E-cadherin liga-se ao desmoglein para facilitar a montagem do desmosome
1) Este artigo aborda o mecanismo de regulação da montagem do desmosome mediado por cadherin. Embora os revisores concordem que o trabalho é potencialmente excitante, eles levantaram várias questões significativas. Primeiro, todos concordam que o modelo deve ser testado examinando a co-localização em células que expressam o mutante cadherin.
Agradecemos aos revisores por sugerirem estes importantes experimentos. Como descrito em nossa resposta detalhada aos revisores, agora testamos o papel das diferentes mutações Ecad no impedimento do recrutamento de Dsg2 em queratinócitos. Expressámos Ecad WT de comprimento total, e Ecad mutantes (L175D, K14E, e W2A-K14E) em Ecad-knockout, Pcad-knockdown de queratinócitos de rato (EKO/PKD) e analisámos o recrutamento de Dsg2 para locais de contactos intercelulares. Estes resultados confirmam que o aminoácido L175 no Ecad, medeia as interações Dsg2 e facilita a formação precoce de complexos desmossómicos nas células. Nossos experimentos também revelam que a montagem do desmosoma é iniciada em locais de homodimerização trans Ecad.
2) Há também preocupações sobre a confiabilidade dos dados de co-localização na Figura 5; uma análise mais rigorosa é necessária para demonstrar que a co-localização de E-cadherin e desmoplakin ocorre muito mais do que seria esperado por acaso.
No campo, os desmosomas são identificados pelo tamanho e aparência da trilha ferroviária da coloração do DP em imagens SIM. Como descrito na nossa resposta aos revisores, usamos esta abordagem estabelecida para localizarmos os desmosomas. Além disso, agora enfatizamos que não estamos medindo a colocalização, mas sim o recrutamento de diferentes caderins (Ecad e Dsg) para regiões da membrana que exibem esse padrão.
3) Em segundo lugar, a modelagem assume que L175 faz parte da interface, mas sem avaliação da estequiometria não se pode descartar que a perda da ligação seja um efeito indireto da perda da dimerização do cis. A modelagem também é vista como fraca uma vez que não foram testadas interfaces complementares em Dsg2. Sem tais dados a modelagem molecular precisa ser considerada altamente especulativa.
Como descrito em nossa resposta detalhada aos revisores, simulações computacionais anteriores e experimentos biofísicos mostram que a formação do Ecad cis-dímero requer dimerização trans prévia. Conseqüentemente, Ecads não pode se ligar à superfície como isolados, pré-formados, cis-dímeros. Isso torna extremamente improvável que as interações de ligação medidas ocorram entre Ecad cis-dimers e Dsg2. No entanto, concordamos com os revisores que os resultados da acoplagem molecular são bastante fracos. Portanto, eliminamos estes resultados de modelagem do manuscrito.
4) Finalmente, como observado pelo revisor 3, mesmo que suportado por estas adições, o modelo e a seção Discussão não explicam realmente como E-cadherin regula os desmosomas.
Baseado nos nossos novos dados de função de estrutura celular, propomos agora um modelo em que a montagem do desmosome é facilitada tanto pelas interações cis diretas do Ecad e Dsg2 como pela ligação trans do Ecad oposto. Em nosso modelo, a homodimerização trans de Ecad a partir de células opostas serve como um taco espacial para coordenar a montagem do desmosoma. Ecad posteriormente forma complexos cis-dimer com Dsg2 para iniciar a assemblagem do desmosoma. O modelo é apresentado e discutido no novo manuscrito.
Reviewer #1:
1) Os experimentos de AFM monomolécula são a parte mais sólida do trabalho. No entanto, na minha leitura os autores não excluem a possibilidade de que os eventos de encadernação que observam possam ser devidos a interações entre os cis-dimers de E-cadherin pré-formados. A estequiometria da interação é importante para estabelecer, pois se a ligação a Dsg2 envolvida exigisse um cis-dímero de E-cadherin, isso mudaria a interpretação do resultado de que a mutação L175D bloqueia a interação Dsg2/E-cad. Tal cenário também desafiaria a validade das simulações de acoplamento. Na minha leitura, a baixa probabilidade de ligação por contacto da ponta do AFM com a superfície é uma fraca evidência de que a ligação reflecte necessariamente a interacção de dois monómeros, nem a baixa densidade média das moléculas de cadherina na superfície. Além disso, os cadherins são imobilizados com estreptavidina, que tem múltiplos sítios de ligação de biotina.
Por estas razões, eu acho que provar que a heterodimerização ocorre entre monômeros é importante. Para isso, eu recomendaria medir sistematicamente a probabilidade de interação da ponta com a superfície em função da densidade da superfície areal do E-cadherin na superfície da lamela. Se a interação de fato requer E-caderina monomérica, esta medida deve ser escalada linearmente com E-caderina adicionada, pelo menos em densidades baixas. No entanto, esta medida específica não é necessária – qualquer medida que estabeleça a estequiometria fará.
Simulações anteriores em computador (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) mostraram que a homodimerização Ecad cis requer a formação prévia de trans-dímeros Ecad. Da mesma forma, medições anteriores de uma única molécula FRET mostraram que não é possível formar isoladamente Ecad cis-dimers, mesmo quando os monômeros Ecad são colocados muito próximos em uma orientação cis (Zhang et al., 2009). Em conjunto, estes resultados sugerem que nos nossos experimentos, Ecads não podem ser imobilizados na ponta do AFM ou no substrato como cis-dimers pré-formados. Consequentemente, a falha do mutante Ecad-L175D em interagir com Dsg2 não é devido à ausência de dimerização do Ecad cis. Agora discutimos isso na subseção “Leu 175 medeia as interações de Ecad e Dsg2” do manuscrito.
Felizmente, as limitações técnicas não permitem o experimento de estequiometria protéica que o revisor sugere. Em nossos experimentos, usamos densidades de superfície protéica que nos permitem identificar sem ambigüidade eventos únicos de ligação a partir do alongamento correspondente das amarras de PEG. Se a densidade da superfície do cadherin for aumentada, como proposto pelo revisor, a probabilidade de múltiplos eventos simultâneos de ligação Ecad aumenta, o que torna uma análise quantitativa da probabilidade de ligação protéica não confiável. Por esta razão (juntamente com a fraqueza intrínseca da nossa análise de acoplamento), excluímos as simulações de acoplamento de proteínas do manuscrito.
Finalmente, no manuscrito revisado, agora usamos a análise de agrupamento para agrupar os eventos de desacoplamento de molécula única para Espectroscopia de Força Dinâmica (DFS). Nós mostramos recentemente que o algoritmo K significa clustering que nós empregamos, melhora muito a estimativa dos parâmetros cinéticos na DFS (Yen e Sivasankar, 2018). Consequentemente, os tempos de vida que agora relatamos para as interações Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2, e Dsc2/Dsc2 são mais confiáveis.
2) As simulações de acoplamento são interessantes, mas na minha opinião oferecem evidências fracas para a geometria de ligação específica que os autores propõem. Eu recomendaria fortemente que os autores sejam mais cautelosos na interpretação e apresentação destes resultados, ou alternativamente apresentem dados adicionais, por exemplo imagens EM, que suportem ou refutem o resultado computacional.
Concordamos com o revisor que os dados de docking de proteínas são fracos. Portanto, eliminamos estes resultados do manuscrito.
3) Infelizmente, as imagens SIM não são convincentes como as apresentadas atualmente. Em particular, não está claro o que conta como “desmosome” na análise dos autores (Figura 5B). Um tratamento mais sofisticado da colocalização seria necessário para estabelecer o ponto que E-cadherin e desmoplakin colocalizam, e que esta colocalização diminui à medida que as junções amadurecem.
Em estudos anteriores (Stahley et al., 2016a, 2016b) utilizamos a aparência de “trilho rodoviário ferroviário” do DP como revelado pelas imagens de super-resolução para definir os desmosomas por imunofluorescência (como mostrado na Figura 3A). Outros no campo também utilizaram a morfologia da via férrea para identificar os desmosomas nas imagens SIM (ver, por exemplo: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). O tamanho e a organização destas estruturas, como revelado pelo SIM, é totalmente consistente com as definições clássicas de desmosomas do EM. Nós medimos a intensidade de pixels para os dois cadherins (Ecad ou Dsg2) dentro destas estruturas usando análise de imagem padrão. O importante é que não estamos tentando reivindicar a co-localização. Ao invés disso, estamos medindo o recrutamento de cadherin para domínios de membrana que exibem padrões de coloração da via férrea DP. Nós apreciamos que às vezes é difícil discernir os trilhos de ferrovia em pontos iniciais. Por esta razão, a primeira vez que sentimos que podíamos identificar manchas bona fina de trilhos de ferrovia foi em 1 hora. Além disso, só estamos fazendo medições em locais onde podemos observar padrões de trilhos ferroviários rodoviários, em vez de puncta DP. Finalmente, nossa descoberta de que o Ecad está presente em desmosomas nascentes é consistente com experimentos imunológicos clássicos mostrando que o Ecad pode se localizar a desmosomas (Jones, 1988). Portanto, nos sentimos confiantes em nossa capacidade de identificar os desmosomas e medir os níveis relativos dos dois cadherins em momentos diferentes.
4) Deixo este ponto final a critério do editor. Na minha opinião, os dados de colocalização, mesmo se considerados verdadeiros, não estabelecem relevância funcional. Seria muito bom ver um experimento de knockdown/reconstitution com L175D E-cadherin. A previsão é que esta molécula nunca se colocaria com desmoplakin, independentemente da idade da junção. A violação desta previsão colocaria em dúvida o modelo preferido dos autores.
Baseado na sugestão do revisor, agora realizamos experimentos para testar diretamente o papel das diferentes mutações do domínio extracelular Ecad no impedimento do recrutamento de DP e Dsg2 em queratinócitos. Esses dados são descritos na subseção “Ecad L175 é essencial para o recrutamento eficiente de Dsg2 intercelular e para a montagem do desmosoma”. As imagens correspondentes são mostradas na Figura 5 e na Figura 5 – Suplemento 1. Os métodos utilizados estão descritos na subsecção “Isolamento, cultura, transfecção e confocalização de queratinócitos primários”. Para esses experimentos, utilizamos queratinócitos de mouse EKO/PKD, que não expressam praticamente nenhum caderneto clássico. Mostramos anteriormente que esses queratinócitos EKO/PKD são incapazes de montar AJs e desmosomas devido à perda de todos os caderinatos clássicos (Michels et al., 2009). Estas células nos permitem assim avaliar diretamente a capacidade dos mutantes Ecad de i) iniciar a formação do AJ e ii) avaliar sua capacidade de recrutar componentes desmosomais para locais de formação inicial de contato celular.
Desde que estivemos interessados em avaliar a capacidade dos mutantes Ecad de recrutar proteínas desmosomais precocemente durante a formação da junção, nós expressamos ou Ecad WT de comprimento total ou mutantes em queratinócitos EKO/PKD e analisamos o recrutamento de DP e Dsg2 para locais de contatos intercelulares usando microscopia confocal. Para examinar o recrutamento em diferentes estágios de formação e maturação da junção, os queratinócitos foram fixados e imunizados para DP, Dsg e Ecad em três pontos de tempo após a troca de Ca2+ (3 horas, 6 horas e 18 horas).
Nossos dados mostraram que 3 horas após a troca de Ca2+, 93% do WT-Ecad foi enriquecido em AJs iniciais tipo zíper nos locais de contatos intercelulares. Em contraste, apenas 48% dos queratinócitos L175D-Ecad transfectados formaram zíperes AJ, provavelmente devido à formação de ecad cis-dímeros (Figura 5 A, B). Nesses momentos iniciais, após a troca do Ca2+, 66% e 91% dos contatos do WT-Ecad foram positivos para Dsg2 e DP respectivamente (Figura 5 A, C, D, E). Quando as células puderam se engajar na adesão intercelular dependente de Ca2+ por 18 horas, as localizações juncionais de Ecad-Dsg2 e Ecad-DP aumentaram para 97% e 100% respectivamente (Figura 5 A, C, D, E). Em contraste, apenas 39% dos contatos com zíper induzido por L175 apresentaram recrutamento de Dsg2 3 horas após a mudança para Ca2+ alto, que aumentou para 65% às 18 horas (Figura 5 A, C), confirmando que uma interação direta entre Ecad e Dsg2 é necessária para o recrutamento eficiente de Dsg2 para contatos intercelulares precoces. Da mesma forma, após 3 horas, apenas 28% dos contatos intercelulares L175D-Ecad estabelecidos foram positivos para DP, o que foi aumentado para 72% após 18 horas, sugerindo um mecanismo compensatório em estágios posteriores (Figura 5 D, E).
Para confirmar que o efeito observado da mutação L175D não foi devido à formação de AJ, nós transfundimos os queratinócitos EKO/PKD com o mutante Ecad-K14E de comprimento total que aboliu a formação do dímero X e aprisiona o Ecad em uma conformação do dímero de troca de fios. Nossos dados mostraram que apenas 4% das células em contato transfectadas formaram zíperes no início (3 horas) após a mudança para Ca2+ alto, com apenas 24% das células em contato transfectadas mostrando zíperes no final (18 horas) de tempo (Figura 5 A, B, Figura 5 – suplemento 1), confirmando que o K14 é essencial para a formação efetiva do AJ e, portanto, estabelecimento de contato intercelular. Entretanto, os poucos K14E AJs que foram formados, recrutaram Dsg2, e principalmente DP, de forma mais eficiente do que L175D (Figura 5 A, C, E, Figura 5 – Suplemento de 5 dígitos 1). Esse resultado confirmou que o atraso no recrutamento de Dsg2 para contatos intercelulares não foi resultado da incapacidade do Ecad L175D de formar AJs de forma eficiente, mas sim devido à ausência de interação direta entre Ecad e Dsg2. Como nunca houve co-localização de DP e Ecad na ausência de zíperes (Figura 5 – Suplemento 1), os dados também sugerem que as interações trans do Ecad precedem as interações Ecad/Dsg2. Esta conclusão é ainda reforçada pela nossa constatação de que não foi observado recrutamento de DP ao abolir a adesão de Ecad trans, e portanto zíperes, através da transfecção do Ecad-DM (W2A-K14E duplo mutante, Figura 5-figuras do suplemento 1) em queratinócitos EKO/PKD. Tomados em conjunto estes resultados confirmam que o aminoácido L175 medeia as interações Dsg2 e facilita a formação precoce do complexo desmossoma nas células.
Reviewer #2:
1) A descoberta de que o resíduo de E-cadherina L175 é crítico para a interação com Dsg2 é intrigante. No entanto, não são identificados resíduos de parceiros que interagem. Nesta circunstância, a previsão de uma conformação para interação E-cadherin/Dsg2 pela acoplagem parece precária; parece incerto que a conformação prevista está relacionada com a verdadeira conformação vinculada.
Concordamos com o revisor que os dados de acoplamento de proteínas são especulativos e portanto eliminamos estes resultados do manuscrito.
2) Há apenas uma tênue conexão da interação Dsg2/E-cadherin proposta com a biologia da montagem do desmosome. No entanto, os autores parecem ter um claro caminho a seguir. Eles argumentam que a presença de E-cadherin em desmosomas nascentes (avaliada experimentalmente através da co-mancha para desmoplakin na Figura 5) é evidência do papel da associação Dsg2/E-cadherin que eles identificaram. Agora que eles identificaram um mutante que impede essa associação, os experimentos da Figura 5 realizados com o mutante devem levar a resultados diferentes. Este experimento adicionaria substancialmente ao rigor deste trabalho.
Como descrito na resposta 4 ao revisor 1, nós expressamos o TW Ecad de comprimento total, e os mutantes Ecad em queratinócitos EKO/PKD e analisamos o recrutamento de Dsg2 e DP para locais de contatos intercelulares. Estes resultados confirmam que o aminoácido L175 medeia as interações Dsg2 e facilita a formação precoce de complexos desmossómicos nas células. Esses dados são descritos na subseção “Ecad L175 é essencial para o recrutamento eficiente de Dsg2 intercelular e a montagem do desmosoma” do manuscrito. As imagens correspondentes são mostradas na Figura 5 e na Figura 5 – Suplemento 1. Os métodos utilizados são descritos na subseção “Isolamento, cultura, transfecção e imagem confocal de queratinócitos primários”.
Reviewer #3:
1) Este manuscrito identifica e caracteriza uma interação molecular entre E-cadherina e Desmoglein 2 usando proteínas isoladas e mostra aumento da colocalização entre essas duas moléculas em queratinócitos precocemente durante a montagem do desmosoma. Estas são observações potencialmente muito interessantes que podem explicar como os cadherins clássicos controlam a montagem dos desmosomas. Embora isto seja bem documentado por vários grupos na literatura, os mecanismos subjacentes ainda são, na sua maioria, desconhecidos. No entanto, a sua conclusão “As nossas experiências integradas com uma única molécula, previsões de ancoragem de proteínas e imagens de super-resolução baseadas em células mostram que as interacções Ecad/Dsg2 desempenham um papel importante na montagem inicial do desmosoma”, afirmada no início da secção Discussão, é um exagero bastante forte dado que a interacção é baseada na caracterização de domínios extracelulares isolados e microscopia estática, embora de alta resolução. Nenhuma experiência é feita para mostrar que quando se perturba essa interação a assembléia do desmosoma é de fato prejudicada, o que na minha opinião seria o mínimo para tornar esse conjunto de dados realmente interessante e relevante para um amplo público.
Como descrito na resposta 4 ao revisor 1, nós agora expressamos Ecad WT de comprimento total, e Ecad mutantes em queratinócitos EKO/PKD e mostramos que o aminoácido L175 medeia as interações Dsg2 e facilita a formação precoce do desmosoma nas células, conforme avaliado pelo recrutamento do DP. Estes dados são descritos na subseção “Ecad L175 é essencial para o recrutamento intercelular eficiente de Dsg2 e a montagem do desmosoma” do manuscrito. As imagens correspondentes são mostradas na Figura 5 e na Figura 5 – Suplemento 1. Os métodos utilizados são descritos na subseção “Isolamento, cultura, transfecção e confocalização de queratinócitos primários”.
2) Também, tendo em vista que a interação é independente do cálcio, enquanto que a clássica montagem precoce do desmosoma dependente de caderina requer a presença de cálcio (que não é discutida de forma alguma).
Agradecemos ao revisor por este comentário perspicaz. Como descrito na subseção “Ecad L175 é essencial para o recrutamento eficiente de Dsg2 intercelular e montagem do desmosoma”, a imagem confocal do Ecad mutante expresso em queratinócitos de camundongos agora revela que a montagem do desmosoma é iniciada em locais de homodimerização trans do Ecad dependente de Ca2+. Com base nos nossos dados, propomos um modelo em que a montagem do desmosoma é facilitada tanto pelas interacções directas cis do Ecad e Dsg2 como pela ligação trans do Ecad oposto. Em nosso modelo, a homodimerização trans de Ecad a partir de células opostas serve como um taco espacial para coordenar a montagem do desmosoma. Ecad posteriormente forma complexos cis dimer com Dsg2. Uma vez localizado dentro do desmosoma nativo, o Dsg2 dissocia-se do Ecad e liga-se ao Dsc2 para formar desmosomas maduros. Como o complexo Dsc2/Dsg2 tem uma vida útil mais longa que o complexo Ecad/Dsg2 e o complexo Dsc2/Dsc2, isso provavelmente permite a adesão robusta de células e permite que o desmosoma maduro resista à força mecânica. Este modelo é descrito na Figura 6, e na seção Discussão.
3) Como esta é uma interação totalmente nova de baixa afinidade, é provavelmente difícil fazer qualquer ensaio de interação no contexto de células em que uma célula expressa E-cadherin e a outra Dsg2 para examinar se há alguma interação. Entretanto, como seus dados são parcialmente baseados em modelagem, os autores também devem gerar um mutante no qual o A125 e o A124 são mutantes para fornecer evidências muito melhores para a existência do proposto de y-dimers.
Desde que os resultados de acoplamento de proteínas não são robustos, eliminamos agora estes dados do manuscrito. Entretanto, nossos experimentos com queratinócitos EKO/PKD mostrando que a mutação do aminoácido L175 no Ecad prejudica o recrutamento de Dgs2 e especialmente DP para locais de formação de contato precoce, demonstra que o Ecad-L175 facilita a formação de desmosomas nas células, confirma nossos resultados biofísicos.
Sumário:
Os revisores acham que enquanto os dados biofísicos são convincentes, uma análise quantitativa mais rigorosa é necessária para apoiar as conclusões feitas a partir dos dados das Figuras 3 e 5. Em princípio estas preocupações podem ser tratadas com análise de dados adicionais ao invés de experimentos, e neste caso, consideraríamos um manuscrito revisado.
Agradecemos ao editor por esta revisão encorajadora. Como descrito abaixo, nosso manuscrito revisado aborda todas as questões destacadas.
1) A conclusão de que a interação E-cadherin-Dsg é necessária para a formação inicial do desmosoma é baseada na colocação de Dsg e E-cadherin diminuindo à medida que a junção amadurece. Entretanto, na Figura 3 não está claro se a colocalização observada com o DP é significativa além do esperado por acaso ou decorre de mudanças dependentes do tempo na localização sub celular de E-cadherina sem relação com o amadurecimento da junção. Na Figura 3C, os experimentos de controle mostrados no painel direito destacam a co-localização de Dsg2 e DP – conhecidos componentes Desmosome – e mostram uma correspondência próxima em sinais fluorescentes em todos os três pontos de tempo. Em contraste, enquanto a expressão de E-cadherin e DP nos painéis da esquerda parece se sobrepor em algum grau, eles não mostram a correspondência em sinais observados para os experimentos de controle. A resposta aos pontos de revisão originais sobre este assunto (por exemplo, revisor 1, ponto 3) foca na definição de um desmosoma, mas não aborda o ponto acima.
Gostaríamos de esclarecer que não estamos medindo a co-localização, mas sim o recrutamento de Ecad ou Dsg2 para regiões da membrana que exibem um padrão de ‘via férrea’ do DP. Para tornar isso mais claro, agora modificamos o manuscrito revisado para enfatizar que o Ecad é ‘enriquecido em desmosomas nascentes’ ao invés de ser ‘excluído dos desmosomas maduros’.
Para abordar diretamente as preocupações dos revisores com relação à nossa medição do enriquecimento do Ecad em desmosomas, agora mostramos que os níveis relativos do Ecad ao longo de toda a fronteira celular (razão Ecad:DP nas fronteiras celulares) permanecem inalterados ao longo do tempo. Estes dados confirmam que o enriquecimento de Ecad dentro dos trilhos da ferrovia DP em pontos iniciais é específico para regiões desmosomais da membrana e é significativo além do esperado por acaso ou por causa de mudanças na localização de E-cadherin sem relação com a maturação da junção. Os dados são mostrados na Figura 3 – Suplemento 1 e são descritos na subseção “Ecad está presente em desmosomas nascentes, mas não em desmosomas maduros”.
Finalmente, como as varreduras de linha mostradas na Figura 3 eram confusas, eliminamos as varreduras de linha do manuscrito revisado. Em vez disso, na Figura 3B, agora mostramos várias imagens representativas de regiões desmosomais em queratinócitos humanos cultivados em meios de alta Ca2+ durante 1, 3 ou 18 horas. Estes resultados enfatizam a principal mensagem de ‘take-away’ da Figura 3C: Os níveis de Ecad são enriquecidos em desmosomas nascentes, com níveis relativos decrescentes à medida que os desmosomas amadurecem.
2) Preocupações semelhantes foram levantadas em relação à Figura 5, que supostamente mostra que o Ecad L175 é essencial para o recrutamento eficiente de Dsg2 intercelular e a montagem dos desmosomas. As imagens no painel A mostram uma diferença dramática na localização de Dsg2 e DP em relação ao WT ou cadherin mutante. Enquanto Dsg2 e DP co-localizam com o WT ou K14E Ecad nas junções, eles permanecem em puncta separada flanqueando a junção L175D Ecad e não co-localizam com ela. Entretanto, não está claro o que os autores quantificaram para testar o significado deste fenótipo. Em B, o que é “% da junção formando contatos”? Como é definido um contacto? Quais são as junções que medem? AJ ou desmosomas? Em C e E, o que significam em% das junções Dsg2 ou DP positivas? Como foram definidas as junções?
Adicionamos agora um painel de figuras (Figura 5-figuras suplemento 1A) para ilustrar os critérios de quantificação e categorias juncionais que foram usados em nossa análise. Este painel mostra exemplos de células transfectadas com Ecad mutante que não mostram (painel esquerdo) ou não mostram (painel direito) a formação intercelular do AJ. Para o recrutamento de Dsg2 ou DP, quantificamos apenas as interfaces intercelulares nas quais foram observados zíperes AJ. Nos insets do painel de figuras, mostramos exemplos de contatos AJ positivos que são positivos para DP ou negativos para DP.
Na subseção “Ecad L175 é essencial para o recrutamento eficiente de Dsg2 intercelular e a montagem do desmosoma” do manuscrito, afirmamos agora que a habilidade dos queratinócitos transfetados em formar AJs foi primeiramente avaliada pela formação de padrões ‘zipper-like’ de Ecad nos contatos intercelulares. Mostramos anteriormente que esses zíperes representam os primeiros AJs e recrutam proteínas marcadoras de AJ como vinculin (Rübsam et al., 2017). Examinamos apenas as interfaces intercelulares com zíperes AJ, por sua capacidade de recrutar Dsg2 e DP para esses contatos. É importante ressaltar que nunca observamos qualquer enriquecimento de componentes desmosomais nos contatos intercelulares na ausência dos zíperes AJ (Michels et al., 2009).
Como descrito na resposta 3a abaixo, discutimos agora na seção Discussão que, embora Dsg2 e DP mostrem alguma co-localização nos zíperes Ecad-positivos em 3 horas, também há uma coloração juncional não sobreposta sugerindo que os AJs e desmosomas já estão começando a se segregar em junções intercelulares distintas. Não quantificamos essa co-localização em nosso manuscrito, pois o ponto principal de nossas experiências foi mostrar a relevância da L175 para o recrutamento de Dsg2 para interfaces intercelulares e facilitar a formação de desmosomas (como ilustrado pelo recrutamento de DP para contatos intercelulares). Acreditamos que o atraso no recrutamento entre WT, L175 mutante, e o K14 mutante, que é quantificado na Figura 5, ilustra este ponto.
3) Há também modificações na seção Introdução e Discussão necessárias para abordar os pontos acima, bem como a acessibilidade do papel:
a) Relacionado aos pontos acima, a ligação entre experimentos de ligação in vitro e o papel biológico proposto parece tênue, baseado em estudos de localização que revelam padrões de coloração sobrepostos, mas não verdadeiramente co-localizados. Os autores precisam explicar esse achado; talvez a co-localização seja dinâmica, e/ou apenas um subconjunto de moléculas de E-cadherina esteja ligado ao Dsg2. Este ponto precisa pelo menos ser discutido para racionalizar os resultados dos experimentos de localização com o modelo proposto.
De acordo com a natureza transitória das interações Ecad/Dsg2, espera-se que as proteínas desmosomais recrutadas para junções se segreguem rapidamente do Ecad. Consequentemente, espera-se que as imagens das interfaces intercelulares tenham padrões de coloração das proteínas Ecad e desmosomal sobrepostos e separados. De acordo, embora Dsg2 e DP mostrem alguma co-localização nos zíperes Ecad-positivos (Figura 5), uma coloração juncional significativa não sobreposta é observada, mesmo nas primeiras 3 horas. Isso sugere que os AJs e desmosomas rapidamente se separam em junções intercelulares distintas. Agora afirmamos isso na seção Discussão.
b) No início da seção Discussão, os autores afirmam que eles: “identificam dois eventos críticos que iniciam e promovem uma montagem eficiente do desmosoma: (i) a homodimerização trans estável de Ecad, e (ii) a ligação heterofílica direta de Ecad e Dsg2 ectodomains. Nossos dados demonstram que a montagem do desmosoma é iniciada nos locais de homodimerização trans do Ecad. Subsequentemente, Ecad e Dsg2 ligam-se através de um Leu 175 conservado na interface de ligação Ecad cis e formam complexos heterofílicos de curta duração que se localizam para desmosomas precoces e recrutam eficientemente proteínas desmosomais para locais de formação de contacto intercelular. À medida que os desmosomas amadurecem, o Dsg2 dissocia-se do Ecad e forma ligações estáveis com o Dsc2 para mediar a aderência robusta”. – Este parágrafo mistura observações, interpretação e modelos hipotéticos e, como tal, é enganador. Eles devem separar o resumo dos resultados da interpretação e seu modelo.
Como sugerido pelos revisores, eliminamos as interpretações do primeiro parágrafo da seção Discussão e agora apenas resumimos os resultados.
c) Os autores escrevem no Resumo e Introdução “Ecad interage com Dsg2 através de um Leu 175 conservado na interface de ligação do Ecad cis”. – Os autores não devem assumir que os leitores estão familiarizados com as interações homofílicas do E-cad e devem explicar isto explicitamente.
No Resumo, afirmamos agora que ‘Estudos anteriores demonstram que a E-cadherin (Ecad), uma proteína adesiva que interage tanto nas conformações trans como cis, facilita a montagem do desmosome via um mecanismo desconhecido’.
Outras vezes, na Introdução, afirmamos agora: Desde que Ecad interage lateralmente para formar cis-dimers na mesma superfície celular (Harrison et al., 2011) enquanto moléculas Ecad de células opostas interagem em uma conformação trans strand-swap dimer (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2007; Vendome et al., 2011) e uma conformação trans X-dimer (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), nós usamos mutantes que especificamente abolem as interações Ecad trans ou cis e testamos sua ligação com Dsg2 ou Dsc2′. Finalmente, na introdução, afirmamos agora que ‘Estudos estruturais anteriores mostraram que L175 medeia a dimerização homofílica do Ecad cis (Harrison et al., 2011)’.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013