E-cadherine bindt zich aan desmogleïne om de desmosome assemblage te vergemakkelijken
1) Dit artikel behandelt het mechanisme van cadherine-gemedieerde regulatie van desmosome assemblage. Hoewel de reviewers het ermee eens zijn dat het werk potentieel opwindend is, stelden zij verschillende belangrijke kwesties aan de orde. Ten eerste zijn ze het er allemaal over eens dat het model getest moet worden door co-lokalisatie te onderzoeken in cellen die de cadherine mutant uitdrukken.
We danken de recensenten voor het voorstellen van deze belangrijke experimenten. Zoals beschreven in ons gedetailleerde antwoord aan de reviewers, hebben we nu de rol van de verschillende Ecad mutaties getest in het verhinderen van rekrutering van Dsg2 in keratinocyten. We brachten full-length Ecad WT tot expressie, en Ecad mutanten (L175D, K14E, en W2A-K14E) in Ecad-knockout, Pcad-knockdown muiskeratinocyten (EKO/PKD) en analyseerden Dsg2 rekrutering op plaatsen van intercellulaire contacten. Deze resultaten bevestigen dat aminozuur L175 op Ecad, Dsg2 interacties medieert en vroege desmosoom complex vorming in cellen vergemakkelijkt. Onze experimenten tonen ook aan dat desmosoom assemblage wordt geïnitieerd op plaatsen van Ecad trans homodimerization.
2) Er zijn ook zorgen over de betrouwbaarheid van de co-lokalisatie gegevens in figuur 5; een meer rigoureuze analyse is nodig om aan te tonen dat de co-lokalisatie van E-cadherine en desmoplakin komt veel meer dan zou worden verwacht door toeval.
In het veld, worden desmosomen geïdentificeerd door de grootte en spoorbaan verschijning van DP kleuring in SIM-beelden. Zoals uiteengezet in ons antwoord aan de recensenten, hebben wij deze gevestigde aanpak gebruikt om desmosomen te lokaliseren. Bovendien benadrukken we nu dat we geen colokalisatie meten, maar eerder de rekrutering van verschillende cadherines (Ecad en Dsg) naar regio’s van het membraan die dit patroon vertonen.
3) Ten tweede gaat de modellering ervan uit dat L175 deel uitmaakt van de interface, maar zonder beoordeling van de stoichiometrie kan niet worden uitgesloten dat het verlies van binding een indirect effect is van het verlies van cis-dimerisatie. De modellering wordt ook als zwak beschouwd omdat geen complementaire interfaces op Dsg2 werden getest. Zonder dergelijke gegevens moet de moleculaire modellering als zeer speculatief worden beschouwd.
Zoals beschreven in ons uitvoerige antwoord aan de reviewers, tonen eerdere computationele simulaties en biofysische experimenten aan dat de cis-dimeervorming van Ecad voorafgaande trans-dimeervorming vereist. Bijgevolg kunnen Ecads zich niet aan het oppervlak binden als op zichzelf staande, voorgevormde, cis-dimeren. Dit maakt het uiterst onwaarschijnlijk dat de gemeten bindingsinteracties plaatsvinden tussen cis-dimeren van Ecad en Dsg2. Niettemin zijn wij het met de recensenten eens dat de resultaten van de moleculaire docking vrij zwak zijn. We hebben daarom deze modelleringsresultaten uit het manuscript verwijderd.
4) Tenslotte, zoals opgemerkt door reviewer 3, zelfs indien ondersteund door deze toevoegingen, verklaren het model en de Discussie sectie niet echt hoe E-cadherine desmosomen reguleert.
Gebaseerd op onze nieuwe cellulaire structuur-functie gegevens, stellen we nu een model voor waarbij desmosoom-assemblage wordt vergemakkelijkt door zowel de directe cis interacties van Ecad en Dsg2 als de trans binding van tegengestelde Ecad. In ons model dient de trans-homodimerisatie van Ecad van tegenover elkaar liggende cellen als een ruimtelijke aanwijzing om de desmosoomvorming te coördineren. Ecad vormt vervolgens cis-dimeer complexen met Dsg2 om de desmosome assemblage te initiëren. Het model wordt gepresenteerd en besproken in het nieuwe manuscript.
Reviewer #1:
1) De single-molecule AFM experimenten zijn het meest solide deel van het artikel. In mijn lezing sluiten de auteurs echter niet uit dat de bindingsgebeurtenissen die zij waarnemen te wijten kunnen zijn aan interacties tussen voorgevormde E-cadherine cis-dimeren. De stoichiometrie van de interactie is belangrijk om vast te stellen, want als voor binding aan Dsg2 een cis-dimeer van E-cadherine nodig is, zou dat de interpretatie van het resultaat dat de L175D mutatie de interactie tussen Dsg2 en E-cad blokkeert, veranderen. Een dergelijk scenario zou ook de geldigheid van de docking simulaties in twijfel trekken. In mijn lezing is de lage waarschijnlijkheid van binding per contact van de AFM-tip met het oppervlak een zwak bewijs dat binding noodzakelijkerwijs de interactie van twee monomeren weerspiegelt, evenmin als de lage gemiddelde dichtheid van cadherinemoleculen op het oppervlak. Verder zijn de cadherines geïmmobiliseerd met streptavidine, dat meerdere biotinebindingsplaatsen heeft.
Om deze redenen denk ik dat het belangrijk is te bewijzen dat heterodimerisatie tussen monomeren optreedt. Om dit te doen, zou ik aanraden systematisch meten van de interactie waarschijnlijkheid van de tip met het oppervlak als functie van de areale oppervlaktedichtheid van E-cadherine op het dekglaasje oppervlak. Als voor de interactie inderdaad monomere E-cadherine nodig is, zou deze meting lineair moeten schalen met toegevoegde E-cadherine, althans bij lage dichtheden. Deze specifieke meting is echter niet vereist-elke meting die de stoichiometrie vaststelt zal doen.
Vorige computersimulaties (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) hebben aangetoond dat Ecad cis-homodimerisatie voorafgaande Ecad trans-dimeervorming vereist. Evenzo hebben eerdere single molecule FRET metingen aangetoond dat het niet mogelijk is om stand-alone Ecad cis-dimeren te vormen, zelfs wanneer Ecad monomeren dicht bij elkaar in een cis-oriëntatie worden geplaatst (Zhang et al., 2009). Tezamen suggereren deze resultaten dat in onze experimenten, Ecads niet kan worden geïmmobiliseerd op de AFM tip of substraat als pre-gevormde cis-dimeren. Bijgevolg is het falen van de Ecad-L175D mutant om te interageren met Dsg2 niet te wijten aan de afwezigheid van Ecad cis dimerisatie. We bespreken dit nu in de subsectie “Leu 175 medieert Ecad en Dsg2 interacties” van het manuscript.
Gelukkig genoeg laten technische beperkingen het eiwit stoichiometrie experiment dat de recensent suggereert niet toe. In onze experimenten gebruiken we eiwit oppervlaktedichtheden die ons in staat stellen om ondubbelzinnig enkele binding gebeurtenissen te identificeren uit de overeenkomstige uitrekken van PEG tethers. Als de dichtheid van het cadherine-oppervlak wordt verhoogd, zoals de recensent voorstelt, neemt de waarschijnlijkheid van gelijktijdige meervoudige Ecad-bindingsgebeurtenissen toe, waardoor een kwantitatieve analyse van de waarschijnlijkheid van eiwitbinding onbetrouwbaar wordt. Om deze reden (samen met de intrinsieke zwakte van onze docking analyse), hebben we de eiwit docking simulaties uitgesloten van het manuscript.
Ten slotte, in het herziene manuscript, gebruiken we nu clusteranalyse om de single molecule unbinding events te groeperen voor Dynamic Force Spectroscopy (DFS). We hebben onlangs aangetoond dat het K-means clusteringalgoritme dat we gebruikten, de schatting van kinetische parameters in DFS sterk verbetert (Yen en Sivasankar, 2018). Bijgevolg zijn de levensduren die we nu rapporteren voor Ecad/Dsg2-, Dsc2/Dsg2- en Dsc2/Dsc2-interacties betrouwbaarder.
2) De docking-simulaties zijn interessant, maar bieden naar mijn mening zwak bewijs voor de specifieke bindingsgeometrie die de auteurs voorstellen. Ik zou de auteurs sterk willen aanraden voorzichtiger te zijn bij de interpretatie en presentatie van deze resultaten, of als alternatief aanvullende gegevens te presenteren, bijvoorbeeld EM-beelden, die het computationele resultaat ondersteunen of weerleggen.
We zijn het met de recensent eens dat de docking-gegevens over eiwitten zwak zijn. Daarom hebben we deze resultaten uit het manuscript verwijderd.
3) Helaas zijn de SIM-beelden niet overtuigend zoals ze nu worden gepresenteerd. In het bijzonder is het niet duidelijk wat telt als een “desmosoom” in de analyse van de auteurs (figuur 5B). Een meer verfijnde behandeling van colokalisatie zou nodig zijn om het punt vast te stellen dat E-cadherine en desmoplakine colokaliseren, en dat deze colokalisatie afneemt naarmate de knooppunten rijpen.
In eerdere studies (Stahley et al., 2016a, 2016b) hebben we gebruik gemaakt van de “spoorbaan” verschijning van DP zoals geopenbaard door superresolutie beeldvorming om desmosomen te definiëren door immunofluorescentie (zoals afgebeeld in figuur 3A). Anderen in het veld hebben ook gebruikt “spoor” track morfologie om desmosomes identificeren in SIM beelden (zie bijvoorbeeld: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). De grootte en organisatie van deze structuren, zoals onthuld door SIM, is volledig in overeenstemming met de klassieke EM-definities van desmosomen. We hebben de pixelintensiteit gemeten voor de twee cadherines (Ecad of Dsg2) binnen deze structuren met behulp van standaard beeldanalyse. Belangrijk is dat we niet proberen co-lokalisatie te claimen. Wij meten veeleer de rekrutering van cadherine op membraandomeinen die DP-spoorwegverkleuringspatronen vertonen. Wij beseffen dat het soms moeilijk is om spoorrails te onderscheiden op vroege tijdstippen. Daarom dachten wij dat wij pas na 1 uur een bonafide spoorbaanverkleuring konden vaststellen. Voorts verrichten wij alleen metingen op plaatsen waar wij patronen van spoorrails kunnen waarnemen, en niet DP-puncta. Tenslotte is onze bevinding dat Ecad aanwezig is in ontluikende desmosomen consistent met klassieke immuno-EM experimenten die aantonen dat Ecad zich aan desmosomen kan lokaliseren (Jones, 1988). Daarom hebben wij vertrouwen in ons vermogen om desmosomen te identificeren en relatieve niveaus van de twee cadherines op verschillende tijdstippen te meten.
4) Ik laat dit laatste punt over aan het oordeel van de redacteur. Ik ben van mening dat de colokalisatiegegevens, zelfs als ze voor waar worden aangenomen, geen functionele relevantie aantonen. Het zou erg leuk zijn om een knockdown/reconstitutie experiment te zien met L175D E-cadherine. De voorspelling is dat deze molecule nooit colokaliseert met desmoplakine, ongeacht de leeftijd van de junctie. Schending van deze voorspelling zou twijfel doen rijzen over het door de auteurs bepleite model.
Gebaseerd op de suggestie van de recensent, hebben we nu experimenten uitgevoerd om de rol van de verschillende Ecad extracellulaire domein mutaties in het belemmeren van rekrutering van DP en Dsg2 in keratinocyten direct te testen. Deze gegevens worden beschreven in de subsectie “Ecad L175 is essentieel voor efficiënte intercellulaire Dsg2 rekrutering en desmosome assemblage”. De bijbehorende beelden worden getoond in figuur 5 en in figuur 5-figuur supplement 1. De gebruikte methoden worden beschreven in de subsectie “Isolatie, cultuur, transfectie en confocale beeldvorming van primaire keratinocyten”. Voor deze experimenten gebruikten we EKO / PKD muis keratinocyten, die vrijwel geen klassieke cadherines uitdrukken. We hebben eerder aangetoond dat deze EKO/PKD keratinocyten niet in staat zijn om AJ’s en desmosomen te assembleren als gevolg van het verlies van alle klassieke cadherines (Michels et al., 2009). Met deze cellen kunnen we dus direct het vermogen van de Ecad mutanten beoordelen om i) AJ-vorming te initiëren en ii) hun vermogen te beoordelen om desmosomale componenten te rekruteren op plaatsen van initiële cel-cel contactvorming.
Omdat we geïnteresseerd waren in de beoordeling van het vermogen van Ecad mutanten om desmosomale eiwitten vroeg tijdens de junctievorming te rekruteren, brachten we ofwel full-length Ecad WT of mutanten tot expressie in EKO/PKD keratinocyten en analyseerden we DP en Dsg2 rekrutering op plaatsen van intercellulaire contacten met behulp van confocale microscopie. Om de rekrutering in verschillende stadia van junctievorming en -rijping te onderzoeken, werden keratinocyten gefixeerd en geïmmunostaineerd voor DP, Dsg en Ecad op drie tijdstippen na de Ca2+ schakelaar (3 uur, 6 uur en 18 uur).
Onze gegevens toonden aan dat 3 uur na de Ca2+ schakelaar, 93% van WT-Ecad verrijkt was in rits-achtige vroege AJ’s op plaatsen van intercellulaire contacten. Daarentegen vormde slechts 48% van de L175D-Ecad getransfecteerde keratinocyten AJ ritsen, waarschijnlijk als gevolg van verminderde Ecad cis-dimeervorming (figuur 5 A, B). Op deze vroege tijdstippen na de Ca 2 + schakelaar, 66% en 91% van de WT-Ecad rits contacten waren positief voor Dsg2 en DP respectievelijk (figuur 5 A, C, D, E). Wanneer de cellen werden toegestaan om zich in Ca 2 +-afhankelijke intercellulaire adhesie voor 18 uur, de junctionele lokalisaties van Ecad-Dsg2 en Ecad-DP steeg tot 97% en 100% respectievelijk (figuur 5 A, C, D, E). In tegenstelling, slechts 39% van L175-geïnduceerde rits contacten toonde Dsg2 rekrutering 3 uur na overschakeling op hoge Ca 2 + die steeg tot 65% op 18 uur (figuur 5 A, C), bevestigt dat een directe interactie tussen Ecad en Dsg2 is vereist voor een efficiënte rekrutering van Dsg2 aan vroege intercellulaire contacten. Evenzo, na 3 uur, slechts 28% van L175D-Ecad mutant gevestigde intercellulaire contacten waren positief voor DP, die werd verhoogd tot 72% na 18 uur, wat wijst op een compenserend mechanisme in latere stadia (figuur 5 D, E).
Om te bevestigen dat het waargenomen effect van de L175D-mutatie niet te wijten was aan belemmerde AJ-vorming, transfecteerden we de EKO/PKD keratinocyten met de full-length Ecad-K14E mutant die X-dimeervorming opheft en Ecad vastzet in een strand-swap dimeerconformatie. Onze gegevens toonden aan dat slechts 4% van de getransfecteerde contactcellen gevormd ritsen op vroege (3 uur) tijdstippen na overschakeling op hoge Ca 2 + met slechts 24% van de getransfecteerde contactcellen tonen ritsen op late (18 uur) tijdstippen (Figuur 5 A, B, Figuur 5-figure supplement 1), bevestigt dat K14 is essentieel voor effectieve AJ vorming, en dus intercellulaire contact vestiging. Echter, de weinige K14E AJs die werden gevormd, gerekruteerd Dsg2, en vooral DP, efficiënter dan L175D (figuur 5 A, C, E, figuur 5-figuursupplement 1). Dit resultaat bevestigde dat de vertraagde rekrutering van Dsg2 aan intercellulaire contacten niet het gevolg was van het onvermogen van Ecad L175D om efficiënt AJs te vormen, maar eerder te wijten was aan de afwezigheid van een directe interactie tussen Ecad en Dsg2. Aangezien er nooit co-lokalisatie van DP en Ecad was bij afwezigheid van ritsen (figuur 5-figuursupplement 1), suggereren de gegevens ook dat Ecad trans-interacties voorafgaan aan Ecad/Dsg2-interacties. Deze conclusie wordt nog versterkt door onze bevinding dat geen DP-recruitment werd waargenomen bij het opheffen van Ecad trans adhesie, en dus ritsen, door het transfecteren van de full-length Ecad-DM (W2A-K14E dubbele mutant, figuur 5-figuursupplement 1) in EKO/PKD keratinocyten. Alles bij elkaar bevestigen deze resultaten dat aminozuur L175 Dsg2 interacties medieert en vroege desmosoom complexvorming in cellen vergemakkelijkt.
Reviewer #2:
1) De bevinding dat E-cadherine residu L175 kritisch is voor interactie met Dsg2 is intrigerend. Er zijn echter geen interagerende partnerresiduen geïdentificeerd. In deze omstandigheid lijkt het voorspellen van een conformatie voor de interactie tussen E-cadherine en Dsg2 door docking precair; het lijkt onzeker of de voorspelde conformatie overeenkomt met de werkelijke gebonden conformatie.
We zijn het met de recensent eens dat de docking-gegevens voor eiwitten speculatief zijn en hebben deze resultaten daarom uit het manuscript verwijderd.
2) Er is slechts een vaag verband tussen de voorgestelde Dsg2/E-cadherine interactie en de biologie van desmosoom-assemblage. Toch lijken de auteurs een duidelijke weg voorwaarts te hebben. Zij stellen dat de aanwezigheid van E-cadherine in nascent desmosomes (experimenteel beoordeeld door co-kleuring voor desmoplakin in figuur 5) is het bewijs voor de rol van de Dsg2 / E-cadherine associatie die zij hebben geïdentificeerd. Nu ze een mutant die die associatie voorkomt geïdentificeerd, moeten de experimenten van figuur 5 uitgevoerd met de mutant leiden tot andere resultaten. Dit experiment zou aanzienlijk bijdragen aan de nauwkeurigheid van dit artikel.
Zoals beschreven in antwoord 4 op reviewer 1, brachten we full-length Ecad WT, en Ecad mutanten tot expressie in EKO/PKD keratinocyten en analyseerden we Dsg2 en DP rekrutering op plaatsen van intercellulaire contacten. Deze resultaten bevestigen dat aminozuur L175 Dsg2 interacties medieert en vroege vorming van het desmosoomcomplex in de cellen vergemakkelijkt. Deze gegevens worden beschreven in subsectie “Ecad L175 is essentieel voor efficiënte intercellulaire Dsg2 rekrutering en desmosome assemblage” van het manuscript. De bijbehorende beelden worden getoond in figuur 5 en in figuur 5-figuur supplement 1. De gebruikte methoden worden beschreven in de subsectie “Isolatie, kweek, transfectie en confocale beeldvorming van primaire keratinocyten”.
Reviewer #3:
1) Dit manuscript identificeert en karakteriseert een moleculaire interactie tussen E-cadherine en Desmoglein 2 met behulp van geïsoleerde eiwitten en toont verhoogde colokalisatie tussen deze twee moleculen in keratinocyten vroeg tijdens desmosome assemblage. Dit zijn potentieel zeer interessante waarnemingen die kunnen verklaren hoe klassieke cadherines de assemblage van desmosomen controleren. Hoewel dit door verschillende groepen in de literatuur goed is gedocumenteerd, zijn de onderliggende mechanismen nog grotendeels onbekend. Hun conclusie “Our integrated single molecule experiments, protein-protein docking predictions and cell based super resolution imaging show that Ecad/Dsg2 interactions play an important role in early desmosome assembly” vermeld aan het begin van de Discussie sectie is echter een nogal sterke overdrijving gezien het feit dat de interactie gebaseerd is op karakterisering op geïsoleerde extracellulaire domeinen en statische, zij het hoge resolutie microscopie. Er wordt niet geëxperimenteerd om aan te tonen dat wanneer men deze interactie verstoort de desmosome assemblage inderdaad wordt verstoord, wat naar mijn mening het minimum zou zijn om deze reeks gegevens echt interessant en relevant te maken voor een breed publiek.
Zoals beschreven in antwoord 4 op reviewer 1, hebben we nu full-length Ecad WT, en Ecad mutanten tot expressie gebracht in EKO/PKD keratinocyten en aangetoond dat aminozuur L175 Dsg2 interacties bemiddelt en vroege desmosoomvorming in cellen vergemakkelijkt, zoals beoordeeld door DP rekrutering. Deze gegevens worden beschreven in subsectie “Ecad L175 is essentieel voor efficiënte intercellulaire Dsg2 rekrutering en desmosome assemblage” van het manuscript. De bijbehorende beelden worden getoond in figuur 5 en in figuur 5-figuur supplement 1. De gebruikte methoden worden beschreven in subsectie “Isolatie, cultuur, transfectie en confocale beeldvorming van primaire keratinocyten”.
2) Ook in het licht van het feit dat de interactie calciumonafhankelijk is, terwijl de klassieke cadherine-afhankelijke vroege desmosome assemblage wel de aanwezigheid van calcium vereist (die helemaal niet wordt besproken).
Wij danken de recensent voor deze inzichtelijke opmerking. Zoals beschreven in de subsectie “Ecad L175 is essentieel voor efficiënte intercellulaire Dsg2 rekrutering en desmosoom assemblage”, toont confocale beeldvorming van mutant Ecad uitgedrukt in muis keratinocyten nu aan dat desmosoom assemblage wordt geïnitieerd op plaatsen van Ca2+ afhankelijke Ecad trans homodimerisatie. Op basis van onze gegevens stellen wij een model voor waarbij de desmosoom-assemblage wordt vergemakkelijkt door zowel de directe cis interacties van Ecad en Dsg2 als de trans binding van tegengestelde Ecad. In ons model dient de trans homodimerisatie van Ecad van tegenover elkaar liggende cellen als een ruimtelijke aanwijzing om de desmosoomvorming te coördineren. Ecad vormt vervolgens cis dimeer complexen met Dsg2. Eenmaal gelokaliseerd binnen het natieve desmosoom, dissocieert Dsg2 van Ecad en bindt aan Dsc2 om rijpe desmosomen te vormen. Aangezien het Dsc2/Dsg2 complex een langere levensduur heeft dan zowel het Ecad/Dsg2 complex als het Dsc2/Dsc2 complex, maakt dit waarschijnlijk een robuuste cel-cel adhesie mogelijk en stelt het het rijpe desmosoom in staat om mechanische kracht te weerstaan. Dit model wordt beschreven in figuur 6, en in de Discussion section.
3) Aangezien dit een volledig nieuwe interactie van lage affiniteit, is het waarschijnlijk moeilijk om elke interactie assays doen in de context van cellen waarin een cel uitdrukt E-cadherine en de andere Dsg2 om te onderzoeken of er enige interactie. Aangezien hun gegevens echter gedeeltelijk gebaseerd zijn op modellering, zouden de auteurs ook een mutant moeten genereren waarin A125 en A124 gemuteerd zijn om veel beter bewijs te leveren voor het bestaan van de voorgestelde y-dimeren.
Omdat de eiwit-docking resultaten niet robuust zijn, hebben we deze gegevens nu uit het manuscript geschrapt. Onze experimenten met EKO/PKD keratinocyten, waaruit blijkt dat mutatie van aminozuur L175 op Ecad de rekrutering van Dgs2 en vooral DP naar plaatsen van vroege contactvorming belemmert, toont echter aan dat Ecad-L175 de desmosoomvorming in cellen vergemakkelijkt, en bevestigt onze biofysische resultaten.
Samenvatting:
De reviewers zijn van mening dat, hoewel de biofysische gegevens overtuigend zijn, een meer rigoureuze kwantitatieve analyse nodig is om de conclusies uit de gegevens in Figuren 3 en 5 te ondersteunen. In principe kunnen deze zorgen worden aangepakt met aanvullende data-analyse in plaats van experimenten, en in dit geval zouden we een herzien manuscript te overwegen.
Wij danken de redacteur voor deze bemoedigende review. Zoals hieronder beschreven, onze herziene manuscript adres alle gemarkeerde kwesties.
1) De conclusie dat E-cadherine-Dsg interactie nodig is voor de initiële desmosome vorming is gebaseerd op colokalisatie van Dsg en E-cadherine afneemt als de kruising rijpt. In figuur 3 is het echter niet duidelijk of de waargenomen colokalisatie met DP is significant verder dan die verwacht door het toeval of is het gevolg van tijdsafhankelijke veranderingen in E-cadherine sub cellulaire lokalisatie niet gerelateerd aan kruising rijping. In figuur 3C, controle-experimenten getoond in het rechter paneel markeren co-lokalisatie van Dsg2 en DP – bekende Desmosome componenten – en tonen een nauwe overeenkomst in fluorescentie signalen op alle drie tijdstippen. In tegenstelling, terwijl de expressie van E-cadherine en DP in de linker panelen lijkt te overlappen tot op zekere hoogte, ze vertonen niet de overeenstemming in signalen waargenomen voor de controle-experimenten. Het antwoord op de oorspronkelijke review punten over dit onderwerp (bijv. reviewer 1, punt 3) richt zich op het definiëren van een desmosoom, maar gaat niet in op het bovenstaande punt.
Wij willen graag verduidelijken dat we niet het meten van co-lokalisatie, maar in plaats daarvan de rekrutering van ofwel Ecad of Dsg2 aan regio’s van het membraan dat een DP ‘spoorbaan’ patroon weer te geven. Om dit duidelijker te maken, hebben we nu het herziene manuscript aangepast om te benadrukken dat Ecad ‘verrijkt is in ontluikende desmosomen’ in plaats van ‘uitgesloten is van rijpe desmosomen’.
Om direct tegemoet te komen aan de bezorgdheid van de reviewers over onze meting van de verrijking van Ecad in desmosomen, laten we nu zien dat de relatieve niveaus van Ecad langs de hele celgrens (Ecad:DP verhouding aan celgrenzen) onveranderd blijven in de tijd. Deze gegevens bevestigen dat de Ecad-verrijking binnen DP-sporen op vroege tijdstippen specifiek is voor desmosomale gebieden van het membraan en significant groter is dan verwacht door willekeurig toeval of als gevolg van veranderingen in E-cadherin-lokalisatie die niet gerelateerd zijn aan knooppuntrijping. De gegevens worden getoond in figuur 3-figuursupplement 1 en wordt beschreven in subsectie “Ecad is aanwezig in nascent desmosomes, maar niet in volwassen desmosomes”.
Finitief, omdat de line-scans getoond in figuur 3 waren verwarrend, hebben we de line-scans geëlimineerd uit het herziene manuscript. In plaats daarvan, in figuur 3B, tonen we nu verschillende representatieve beelden van desmosomale regio’s in menselijke keratinocyten gekweekt in hoge Ca2 + media voor 1, 3 of 18 uur. Deze resultaten benadrukken de belangrijkste ’take-away’ boodschap van figuur 3C: Ecad niveaus zijn verrijkt in nascent desmosomen, met relatieve niveaus afneemt als desmosomen mature.
2) Soortgelijke zorgen werden geuit met betrekking tot figuur 5, die wordt verondersteld om aan te tonen dat Ecad L175 is essentieel voor efficiënte intercellulaire Dsg2 rekrutering en desmosome assemblage. De beelden in paneel A tonen inderdaad een dramatisch verschil in Dsg2 en DP lokalisatie ten opzichte van de WT of mutant cadherine. Terwijl Dsg2 en DP co-lokaliseren met WT of K14E Ecad bij knooppunten, blijven ze in afzonderlijke puncta die de L175D Ecad-knoop flankeren en er niet mee co-lokaliseren. Het is echter niet duidelijk wat de auteurs hebben gekwantificeerd om de betekenis van dit fenotype te testen. In B, wat is “% van knooppunten die contacten vormen”? Hoe wordt een contact gedefinieerd? Welke knooppunten meten ze? AJ of desmosomen? In C en E, wat bedoelen ze met % van Dsg2 of DP positieve knooppunten? Hoe werden knooppunten gedefinieerd?
We hebben nu een figuur paneel (Figuur 5-figure supplement 1A) toegevoegd aan de kwantificering criteria en junctionele categorieën die werden gebruikt in onze analyse te illustreren. Dit paneel toont voorbeelden van cellen getransfecteerd met Ecad mutant die niet (linker paneel) of doen (rechter paneel) tonen intercellulaire AJ vorming. Voor Dsg2 of DP rekrutering, hebben we alleen gekwantificeerd die intercellulaire interfaces waarin AJ ritsen werden waargenomen. In de inzetjes van het figuurpaneel tonen we voorbeelden van AJ-positieve contacten die positief zijn voor DP of negatief voor DP.
In subsectie “Ecad L175 is essentieel voor efficiënte intercellulaire Dsg2-recruitment en desmosoom-assemblage” van het manuscript, vermelden we nu dat het vermogen van getransfecteerde keratinocyten om AJ’s te vormen eerst werd beoordeeld aan de hand van de vorming van ‘rits-achtige’ patronen van Ecad bij intercellulaire contacten. We hebben eerder aangetoond dat deze ritsen vroege AJ’s vertegenwoordigen en AJ-markereiwitten zoals vinculin rekruteren (Rübsam et al., 2017). We onderzochten alleen intercellulaire interfaces met AJ ritsen, op hun vermogen om Dsg2 en DP naar deze contacten te rekruteren. Belangrijk is dat we nog nooit een verrijking van desmosomale componenten bij intercellulaire contacten in de afwezigheid van AJ ritsen hebben waargenomen (Michels et al., 2009).
Zoals beschreven in reactie 3a hieronder, bespreken we nu in de sectie Discussie dat hoewel Dsg2 en DP wel enige co-lokalisatie vertonen bij Ecad-positieve ritsen binnen 3 uur, er ook niet-overlappende junctionele kleuring is die suggereert dat AJ’s en desmosomen al beginnen te segregeren in afzonderlijke intercellulaire knooppunten. We hebben niet gekwantificeerd deze co-lokalisatie in ons manuscript, omdat het belangrijkste punt van onze experimenten waren om de relevantie van L175 te tonen voor het rekruteren van Dsg2 aan intercellulaire interfaces en het vergemakkelijken van desmosome vorming (zoals geïllustreerd door DP rekrutering aan intercellulaire contacten). Wij menen dat de vertraging in rekrutering tussen WT, L175 mutant, en de K14 mutant, die gekwantificeerd is in figuur 5, dit punt illustreert.
3) Er zijn ook wijzigingen in de Inleiding en de Discussie sectie nodig om de bovenstaande punten aan te pakken, alsmede de toegankelijkheid van de paper:
a) Gerelateerd aan bovenstaande punten, lijkt het verband tussen in vitro bindingsexperimenten en de voorgestelde biologische rol zwak op basis van lokalisatie studies die overlappende maar niet echt co-lokale kleuring patronen onthullen. De auteurs moeten deze bevinding verklaren; misschien is de co-lokalisatie dynamisch, en/of is slechts een subset van E-cadherine moleculen gebonden aan Dsg2. Dit punt moet op zijn minst besproken worden om de resultaten van de lokalisatie-experimenten te rationaliseren met het voorgestelde model.
Door de voorbijgaande aard van Ecad/Dsg2 interacties, wordt verwacht dat desmosomale eiwitten die gerekruteerd worden op knooppunten zich snel zullen afscheiden van Ecad. Bijgevolg wordt verwacht dat beelden van intercellulaire interfaces zowel overlappende als afzonderlijke Ecad en desmosomale eiwitkleuringpatronen zullen vertonen. In overeenstemming, hoewel Dsg2 en DP vertonen enige co-lokalisatie op Ecad-positieve ritsen (figuur 5), significante niet-overlappende junctional kleuring wordt waargenomen, zelfs binnen de eerste 3 uur. Dit suggereert dat AJs en desmosomen snel segregeren in verschillende intercellulaire knooppunten. Wij verklaren dit nu in de Discussie-sectie.
b) In het begin van de Discussie-sectie beweren de auteurs dat zij: “twee kritieke gebeurtenissen identificeren die efficiënte desmosome assemblage initiëren en bevorderen: (i) stabiele trans homodimerisatie van Ecad, en (ii) de directe heterofiele binding van Ecad en Dsg2 ectodominen. Onze gegevens tonen aan dat desmosoom-assemblage wordt geïnitieerd op plaatsen waar Ecad trans-homodimeriseert. Vervolgens binden Ecad en Dsg2 zich via een geconserveerd Leu 175 op de Ecad cis bindingsinterface en vormen kortlevende heterofiele complexen die lokaliseren op vroege desmosomen en efficiënt desmosomale eiwitten rekruteren op plaatsen van intercellulaire contactvorming. Naarmate desmosomen rijper worden, dissocieert Dsg2 van Ecad en vormt het stabiele bindingen met Dsc2 om een robuuste adhesie te bewerkstelligen. – Deze paragraaf mengt observaties, interpretatie, en hypothetische modellen en is als zodanig misleidend. Ze zouden de samenvatting van de resultaten moeten scheiden van de interpretatie en hun model.
Zoals voorgesteld door de reviewers, hebben we de interpretaties uit de eerste paragraaf van de Discussie-sectie verwijderd en nu alleen de resultaten samengevat.
c) De auteurs schrijven in het Abstract en de Inleiding “Ecad interageert met Dsg2 via een geconserveerde Leu 175 op de Ecad cis-bindingsinterface.” – De auteurs moeten er niet van uitgaan dat lezers bekend zijn met E-cad homofiele interacties en moeten dit expliciet uitleggen.
In het Abstract staat nu: “Eerdere studies tonen aan dat E-cadherine (Ecad), een adhesief eiwit dat zowel in trans- als in cisconformatie interacteert, desmosoom-assemblage vergemakkelijkt via een onbekend mechanisme”.
Daarnaast staat nu in de Inleiding: ‘Aangezien Ecad lateraal interageert om cis-dimeren te vormen op hetzelfde celoppervlak (Harrison et al., 2011) terwijl Ecad-moleculen van tegenover elkaar liggende cellen interageren in een trans strand-swap dimeerconformatie (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2007; Vendome et al., 2011) en een trans X-dimer conformatie (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), gebruikten we mutanten die specifiek ofwel de trans- ofwel de cis-interacties van Ecad opheffen en testten hun binding aan ofwel Dsg2 ofwel Dsc2’. Tenslotte staat er nu in de inleiding: “Eerdere structurele studies hebben aangetoond dat L175 homofiele Ecad cis dimerisatie medieert (Harrison et al., 2011)”.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013