Produkce lidského albuminu u prasat pomocí CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in Zygotes
Lidský sérový albumin (HSA) je nejrozšířenější plazmatický protein, který plní kritické homeostatické funkce v lidské fyziologii včetně udržování onkotického tlaku v plazmě, regulaci distribuce tělesných tekutin, transport malých molekul atd.1. Předepisuje se při řadě závažných onemocnění, jako je selhání jater a traumatický šok2. Vzhledem k nedostatku lidské krve a rizikům spojeným s lidskou krví se již dlouho hledá alternativní výroba lidského albuminu. O rekombinantní produkci HSA se dříve pokoušeli prasata prostřednictvím dominantní exprese transgenu ve formě fúze albuminu a GFP3. U transgenních přístupů je však vzhledem k přítomnosti endogenního prasečího albuminu separace a purifikace rHSA problematická. S využitím možností systému CRISPR/Cas9 při modifikaci genomu jsme se snažili vytvořit rHSA u prasat pomocí knokace lidské albuminové cDNA do prasečího albuminového lokusu. Vložením lidské cDNA ALB plus signální sekvence SV40 polyA (celkem 2368 bp) do prasečího lokusu Alb bezprostředně za počáteční kodon očekáváme, že lidský ALB bude exprimován pod transkripční kontrolou prasečího endogenního albuminu a zároveň bude blokovat expresi prasečího endogenního albuminu (obr. 1a). Navrhli jsme sgRNA zaměřenou na oblast počátečního kodonu (bezprostředně 5′ od ATG a včetně ATG) a vytvořili jsme cílový fragment (donor pro homologní rekombinaci) s insertem lemovaným z obou stran 1 kb homologními sekvencemi (obr. 1a). Protože 5′ homologická sekvence použitá v donoru vede až k počátečnímu kodonu, obsahuje sekvenci sgRNA, a proto může být cílená sgRNA jako donor nebo alela knockin po homologní rekombinaci. Abychom tomu zabránili, vložili jsme do sekvence sgRNA těsně před počáteční kodon 6 bp (gccacc). SgRNA byla přepsána in vitro, přečištěna a vstříknuta do oplozených oocytů spolu s Cas9 mRNA4 a kruhovým vektorem obsahujícím cílový fragment. Zdrojem oocytů byla miniprasátka Bama5. Injektovaná embrya byla kultivována po dobu 1-2 hodin před implantací do samic synchronizovaných s říjí. Bylo implantováno ~300 embryí 10 samicím, z nichž 5 zabřezlo a porodilo celkem 16 živých mláďat. Mláďata byla pod standardní péčí a nevykazovala žádné známky neobvyklých zdravotních problémů.
Knockin lidského ALB do prasečího lokusu Alb.
(a) Schéma strategie knockinu. (b) Genotypizace zakladatelů. PRC primery jsou znázorněny v (a). (c) Výsledky sekvenování produktů PCR získaných pomocí dvojice primerů e/f (a). Produkty byly klonovány a až 12 klonů (pro č. 9) bylo sekvenováno.
Přibližně ve věku 4 týdnů jsme 16 selatům odstřihli špičky uší a získali genomovou DNA pro genotypizaci. Abychom zjistili, zda se nám podařilo knockin provést, vyhodnotili jsme 5′ i 3′ konec místa inzerce. Použili jsme dva páry primerů, a/b a c/d (obr. 1a). Primer a je mimo použitý 5′-konec homologie a b je na lidském ALB (inzertu); c je na lidském ALB a d mimo 3′-konec homologie. Jak ukazuje obr. 1b, všech 16 selat nese zamýšlenou alelu knockin. Klonovali jsme a sekvenovali všechny amplifikované fragmenty DNA. Jednalo se o očekávané produkty homologní rekombinace (obr. S1). Dále jsme u těchto selat určili stav alely divokého typu. Primery e a f (obsažené v insertu) (obr. 1a) měly amplifikovat 705 bp fragment z lokusu divokého typu a 3085 bp fragment z knockin alely. Podle očekávání všechny z nich generovaly fragment o velikosti 3085 bp. Neočekávaně se však podařilo získat zjevný 705 bp fragment divokého typu pouze ze 7 (č. 5, 6, 9, 10, 12, 13 a 15) ze 16 vzorků, přičemž ostatní vzorky generovaly slabé produkty o velikosti kolem 700 bp (obr. 1b). Zjevná absence alely divokého typu u některých selat naznačuje, že ke knockinu mohlo dojít na obou alelách. Alternativně mohla být alela divokého typu upravena tak, že sekvence primer a byla odstraněna, což vedlo k neamplifikaci alely divokého typu. K editaci alely divokého typu skutečně došlo, protože velikost amplifikovaných fragmentů se u některých selat lišila od předpokládaných 705 bp (obr. 1b). Abychom to potvrdili, naklonovali jsme a sekvenovali všechny amplifikované fragmenty. Jak ukazuje obr. 1c, všechny byly upraveny, i když u některých došlo jen k několika změnám párů bází (proto se jevily jako 705 bp). Mezi těmito editovanými alelami jsou zajímavé ty, které byly nalezeny u selat č. 10 a 12. Ta v #10 byla výsledkem nahrazení úseku 29 bp (od ATG směrem k 3′ konci) prasečí sekvence 36 bp (6 bp 5′ od ATG a 26 bp za ním) dárcovské sekvence. Není jasné, jak k tomu došlo. V č. 12 jsou dvě různé editované alely, což znamená, že celkový počet alel je 3, což ukazuje na mozaicismus u tohoto selátka, což není neobvyklé, protože mozaicismus byl často zjištěn u zvířat vytvořených injekcí Cas9/sgRNA do zygoty6,7,8,9,10.
Pro zjištění, zda došlo k off-targetingu pomocí sgRNA, jsme na základě návrhů z CRISPR design tool (http://tools.genome-engineering.org) vybrali 4 nejlepší potenciální off-target místa a amplifikovali fragmenty obsahující tato místa z genomické DNA ušního hrotu selátka č. 14. Zjistili jsme, zda došlo k off-targetingu. Fragmenty byly podrobeny testu T4EN I4. Jak ukazuje obr. S2, nebyla nalezena žádná editace mimo cíl. Nemohli jsme však vyloučit možnost, že k off-target editaci došlo v jiných lokusech nebo u ostatních 15 transgenních prasat. Nicméně i kdyby došlo k off-target editaci, editované lokusy pravděpodobně nebudou pro náš účel produkce rHSA problematické, pokud nebudou narušovat welfare těchto transgenních prasat.
Po prokázání úspěšného knockinu lidského ALB jsme se snažili zjistit, zda lze v krevní plazmě těchto knockinovaných selat detekovat lidský albumin. Jak ukazuje obr. 2a, všechna selata obsahovala v krevní plazmě lidský albumin detekovatelný pomocí protilátek specifických proti lidskému albuminu, i když v různém množství, což je pravděpodobně důsledkem nejméně dvou faktorů, a to zda jsou obě alely knockin a rozsahu mozaiky (zejména v játrech). Hladina v č. 7 je velmi nízká, viditelná až po dlouhé expozici blotu, a to i přes zjevnou absenci prasečí alely Alb divokého typu (obr. 1a). Celkově jsou hladiny mnohem nižší než v dospělých lidských sérech. Je známo, že koncentrace krevního albuminu u prasat se s věkem zvyšuje a ve věku 6 měsíců dosahuje podobné úrovně jako u dospělých lidí11.
Analýza lidského ALB v krvi.
(a) Western blot detekce lidského albuminu v krvi zakladatelských selat. Na SDS-PAGE bylo separováno a analyzováno 0,5 μl plazmy od každého zakladatele. Jako pozitivní kontrola byla použita lidská krevní plazma (0,5 μl po 30násobném zředění). C, plazma z divokého typu prasete. (b) Ilustrace tryptických peptidů (zeleně) detekovaných pomocí hmotnostní spec. analýzy. (c) Semi-kvantifikace dvou tryptických peptidů z lidského a prasečího albuminu pomocí měření ploch píků jednotlivých peptidů. Červeně jsou vyznačeny aminokyselinové zbytky, které jsou specifické pro prase.
Abychom potvrdili, že rHSA detekovaný v plazmě našich knockinovaných selat pomocí protilátek je skutečně lidský albumin, podrobili jsme dva vzorky plazmy (selata č. 2 a 6) hmotnostně spektrální analýze. #Prasátko č. 2 je zjevně homozygotní pro knockinovou alelu a prasátko č. 6 obsahuje jednu knockinovou a jednu mutantní alelu (frameshift) (obr. 1). 0,5 μl plazmy bylo separováno na SDS-PAGE a proteiny kolem 70 KD byly v gelu natráveny trypsinem. Tryptické peptidy byly eluovány z gelu, vysušeny a znovu rozpuštěny pro separaci kapalinovou chromatografií a hmotnostní spec. analýzu. U selátka č. 2 jsme mohli detekovat 14 jedinečných lidských tryptických peptidů ALB a 15 u selátka č. 6 (obr. 2b). M/Z spektra pro lidský peptid FKDLGEENFK a prasečí peptid FKDLGEQYFK (oba ze selátka č. 2) jsou uvedena na obr. S3. Pro kvantifikaci byly vybrány dva peptidy na základě měření ploch píků. Ve shodě s výsledky western blotu byly tyto dva peptidy mnohem hojnější (~5krát) u č. 2 než u č. 6 (obr. 2c). Tyto výsledky ukazují, že rHSA detekovaný protilátkami je autentický lidský albumin.
Genotypizace DNA izolované z ušních hrotů ukazuje, že jak #2, tak #6 neobsahují žádnou alelu divokého typu prasete Alb, buď není přítomna, nebo je editována (obr. 1b,c). V obou vzorcích jsme však stále mohli detekovat tryptické peptidy z prasečího albuminu, ale v mnohem menším množství (obr. 2c). Zajímavé je, že abundance prasečích peptidů byla mezi oběma vzorky přibližně stejná, přestože abundance lidských peptidů se značně lišila. Tyto výsledky naznačují, že obě selata obsahují podobný počet hepatocytů divokého typu (nebo heterozygotů), které jsou zodpovědné za prasečí ALB zjištěný v krvi těchto dvou selat. Takové buňky obsahující alelu divokého typu však nemusí existovat nebo existují v extrémně nízkém procentu v ušních špičkách, takže alelu divokého typu nelze amplifikovat pomocí PCR. Dále Southernova analýza s vnitřní sondou (3′ polovina CDS lidského ALB) ukázala přítomnost dodatečné inzerce donorové sekvence u selat č. 1, 4 a 5 (obr. S4). Všechny tyto komplikace nebudou pro účely produkce rekombinantního lidského albuminu problémem, protože knockinovou alelu lze přečistit zpětným křížením.
Abychom zjistili, zda se knockinová alela může přenést do další generace, zkřížili jsme č. 2 (samec, homozygot) s č. 5 (samice, heterozygot), když reprodukčně dospěli. Z křížení se narodilo 6 mláďat. Čtyři z nich (#1, 3, 4 a 6) jsou homozygotní pro alelu knockin (AlbH/H, H označuje člověka) a dvě (#2 a 5) heterozygotní (AlbP/H, P označuje prase) (obr. 3a). #Jedinci č. 5 a 6 zemřeli na průjem asi 2 týdny po narození. U zbývajících selat jsme ve 4. týdnu věku analyzovali expresi lidského albuminu v krvi. Jak ukazuje obr. 3b, všechna mají v krvi lidský albumin. Zajímavé je, že hladina lidského albuminu u heterozygotního zvířete (č. 2) byla mnohem nižší než u homozygotů. Nevíme, zda je to důsledek individuální variability, nebo je alela knockin nějakým způsobem potlačena alelou divokého typu.
Přenos alely knockin po dědičné linii.
(a) PCR genotypizace potomků F1. Použité primery byly stejné jako na obr. 1. (b) Detekce lidského albuminu v krvi F1 selat metodou Western blot. Na SDS-PAGE bylo separováno a analyzováno 0,5 μl plazmy od každého selátka. C, plazma z divokého typu prasete. M, marker molekulové hmotnosti.
Uvádíme zde úspěšnou generaci prasat nesoucích lidskou ALB cDNA zaklepanou do prasečího lokusu Alb. To je o krok dále než jednoduchá editace genů v zygotách prasat, o které nedávno informovali Hai et al.12 a my13. Velká domestikovaná zvířata byla sledována jako bioreaktory pro biomedicínské proteinové produkty14,15,16,17,18,19,20. Obvykle byly kódující sekvence těchto proteinů vloženy náhodně spolu s nezbytnými řídicími prvky transkripce do genomu jako transgeny, což je spojeno s mnoha komplikacemi včetně krátkodobého charakteru exprese transgenů. Náš důkaz, že homologní rekombinace může v zygotách prasat probíhat velmi efektivně, otevírá dveře pro vývoj stále lepších bioreaktorů i kmenů hospodářských zvířat s více a více žádoucími vlastnostmi.