Cloroformo deuterado
13.4.4 Evaluación y mantenimiento del rendimiento de los instrumentos
La incorporación de los instrumentos de laboratorio a los sistemas de gestión de la calidad utilizados para las certificaciones de los laboratorios (es decir, la norma ISO17025 para los laboratorios analíticos) requiere la evaluación y el mantenimiento del rendimiento de los instrumentos a intervalos regulares. Estas certificaciones permiten al científico analítico del laboratorio crear pruebas de cualificación del funcionamiento (OQ) y de cualificación del rendimiento (PQ) en torno al uso previsto del instrumento. Así, en el caso de la RMN, las pruebas OQ/PQ pueden variar en función de las pruebas analíticas habituales que se vayan a realizar en el instrumento. Los instrumentos modernos cuentan con procedimientos automáticos que requieren que el usuario introduzca la muestra adecuada y, a continuación, se realiza una serie de pruebas de forma automatizada. Al final de estas pruebas, se emite un informe que permite al usuario evaluar el rendimiento general del espectrómetro.
Para las pruebas de proteínas terapéuticas en soluciones acuosas, estas pruebas OQ deben incluir: calibración de la temperatura, forma de las líneas en la señal de acetona en cloroformo deuterado, sensibilidad en las señales de etilbenceno en cloroformo deuterado y/o supresión de agua con evaluación de la sensibilidad en los protones anoméricos de una solución de sacarosa 2 mM. La calibración de la temperatura es importante porque la dinámica de una proteína se ve afectada por las condiciones ambientales de la solución, que pueden tener grandes efectos en los anchos de línea y las frecuencias de las señales observadas. La regulación de la temperatura de la muestra en los espectrómetros de RMN se basa en un control cuidadoso de la temperatura del aire de la sonda y del caudal. El impacto del aire de la sonda en la temperatura de la muestra puede medirse mediante la medición de los desplazamientos químicos de una solución 100% de metanol o 100% de etilenglicol. Estos desplazamientos se han medido cuidadosamente para poder evaluar la temperatura real de la muestra con un ajuste determinado de la temperatura del aire de la sonda y del caudal.
No se puede exagerar el impacto de tener un buen calce de la muestra (es decir, un campo magnético uniforme a través de la parte observada de una muestra) en la calidad espectral: cuanto más estrechos sean los picos, mejor será la resolución y la sensibilidad de las señales que se medirán. En concreto, si se utilizan técnicas de supresión de señales, cuanto más estrecha sea la base del pico a suprimir, mejor funcionarán las técnicas de presaturación o de supresión selectiva de señales de banda estrecha. Afortunadamente, la llegada de las técnicas de mapeo de campo y las calzas de gradiente han simplificado esta tarea, que a menudo lleva mucho tiempo, de ajustar la configuración de las calzas para cada muestra. Sin embargo, habrá muestras para las que los mapas de calzas no funcionen bien y habrá que dedicar tiempo al ajuste de las calzas para obtener una respuesta óptima del instrumento.
La evaluación de la sensibilidad del espectrómetro con muestras estándar es una forma ideal de controlar el rendimiento del sistema y los valores obtenidos de las pruebas estándar deben cumplir o superar las especificaciones del espectrómetro establecidas por el fabricante. Hay que tener en cuenta que las especificaciones del espectrómetro suelen ser fijadas de forma conservadora por el fabricante para asegurarse de que su instrumento supera estas pruebas en el momento de la instalación. Sin embargo, la realización de las pruebas OQ/PQ a intervalos regulares permite al propietario del espectrómetro familiarizarse con las capacidades de su instrumento en particular. Las desviaciones del conjunto de valores establecidos por las pruebas de rutina deben examinarse cuidadosamente, ya que podrían ser una indicación de mal funcionamiento del instrumento.
En el caso del análisis de moléculas pequeñas en disolventes orgánicos, el uso de la señal de acetona en cloroformo deuterado para lograr no sólo una forma de línea lorentziana y un FWHH estrecho, sino una base estrecha (por ejemplo, <20 Hz en el 20% de la señal de 13C-satélite) suele conducir a la mejor sensibilidad en las señales de etilbenceno en cloroformo deuterado. En el caso de los espectrómetros utilizados para la obtención de espectros en soluciones acuosas, es más importante una segunda medida de la sensibilidad: la capacidad del espectrómetro para obtener una buena sensibilidad y resolución de las señales cercanas al pico de agua. Así, la medición de la sensibilidad con las señales de protones anoméricos de un estándar compuesto por 2 mM de sacarosa en una solución de 95% de H2O/5% de D2O con supresión de agua aplicada es una medida más realista del rendimiento señal-ruido del espectrómetro para la RMN de muestras terapéuticas de proteínas.
Para una PQ en un espectrómetro que evalúa la calidad de las proteínas terapéuticas, un atributo de calidad crítico de estos fármacos es una estructura terciaria específica impartida por el plegado de la cadena de aminoácidos. Por lo tanto, como PQ en un espectrómetro que realiza un análisis de mapa de estructura 2D, los espectros 2D-HSQC pueden ejecutarse en un corto período de tiempo en una muestra enriquecida isotópicamente con 15N o 13C para establecer la capacidad del espectrómetro para realizar programas de pulso con esquemas de desacoplamiento eficientes y selección de coherencia de gradiente. Las soluciones estándar de proteínas enriquecidas isotópicamente con 13C o 15N (por ejemplo, la proteína del dominio SH3 o la ubiquitina) en tubos sellados están disponibles comercialmente en concentraciones que permiten recoger datos en unas pocas horas. Espectrómetros convenientemente calibrados a 500 MHz y superiores, y equipados con una criosonda pueden medir mapas de estructura 2D en proteínas de abundancia natural (es decir, no enriquecidas isotópicamente) a una concentración ∼1,0 mM en 2-3 días de tiempo de espectrómetro .