken (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2007; Vendome et al., 2011) a trans konformaci X-dimeru (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), použili jsme mutanty, které specificky ruší trans nebo cis interakce Ecad, a testovali jsme jejich vazbu na Dsg2 nebo Dsc2′. Konečně v úvodu nyní uvádíme, že „Předchozí strukturní studie ukázaly, že L175 zprostředkovává homofilní cis dimerizaci Ecad (Harrison et al., 2011).“
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013.