La variación genética de los diferentes estadios de desarrollo de Schistosoma japonicum: ¿la distribución en caracoles y la preferencia de emparejamiento benefician la transmisión?

La variación genética de los diferentes estadios de desarrollo de Schistosoma japonicum: ¿la distribución en caracoles y la preferencia de emparejamiento benefician la transmisión?

Recogida de muestras

La recogida de muestras y el diseño experimental se resumen en la Fig. 1. A continuación se describen los pasos de la recogida de muestras, incluyendo la recogida de caracoles, la recogida de cercariae, la infección de ratones y la recogida de gusanos adultos, y la recogida de miracidia.

Recogida de caracoles

Los caracoles de la especie Oncomelania hupensis se recogieron en marzo y septiembre de 2016 en la zona oriental del lago Dongting (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35,00″ E), provincia de Hunan, China. Los caracoles se localizaron en zanjas de 3 pueblos a una distancia de 10 km. El lugar de recogida es un pantano y no un parque nacional u otra zona protegida o un terreno privado. Las recolecciones se realizaron con el permiso y la asistencia del Instituto de Control de la Esquistosomiasis de la provincia de Hunan, China, que supervisa el control de caracoles en la zona. Oncomelania hupensis no es una especie en peligro o protegida. Los caracoles se llevaron al laboratorio y se clasificaron como Grupo A los recogidos en marzo y Grupo B los recogidos en septiembre. Tras un mes de cautiverio, los caracoles se lavaron y se transfirieron a frascos individuales llenos de agua durante 3 h bajo la luz a 25 °C, para estimular la aparición de cercarías para identificar la infección por S. japonicum. Finalmente, 20 caracoles del grupo A y 25 caracoles del grupo B fueron identificados como infectados por S. japonicum.

Recogida de las cercarías

Después de liberar las cercarías de los caracoles individuales, algunas se transfirieron a un plato utilizando un lazo y se lavaron en una solución de lavado de cercarías (5 g/l de hidrolizado de lactoalbúmina, 6,8 g/l de NaCl, 0,4 g/l de KCL, 0,2 g/l de CaCl2, 0,2 g/l de MgSO4-7H2O y 1 g/l de glucosa) bajo microscopio. Después de 3 lavados, las cercarías se pipetearon individualmente con 2 μl de solución de lavado esterilizada en una tarjeta Whatman™ FTA (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Tras el secado, las tarjetas se guardaron en una bolsa de plástico sellada en un desecador a temperatura ambiente. Se recogieron al menos 50 cercarías por caracol de forma individual y se almacenaron en tarjetas Whatman™ FTA.

Infección de ratones con cercarías de un caracol individual

Para distinguir los caracoles infectados por S. japonicum de un solo sexo, se infectaron percutáneamente 2 ratones Kunming de laboratorio con 30 cercarías de cada caracol por ratón. En total, se infectaron 40 ratones para 20 caracoles del grupo A, y 50 ratones para 25 caracoles del grupo B. Los gusanos se extrajeron de las venas mesentéricas de cada ratón mediante perfusión con NaCl al 0,9% y disección 7 semanas después de la infección. Se tuvo cuidado de minimizar la posibilidad de dividir los gusanos adultos emparejados causada por la fuerza mecánica durante la perfusión y la disección, utilizando 3 técnicos experimentados para procesar los gusanos lo más rápidamente posible. Cada par de gusanos se transfirió a tubos separados para lavarlos y marcarlos inmediatamente, y se almacenaron en etanol absoluto por parejas una vez que se separaron espontáneamente. Los gusanos no emparejados de cada ratón se comprobaron al microscopio para confirmar el sexo y luego se almacenaron en etanol.

Infección de ratones con cercariae pooled de todos los caracoles (Método I y II) y recogida de gusanos adultos

Para las infecciones posteriores, 17 de los 20 caracoles del Grupo A y 16 de los 25 del Grupo B permanecieron vivos y capaces de producir suficientes cercariae. Se utilizaron dos métodos diferentes de agrupación de cercarías para los dos grupos de caracoles. En el caso de los 17 caracoles restantes del grupo A, se juntaron todos los caracoles en un matraz con agua para estimular la emergencia de las cercarías (método I). A continuación, se infectaron 31 ratones por vía percutánea con 34 cercarias por cada ratón. Para la infección con 16 caracoles del grupo B, se juntaron 2 cercarías de cada caracol que se desprendían individualmente, y las 32 cercarías mezcladas se utilizaron para infectar a un ratón (método II), replicándose para infectar a 22 ratones en total. Todos los ratones fueron sacrificados para recoger gusanos de S. japonicum 7 semanas después de la infección, como se ha descrito anteriormente. Finalmente, se recogieron 530 gusanos de ratones por el Método I (Grupo A), 484 gusanos de ratones por el Método II (Grupo B).

Recogida de miracidia

Antes de sacrificar a todos los ratones infectados para recoger gusanos adultos, se recogieron las heces de cada ratón durante 7 días, para concentrar los huevos excretados por el intestino para la eclosión de miracidia. El sedimento de huevos de cada ratón se expuso al agua declorada en un matraz bajo la luz a 25 °C para la eclosión de los miracidios. Los miracidios se recogieron del agua superior de cada matraz con una pipeta y se transfirieron a un plato con solución de lavado de miracidios (5 g/l de hidrolizado de lactoalbúmina, 6,5 g/l de NaCl, 0,14 g/l de KCl, 0,12 g/l de CaCl2 y 0,20 g/l de NaHCO3). Después de 3 lavados, los miracidios se pipetearon individualmente con 2 μl de solución de lavado esterilizada en una tarjeta Whatman™ FTA. Tras el secado, la tarjeta se guardó en una bolsa de plástico sellada en un desecador a temperatura ambiente. Se recogieron al menos 50 miracidios por heces de ratón.

Los miracidios nacidos de huevos atrapados en hígados de ratones infectados también se recogieron como sigue. Se recogió el hígado de cada ratón infectado después de la recogida de gusanos adultos, se homogeneizó en NaCl al 1,2% en frío y se filtró para obtener el sedimento de huevos. Los miracidios se incubaron utilizando el mismo método que el empleado para la muestra de heces. Por último, se pipetearon individualmente al menos 50 miracidios por hígado de ratón y se almacenaron en tarjetas Whatman™ FTA.

Extracción de ADN genómico

Para el ADN de una sola muestra de cercaria o miracidios, se extrajo un disco de 2 mm de diámetro del centro de cada zona de pipeteo de la muestra de una tarjeta Whatman™ FTA utilizando un microperforador Harris de 2 mm (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, Reino Unido). El disco se colocó en la base de una placa de 96 pozos de 1,2 ml con fondo en U. Tras un lavado con 100 μl de reactivo de purificación FTA (GE Healthcare Life Sciences) durante 5 minutos, seguido de 100 μl de tampón TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), se añadieron 14 µ de NaOH 0,1 M con 0,3 mM EDTA, pH 13,0 a cada pocillo y se dejó incubar la solución durante 5 minutos, tras lo cual se añadieron 26 µl de tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0. A continuación, se mezcló la placa pulsando con un mezclador vortex 3 veces durante aproximadamente 10 s cada una. A continuación, la solución se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos, se agitó en vórtex 10 veces y el eluido se transfirió a una placa de 96 pocillos limpia y se almacenó a – 20 °C para su uso posterior.

En cuanto a los gusanos adultos individuales, la parte anterior, incluido el útero, se cortó bajo microscopio de cada gusano hembra adulto para evitar la influencia de los huevos en el útero en el genotipo del gusano hembra. Para la extracción del ADN se utilizaron los gusanos machos enteros o las hembras inmaduras. El ADN genómico total se extrajo individualmente de cada gusano utilizando un procedimiento estándar de dodecil sulfato de sodio-proteinasa K como se indica a continuación. Cada gusano se incubó y descongeló en 400 μl de tampón de extracción que contenía 50 mM de Tris-HCl, 50 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, 1% de SDS y 100 mg/ml de proteinasa K, a 56 °C durante 1 hora con una mezcla suave. El ADN en solución se extrajo utilizando la purificación estándar de fenol/cloroformo, seguida de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y precipitación con etanol. Los pellets de ADN se lavaron en etanol al 70%, se secaron al aire y se resuspendieron en 20 μl de TE (pH 8,0), y se almacenaron a – 20 °C como extracto de ADN crudo de gusano adulto para su uso posterior.

Amplificación por PCR y genotipado de microsatélites

Para confirmar la existencia de ADN genómico en la elución de la tarjeta FTA o en el extracto crudo de la muestra almacenada en etanol, se amplificó el fragmento del gen del ADN ribosómico 28S a partir de la solución de ADN de una sola cercaria, miracidium o gusano adulto, utilizando los siguientes cebadores: adelante (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) y atrás (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). Las PCR se llevaron a cabo utilizando las perlas de PCR Illustra PuReTaq Ready-To-Go en una placa de 96 pocillos (GE Healthcare Life Sciences, Estados Unidos). Para cada perla, se añadieron 2 µl de elución FTA de una sola larva o 0,5 µl de extracto crudo de un solo gusano, con 1 µl de cada cebador, y agua hasta un volumen final de 25 µl. La amplificación se realizó con el siguiente programa 95 °C durante 5 minutos; seguido de 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 40 s a 72 °C; y un paso final de extensión a 72 °C durante 7 minutos. A continuación, se comprobaron las reacciones corriendo 5 µl en un gel TAE de agarosa al 2%.

Se realizó la genotipificación a pequeña escala de 30 cercarías, 30 miracidios y 30 gusanos que se eligieron al azar, para construir un panel óptimo de loci microsatélites multiplex para la amplificación por PCR. Se comprobaron 20 loci desarrollados y validados en estudios anteriores y en nuestro laboratorio. Finalmente, se seleccionaron 9 loci microsatélites (Archivo adicional 1: Tabla S1) para formar el panel. Los loci de microsatélites de cada muestra de ADN se genotipificaron utilizando el kit de PCR Type-it Microsatellite (Qiagen, Manchester, Reino Unido) con el múltiplex de 9 loci. El cebador delantero de cada par se marcó con un colorante fluorescente apropiado, incluyendo 6-FAM, HEX, TAMRA y ROX (archivo adicional 1: Tabla S1). Las reacciones de PCR se prepararon en una placa de PCR de 96 pozos utilizando 6,25 µl de mezcla maestra 2×, 1,25 μl de solución Q, 0,5 μl de cebadores (10 μM), 2 μl de plantilla de ADN y 2,5 μl de ddH2O, y luego se llevaron a cabo en un termociclador Bio-Rad con el siguiente programa: 95 °C durante 5 min; seguido de 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 90 s a 60 °C, y 3 min a 72 °C; seguido de un paso de extensión final a 60 °C durante 45 min. Las reacciones de PCR se comprobaron corriendo 5 µl en un gel de agarosa TAE al 2%, y las amplificaciones exitosas se enviaron a Sangon Biotech (Shanghai, China) para el análisis de los fragmentos en un analizador genético ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Los genotipos se puntuaron utilizando un plugin de microsatélites de Geneious 11.0 . Todas las muestras se amplificaron y genotipificaron dos veces para reducir la desviación. En total, se generaron genotipos de 346 cercarías, 701 gusanos adultos y 393 miracidios para los siguientes análisis.

Análisis de la diversidad genética

La diversidad genética de cada locus se estimó en todas las cercarías genotipadas calculando el número observado de alelos (Na), el número efectivo de alelos (Ae) en GenAlEx 6.5 y la riqueza alélica (Ar) y la diversidad génica (Hs) en hierfstat ver. 0.04-22 , incluyendo 156 cercarías de 20 caracoles del Grupo A y 190 cercarías de 25 caracoles del Grupo B. La desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) para cada locus se comprobó con la prueba de Chi-cuadrado en GenAlEx, y la prueba de desequilibrio de enlaces entre loci se calculó en SHEsis .

El Na, Ae, Ar y Hs se calcularon para diferentes poblaciones durante el proceso de infección de los ratones de la siguiente manera. Para las poblaciones de cercarias utilizadas en la infección, se evaluaron 132 cercarias de 17 caracoles del grupo A (utilizadas en el método I) y 122 cercarias de 16 caracoles del grupo B (utilizadas en el método II). Tras el genotipado y el filtrado de los datos de baja calidad, se logró genotipar al menos 5 pares de gusanos adultos (cuando estaban presentes) y todos los gusanos no apareados de cada ratón. En total, se incluyeron 357 gusanos de ratones en el método I (utilizando cercarías de 17 caracoles agrupados del grupo A) y 344 gusanos de ratones en el método II (utilizando cercarías igualmente mezcladas de 16 caracoles individuales del grupo B). Además, se estimó la diversidad genética de los gusanos adultos de cada ratón para comprobar la consistencia alélica de los gusanos adultos entre los ratones del método I y II por separado. En el caso de las poblaciones de miracidios, la diversidad genética de los miracidios de hígado y heces se calculó a nivel suprapoblacional (miracidios de hígado o heces de todos los ratones), debido a que sólo se genotipificaron 3-4 miracidios de hígado o heces en cada ratón, incluyendo 93 miracidios de hígado (3 por ratón) y 124 miracidios de heces (4 por ratón) en el método I, y 88 miracidios de hígado y heces (4 por ratón por separado) en el método II.

Análisis de la varianza molecular (AMOVA)

La diferenciación genética de todas las cercarías genotipadas del Grupo A y del Grupo B se estimó mediante AMOVA en Arlequin ver. 3.5.2.2 . Tras excluir los caracoles no utilizados para las infecciones de ratones, se comprobó la diferenciación entre 132 cercarias de 17 caracoles del Grupo A (para el método I) y 122 cercarias de 16 caracoles del Grupo B (para el método II). Tras la infección, se comprobó la diferenciación entre los 357 gusanos adultos del método I y la población original de cercarías (132 cercarías del grupo A). También se comprobó la diferencia entre los 344 gusanos del método II y las 122 cercarias del grupo B. Además, se evaluó por separado la variación de los gusanos adultos entre 31 ratones del método I y los gusanos adultos entre 22 ratones del método II. En el caso de las miracidios, se probó la diferenciación genética entre 93 miracidios de hígados y 124 miracidios de heces en el método I, y lo mismo para 88 miracidios tanto de hígados como de heces en el método II.

Análisis de parentesco para los singletons de cercariae con niMLGs

Se contó el número de genotipos de cercarias de cada caracol. Dado que es difícil distinguir los errores de tipificación o la mutación somática durante la multiplicación del esporocisto del genotipo original del miracidio, un grupo de genotipos de cercariae con menos de 2 alelos no coincidentes se identificó como niMLGs y se asignó a un linaje derivado del mismo miracidio en cada caracol. Finalmente, se evaluó el número de miracidios que establecieron clones genéticos en cada caracol en función del número de linaje utilizando el paquete R allelematch ver. 2.5 .

Dado que las cercarías con niMLGs en un caracol se presumían derivadas de un miracidio, uno de los genotipos (singleton) para niMLGs se asignó para representar un grupo de cercarías que se originaron de un miracidio con la función amCluster en allelematch, para producir el conjunto de datos filtrados para el análisis de parentesco entre miracidios. A continuación, se estimó el parentesco entre los monos (miracidios) utilizando el coeficiente de correlación del tamaño de los alelos (I′) según Streiff en SPAGeDi ver. 1.5a a nivel intracaracol y entre caracoles para 20 caracoles del grupo A y 25 caracoles del grupo B, para averiguar si la agregación de miracidios en un caracol se correlacionaba con la similitud genética de los miracidios.

Distribución de alelos para subconjuntos de cercarias procedentes de un número diferente de caracoles

La distribución genética no uniforme de las cercarias entre los caracoles implica que el tamaño de la muestra de caracoles huéspedes afectaría a la distribución de alelos de la suprapoblación de cercarias (cercarias de todos los caracoles). Na, el índice básico para indicar la abundancia de genes de una población , se evaluó además para cada locus en diferentes subconjuntos de cercarías seleccionando diferentes números de caracoles al azar. Los caracoles se seleccionaron al azar en cada número determinado de caracoles, que se fijó de 1 a máximo en cada grupo utilizando la función base sample en R, con 100 réplicas. En cada réplica, el número de cercarías en cada caracol se fijó en 5, que se determinó según la viabilidad práctica y el número medio de cercarías genotipadas en cada caracol en este estudio. Los genotipos de las cercarías para el mismo número de caracoles fueron fusionados, y el Na fue entonces estimado para cada locus con la función nb.alleles en el paquete R hierfstat. La relatividad entre la diversidad genética y el número de caracoles se evaluó calculando el tamaño de muestra más pequeño de caracoles cuando se fijó el 50% y el 95% del Na total.

Distancia genética entre los gusanos adultos hembra y macho

Para detectar una posible preferencia genética de S. japonicum durante el apareamiento, se midió la distancia genética interindividual Dsw entre el macho y la hembra de cada pareja en ratones individuales con Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), y se comparó con la existente entre la hembra emparejada y los gusanos no emparejados (si están disponibles, los no emparejados son mayoritariamente machos) en el mismo hospedador.

Identificación de la paternidad para los miracidios

Las frecuencias alélicas de todos los gusanos adultos y de los miracidios en cada ratón se analizaron y calcularon utilizando la función Allele Frequency Analysis de Cervus 3.0 . Los 9 loci fueron finalmente evaluados como marcadores adecuados para el posterior análisis de parentesco con una probabilidad combinada de no exclusión inferior al 0,01%. Se aplicó la función Simulación de Análisis de Parentesco basada en la frecuencia alélica, para estimar el poder de resolución de los loci codominantes y los valores críticos de la log-verosimilitud (LOD) con los siguientes supuestos 10.000 crías (miracidia) para cada ratón individual; 10 madres y padres candidatos en cada ratón (tamaño de muestra estimado según el número de gusanos adultos recogidos en un huésped); la proporción de candidatos se fijó en el 100% de los gusanos adultos genotipados; las demás opciones se fijaron por defecto. Por último, los resultados del Análisis de Frecuencia Alélica y de la Simulación de Análisis de Parentesco se remitieron al módulo de Análisis de Parentesco, para asignar cada cría a sus padres más probables. Los padres que tienen más de 2 alelos no coincidentes con la descendencia fueron excluidos, y los que tenían el mayor LOD fueron considerados como los padres más probables.

Análisis estadístico

Todos los datos utilizados en el análisis estadístico en este estudio son datos continuos. Se evaluó la significación de la diferencia en los índices de diversidad genética (Na, Ae, Ar y Hs) de los loci, el coeficiente de parentesco (I′) y la distancia genética interindividual (Dsw) entre dos grupos con el nivel de significación de 0,05. En primer lugar, se comprobó la distribución normal de los conjuntos de datos con la prueba de Sharpiro-Wilk. A continuación, se aplicó la prueba t de muestras pareadas/independientes cuando los conjuntos de datos cumplían la distribución normal. En caso contrario, se aplicó la prueba de rangos con signo de Wilcoxon y la prueba U de Mann-Whitney para las muestras relacionadas/independientes. Se utilizó la corrección de Bonferroni para corregir el valor P en las comparaciones múltiples.