Los neutrófilos transmigrados en el lumen intestinal se comprometen con ICAM-1 para regular la barrera epitelial y el reclutamiento de neutrófilos
ICAM-1 promueve la adhesión y locomoción de los PMN en la membrana epitelial apical en condiciones de inflamación
En los abscesos de la cripta como se observa en la EII activa, los PMN que se infiltran en las criptas intestinales suelen estar en íntimo contacto con la superficie epitelial apical (luminal).14 Para examinar las interacciones PMN-IEC durante las últimas etapas de la TEM, modelamos la migración de PMN a través del epitelio intestinal en condiciones inflamatorias utilizando un montaje transwell previamente descrito.19 La TEM de PMN en la dirección fisiológica de basolateral a apical a través de T84 IECs de control o tratadas con interferón-γ (IFNγ) fue inducida por la adición de un gradiente transepitelial de N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). La exposición de las CEI T84 a IFNγ (100 U ml-1, 24 h) no tuvo un efecto significativo en la función de barrera de las CEI ni en la expresión y localización subcelular de las proteínas clave de la unión JAM-A, Occludin y ZO-1 (Figura suplementaria S1 en línea). El tratamiento con IFNγ no tuvo un efecto significativo sobre el número de PMN que completaron la TEM; sin embargo, aumentó significativamente el número de PMN asociados apicalmente (del 8,7±1,8%, sin tratar, al 19,7±1,9%, IFNγ, apical, Figura 1a). En consonancia con este aumento, el número de PMN no migrados (PMN en la cámara superior, basal) se redujo significativamente (∼1,5 veces) tras el tratamiento con IFNγ, lo que sugiere un aumento de la tasa de migración (Figura 1a). El número de PMN dentro de la monocapa epitelial (epith) no se modificó. Las imágenes de inmunofluorescencia confocal representativas (Figura 1b, paneles superiores) y las proyecciones z (paneles inferiores) muestran los PMN asociados apicalmente tras la migración a través de las monocapas estimuladas con IFNγ, pero no de las monocapas T84 de control. Como se ha demostrado anteriormente que el IFNγ induce la expresión de ICAM-1 en el epitelio inflamado,27 se planteó la hipótesis de que, durante la inflamación, los PMN que migraban a través de las monocapas epiteliales permanecían adheridos a la membrana apical a través de interacciones dependientes de Mac-1 e ICAM-1 y, por lo tanto, serían capaces de realizar una locomoción dependiente de ICAM-1, como se ha observado anteriormente en el endotelio vascular.24, 28 Confirmando los hallazgos anteriores, el tratamiento con IFNγ (100 U ml-1, 24 h) indujo un aumento robusto y dependiente del tiempo en la expresión de ICAM-1 (con un pico a las 24 h del tratamiento, Figura 1c,d) en la membrana apical de las CEI T84 (Figura 1e). Este efecto fue específico del IFNγ, ya que la exposición de las CEI T84 y SKCO15 al factor de necrosis tumoral-α (TNFα; 10 ng ml-1) no pudo inducir la expresión de ICAM-1 (Figura suplementaria S2A,B). También se observó un aumento de la expresión de ICAM-1 en el epitelio de la cripta de biopsias colónicas de pacientes con colitis ulcerosa activa en comparación con la mucosa sana (Figura 1f). Además, para confirmar la adhesión de PMN dependiente de ICAM-1 y Mac-1 a las membranas apicales de las CEI, la adición de anticuerpos bloqueadores de la función antiICAM-1 o anti-Mac-1 (Abs; 20 μg ml-1) revirtió el aumento de la adhesión de PMN inducido por IFNγ (Figura suplementaria S3A). Curiosamente, la inhibición de la Mac-1 de los PMN dio lugar a una reducción más potente (>3 veces) de la adhesión de los PMN en comparación con la inhibición de la ICAM-1, lo que sugiere que la Mac-1 se une a otros ligandos de la superficie epitelial además de la ICAM-1.
La expresión de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) inducida por el interferón-γ (IFNγ) promueve la retención de neutrófilos (PMN) en la membrana epitelial apical. (a) Se estimuló a los PMN (100 nM N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF)) para que migraran a través de las células epiteliales intestinales (IEC) T84 de control o tratadas con IFNγ. Se cuantificaron los PMN no migrados (basales), los PMN dentro de la capa epitelial (epiteliales), los PMN asociados a la membrana apical de las CEI tras la migración transepitelial (TEM) (apicales), y los PMN que completaron la TEM (TEM). (b) Tras 1 h de TEM, se fijaron monocapas de CEI y se tiñeron para detectar núcleos celulares (azul) y PMN Mac-1 (verde). Las imágenes representativas muestran una mayor adhesión apical de los PMN tras la migración a través de las CEI T84 tratadas con IFNγ. Barra = 20 μm. Los paneles inferiores son proyecciones de imágenes adquiridas en serie en la dirección z. (c-f) Las CEI T84 confluentes fueron tratadas con IFNγ (100 U ml-1, 24 h) para inducir la expresión superficial de ICAM-1. (c) Diagrama representativo de citometría de flujo y (d) cuantificación de la expresión de ICAM-1 en respuesta al tratamiento con IFNγ. La expresión de ICAM-1 se indujo de forma dependiente del tiempo, alcanzando un máximo a las 24 h. (e) Las CEI T84 se fijaron en etanol y se marcaron con inmunofluorescencia para ICAM-1. La imagen representativa (proyección en Z de siete cortes confocales) demuestra que la expresión de ICAM-1 está restringida a la superficie epitelial apical. (f) Se tiñeron secciones de tejido no inflamado e inflamado de biopsias de pacientes humanos con colitis ulcerosa para ICAM-1 (verde) y núcleos (Topro-3, azul). Las imágenes de inmunofluorescencia representativas muestran el aumento de la expresión de ICAM-1 en el tejido inflamado (panel derecho) pero no en el tejido normal (panel izquierdo). Barra = 50 μm. N=5 experimentos independientes por triplicado, **P<0,01, prueba t de Student de dos colas (a), análisis de la varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls (d).
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A continuación examinamos si los PMN adheridos apicalmente después de cruzar el epitelio mostraban locomoción apical. Se utilizó la microscopía de lapso de tiempo de contraste de fase para seguir y cuantificar el comportamiento de los PMN individuales adheridos a la membrana apical de la CEI. Los PMN en ausencia de estímulos exógenos mostraron poco movimiento; sin embargo, el 59,3±7,6% de los PMN asociados apicalmente después de la migración a través de las CEIs mostraron un comportamiento altamente móvil (Figura 2a) con distancias promedio de arrastre de 65,6±6,2 μm (Figura 2b). La TEM indujo un fuerte aumento de la expresión de Mac-1 en la superficie celular de los PMN (Figura 2c), lo que concuerda con su papel en las interacciones apicales PMN-IEC. Es importante destacar que el número de PMN que mostraron locomoción apical aumentó significativamente cuando las CEI fueron estimuladas con IFNγ para aumentar la ICAM-1 (88±3,6%, IFNγ, frente a 59,3±7,6%, CEI no tratadas). En estas condiciones, los PMN recorrieron distancias significativamente mayores (101±10,0 μm, IFNγ, frente a 65,6±6,2 μm, CEI no tratadas, Figura 2b) a lo largo de la membrana epitelial apical. Confirmando el papel de ICAM-1 en la mediación de la locomoción de los PMN, la adición de un anticuerpo anti-ICAM-1 que bloquea la función (Ab) revirtió los efectos del IFNγ, reduciendo tanto el número como las distancias recorridas por los PMN (61,4±7,8% y 73,6±6,1 μm, respectivamente, Figura 2a,b). La inhibición de Mac-1 abolió la locomoción de los restantes PMN adheridos (Figura 2a y Películas Suplementarias S1 y S2), confirmando un papel exclusivo de Mac-1 en este proceso. Los efectos de la inhibición de Mac-1 en la locomoción de los PMN se ponen de manifiesto en las secuencias de imágenes de lapso de tiempo (Figura 2d) y en las trayectorias de desplazamiento de seis PMN representativos (Figura 2e). Las velocidades de arrastre de los PMN oscilaron entre 3 y 7 μm min-1 y no fueron significativamente diferentes en las CEI no estimuladas frente a las estimuladas con IFNγ (Figura suplementaria S3B).
Los neutrófilos (PMN) adheridos de forma óptima muestran una locomoción dependiente de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) y de Mac-1. (a, b) Tras la migración transepitelial (TEM), se permitió que los PMN se adhirieran apicalmente a las células epiteliales intestinales (IEC) cultivadas en la cámara inferior de los transwells. Se visualizó y cuantificó el número de PMN que mostraban locomoción (a) y las distancias recorridas (b) en presencia o ausencia del control IgG apropiado, o de anticuerpos bloqueadores de la función anti-ICAM-1 y Mac-1 (Abs; 20 μg ml-1), utilizando microscopía de lapso de tiempo con contraste de fase (Zeiss, microscopio Axiovert) y el software ImageJ. (c) Se analizó la expresión de Mac-1 de los PMN antes (línea negra sólida) y después de la TEM (línea punteada) mediante citometría de flujo. El diagrama de flujo representativo (n=4) muestra una fuerte regulación al alza de Mac-1 en la superficie de los PMN después de la TEM. El área rellena representa la tinción IgG de control. (d) Secuencia de imágenes que muestra a PMN representativos exhibiendo locomoción en T84 IECs en ausencia (paneles superiores) y en presencia de Ab bloqueador de Mac-1 (paneles inferiores). *Posición inicial de los PMN, las flechas blancas siguen el movimiento de los PMN. Las líneas discontinuas destacan el camino recorrido por los PMN durante 40 min. Barra = 20 μm. (e) Trayectorias de movimiento (en μm) de seis PMN representativos de tres experimentos independientes durante periodos de tiempo de 40 min en la superficie apical de CEI T84 estimuladas con interferón-γ (IFNγ) en ausencia (paneles superiores) y en presencia de Ab bloqueador de Mac-1 (paneles inferiores). n=4 experimentos independientes por duplicado, **P<0.01, análisis de varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls (a,b).
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La adhesión de PMN a la membrana epitelial apical compromete la función de barrera epitelial
A continuación examinamos los efectos de las interacciones de PMN con ligandos epiteliales expresados apicalmente en la función de barrera epitelial. En estos experimentos, se añadieron PMN apicalmente a IECs T84 confluentes cultivadas en soportes permeables (con un tamaño de poro de 0,4 μm, demasiado pequeño para permitir la TEM de los PMN), y se midió el TER, como índice de la barrera epitelial, durante 12 h en condiciones especificadas. El periodo de 12 horas se seleccionó para evitar los efectos de los PMN apoptóticos en la barrera epitelial.29 La adhesión de PMN estimulada por el fMLF (100 nM) a las CEI T84 provocó una disminución dependiente del tiempo en el TER durante un periodo de 12 horas (∼60%, Figura 3a). Es importante destacar que la adición de PMN a la membrana apical de las CEI T84 que fueron pretratadas con IFNγ, que hemos demostrado que conduce a una mayor adhesión de PMN dependiente de ICAM-1 (Figura 1a), dio lugar a una mayor disminución de la TER (∼40% las primeras 2 h y ∼90% durante 12 h). El tratamiento con IFNγ por sí solo no tuvo ningún efecto sobre el TER. Para comprobar si el aumento observado de la permeabilidad epitelial se debía a un contacto directo entre las células epiteliales y los PMN, utilizamos un Ab inhibidor de Mac-1 (CBRM1/29, 20 μg ml-1) para inhibir la adhesión de los PMN a las CEI estimuladas con IFNγ. La inhibición de Mac-1 atenuó significativamente la disminución de la TER inducida por los PMN tras la estimulación con IFNγ (Figura 3a). Es importante destacar que en otros experimentos confirmamos que la disminución de la TER inducida por los PMN, tanto en monocapas epiteliales no estimuladas como tratadas con IFNγ, dependía del contacto directo entre los PMN y la membrana epitelial apical, y no estaba mediada por mecanismos paracrinos. En estos experimentos, se añadieron PMN a la cámara inferior de transwells que contenían monocapas T84 invertidas (con el lado apical hacia abajo) y se estimularon con fMLF (100 nM). En estas condiciones, no hubo ningún efecto de los PMN sobre la barrera epitelial, según la evaluación de la TER (Figura 3b). La exposición de monocapas epiteliales a 100 nM de fMLF durante 12 h no tuvo ningún efecto significativo sobre la TER.
Las interacciones de los neutrófilos (PMN) con la membrana epitelial apical comprometen la función de barrera. (a) Se introdujeron PMN (2,5 × 105 células) en la superficie apical de células epiteliales intestinales (IECs) T84 no tratadas (Control) o tratadas con interferón-γ (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h) cultivadas en soportes permeables (0.4 μm de tamaño de filtro, impiden la migración transepitelial (TER) de los PMN), en presencia o ausencia de N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM) y en presencia o ausencia de anticuerpos inhibidores anti-Mac-1 (Ab; 20 μg ml-1). Los cambios resultantes en la TER como índice de la función de barrera epitelial se midieron en los puntos temporales indicados. El contacto de los PMN con la superficie epitelial apical dio lugar a una disminución dependiente del tiempo del TER, que se invirtió parcialmente con la inhibición de las interacciones PMN-célula epitelial. N=4 experimentos independientes por triplicado, *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 significativamente diferente de Control+fMLF+PMN, ^^P<0,001 significativamente diferente, análisis de varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. (b) Se añadieron PMN en las proximidades de la membrana apical de CEI no estimuladas (control) o tratadas con IFNγ (IFNγ+PMN+fMLF) sin contacto directo (cámara inferior del montaje transwell) en presencia o ausencia de estimulación con fMLF (100 nM). No se observaron cambios en la TER, lo que sugiere efectos dependientes del contacto. N=4 experimentos independientes por triplicado.
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La ligación de la ICAM-1 epitelial desencadena un aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal dependiente de la MLCK
Observamos que la regulación apical de la ICAM-1 potenciaba significativamente los efectos de la adhesión de los PMN dependientes de Mac-1 en la barrera epitelial (Figura 3a). Por lo tanto, nuestra hipótesis es que el aumento de la permeabilidad inducido por los PMN en las monocapas epiteliales tratadas con IFNγ se debe a la agrupación de ICAM-1 mediada por el contacto de los PMN y a la inducción de eventos de señalización dependientes de ICAM-1, tal y como se ha descrito previamente en el endotelio vascular.30, 31 Las monocapas de IEC T84 sobre soportes permeables se trataron con IFNγ para inducir la expresión de ICAM-1, seguida de la adición de Abs de reticulación a ICAM-1. Confirmamos que el entrecruzamiento mediado por Ab indujo la agrupación de ICAM-1 (Figura Suplementaria S2C). Como se muestra en la Figura 4a, el entrecruzamiento de ICAM-1 mediado por Ab dio lugar a una disminución dependiente del tiempo de TER, que se correlacionó con el aumento del flujo paracelular de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (3 kDa, Figura 4b). Este efecto fue específico para la ICAM-1, ya que la reticulación de otras moléculas de la superficie epitelial, el complejo mayor de histocompatibilidad-1 (MHC-1; Figura 4) y el conocido ligando de los PMN, CD55 (Figura suplementaria S5), no tuvo un efecto significativo sobre la permeabilidad. En consonancia con la ausencia de expresión de ICAM-1 en las CEI T84 no estimuladas, la aplicación de Abs de reticulación a la superficie apical de estas CEI en ausencia de estimulación con IFNγ no tuvo ningún efecto sobre la TER (Figura suplementaria S4A). Del mismo modo, en consonancia con la localización de ICAM-1 inducida por IFNγ en la membrana epitelial apical, la aplicación de Abs de reticulación a la cara basolateral de las monocapas epiteliales no tuvo ningún efecto significativo sobre la función de barrera (Figura suplementaria S4B).
El entrecruzamiento de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) mediado por el anticuerpo conduce a un aumento de la permeabilidad epitelial dependiente de la cadena ligera de miosina (MLCK). Las células epiteliales intestinales T84 (IEC) cultivadas en soportes permeables fueron estimuladas con interferón-γ (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h) para inducir la expresión de ICAM-1. La ICAM-1 o la proteína de superficie de control complejo mayor de histocompatibilidad-1 (MHC-1) se reticuló mediante incubación con Ab primarios (20 μg ml-1, 60 min) seguidos de los anticuerpos secundarios apropiados (20 μg ml-1, 30 min). Se cuantificaron el TER (a) y el flujo de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano (3 kDa) (b) a través de monocapas T84 antes y después de la reticulación de ICAM-1 en los puntos temporales indicados como índice de permeabilidad epitelial. Se introdujo un inhibidor farmacológico de la MLCK, ML-7 (20 μM), una hora antes de iniciar los protocolos de reticulación. La ligadura de ICAM-1 produjo una disminución de la TER y un aumento del flujo de FITC-dextrano, y dependió de la fosforilación de MLCK. (c) Las muestras representativas de western y el análisis densitométrico (utilizando ImageJ) muestran un aumento de la fosforilación de MLCK después de la reticulación de ICAM-1, que se revirtió con la adición de ML-7. (d) Se utilizó la microscopía confocal y el etiquetado por inmunofluorescencia para examinar la remodelación de la actina tras el entrecruzamiento del receptor de control MHC-1 expresado apicalmente, y específicamente ICAM-1, en presencia o ausencia de ML-7 (20 μM). El entrecruzamiento mediado por Ab de ICAM-1 pero no de MHC-1 dio lugar a una disminución del borde en cepillo apical y de la actina de unión. Este efecto se invirtió en presencia de ML-7. Barra = 50 μm. N=4 experimentos independientes por triplicado (a,b), *P<0,05, **P<0,01 significativamente diferente del control (a), **P<0,01, ***P<0,01, n.s. no significativo, (b,c), análisis de varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls.
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Hemos demostrado previamente que los eventos tempranos en la TEM de los PMN (a nivel de la membrana epitelial basolateral) desencadenan disminuciones mediadas por la MLCK en el TER.9 Se ha demostrado que la MLCK desempeña un papel clave en la regulación de la permeabilidad epitelial mediante la regulación de la contracción del anillo de actomiosina perijuncional a través de la fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina II.32 Por lo tanto, nos preguntamos si el aumento de la permeabilidad de la CEI tras la ligadura de la ICAM-1 expresada apicalmente dependía de la MLCK. Efectivamente, la reticulación de la ICAM-1 mediada por Ab dio lugar a la fosforilación de la MLCK (Tyr 464), en consonancia con la activación de la MLCK (Figura 4c). Dicha activación se acompañó de una disminución de la barrera apical y de la F-actina perijuncional (Figura 4d), lo que indica una reorganización del citoesqueleto de actina. Es importante destacar que la inhibición de la fosforilación de MLCK inducida por la ligadura de ICAM-1 en las células T84 con ML-7 (20 μM,33 Figura Suplementaria S4C) impidió la reorganización de la F-actina inducida por ICAM-1 (Figura 4d), la disminución de TER (Figura 4a) y el aumento del flujo de dextrano paracelular (Figura 4b). El tratamiento con ML-7 (20 μM) por sí solo no tuvo ningún efecto sobre el TER. En conjunto, estos datos sugieren que, en condiciones inflamatorias, el contacto de los PMN con la superficie apical de las células epiteliales de la cripta desencadena eventos de señalización dependientes de ICAM-1, lo que resulta en un aumento de la permeabilidad.
El compromiso de ICAM-1 en la membrana epitelial apical facilita una mayor TEM de los PMN
Como la ligadura de ICAM-1 expresada apicalmente aumentaba la permeabilidad epitelial, realizamos experimentos para examinar si las alteraciones dependientes de ICAM-1 en la función de barrera epitelial darían lugar a una mayor TEM de los PMN. En primer lugar, investigamos si la adhesión de los PMN a la ICAM-1 en la membrana apical de la CEI afectaba a la TEM de los PMN en la dirección fisiológicamente relevante de basolateral a apical.34 En estos experimentos, se estimuló a los PMN para que migraran a través de las monocapas epiteliales y se recogieron las células transmigradas y se volvieron a aplicar durante 1 h a la superficie apical de nuevas monocapas epiteliales (2,5 × 105 PMN por monocapa) con o sin pretratamiento de IFNγ. Después de 1 h de contacto PMN-epitelial, las monocapas se lavaron para eliminar los PMN adheridos y se utilizaron para posteriores ensayos de TEM de PMN en dirección basolateral-apical. La introducción apical de PMN en monocapas epiteliales tratadas con IFNγ, pero no en monocapas no tratadas, provocó un aumento significativo de la TEM de PMN (1,7 veces, Figura 5a). El tratamiento con IFNγ solo o la presencia de PMN cerca de la superficie apical, pero sin contacto directo con las monocapas, no tuvo ningún efecto sobre la TEM de los PMN (Figura 5a). En experimentos paralelos, se examinó la TEM de los PMN tras la reticulación específica de ICAM-1 mediada por Ab. En consonancia con el efecto de la reticulación de ICAM-1 en la función de barrera de las CEI, la reticulación de ICAM-1 mediada por Ab en CEI T84 tratadas con IFNγ aumentó significativamente la TEM de los PMN (1,9 ± veces, Figura 5b) en comparación con la reticulación de una molécula de control expresada apicalmente, MHC-1. Como se esperaba, la aplicación de protocolos de reticulación de ICAM-1 a monocapas de CEI no tratadas no tuvo un efecto significativo en la TEM de los PMN. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la adhesión de PMN a la membrana apical (luminal) de la CEI mediante el compromiso de ICAM-1 puede desencadenar alteraciones en la función de barrera epitelial y contribuir a la regulación del reclutamiento de PMN.
La adhesión de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) expresada apicalmente induce un aumento de la migración transepitelial (TEM) de los neutrófilos (PMN) dependiente de la miosina de cadena ligera (MLCK). La TEM de PMN en dirección basolateral a apical a través de monocapas T84 no tratadas (control) o tratadas con interferón-γ (IFNγ) (para inducir la expresión de ICAM-1) fue inducida por un gradiente de N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). (a) Se recogieron PMN transmigrados y se introdujeron en el lado apical de nuevas monocapas T84 en presencia de fMLF (100 nM), o se añadieron a las cámaras inferiores de los transwells, de cara a la membrana apical, pero sin contacto directo con las monocapas (2,5 × 105 PMN por pocillo, 1 h). Tras el lavado de los PMN adheridos apicalmente, se cuantificó la TEM de los PMN. Las interacciones apicales de los PMN específicamente con las células epiteliales intestinales (IEC) T84 tratadas con IFNγ aumentaron significativamente la TEM de los PMN. Este efecto se invirtió en presencia del anticuerpo inhibidor anti-Mac-1 (Ab; 20 μg ml-1). Para todas las condiciones, se determinó el número de PMN que permanecían adheridos a la membrana epitelial apical después de los lavados y se restó del número total de PMN transmigrados. (b) Se cuantificó la TEM de PMN después de la reticulación mediada por Ab de ICAM-1 o de la proteína de control (complejo mayor de histocompatibilidad-1 (MHC-1)). La reticulación de ICAM-1 pero no de MHC-1 en las células T84 tratadas con IFNγ aumentó significativamente la TEM de los PMN. (c) Las monocapas T84 de control y tratadas con IFNγ se preincubaron con ML-7 (inhibidor de MLCK, 20 μM) o Blebbistatina (inhibidor del motor de miosina II, 10 μm) solos o seguidos de la reticulación de ICAM-1. Se cuantificaron los efectos de estos inhibidores en los aumentos inducidos por el entrecruzamiento de ICAM-1 en la TEM de los PMN. Ambos inhibidores impidieron los aumentos de la TEM de los PMN inducidos por el entrecruzamiento de ICAM-1. Para todos los paneles, los datos se presentan como un aumento en pliegues por encima de la TEM de los PMN en las CEI T84 no estimuladas. N=4 experimentos independientes por triplicado, *P<0,05, **P<0,01, n.s. no significativo, análisis de la varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls.
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El entrecruzamiento de ICAM-1 provocó la activación de MLCK, lo que sugiere una contracción de la actina-miosina (Figura 4). Así pues, a continuación examinamos los efectos de la inhibición de la MLCK y la inhibición de las fuerzas contráctiles de la actina en la TEM de los PMN tras el entrecruzamiento de la ICAM-1. El aumento de la TEM de los PMN inducido por el entrecruzamiento de ICAM-1 se invirtió cuando las CEI fueron pretratadas con el inhibidor de MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33) o con el inhibidor del motor de miosina II, Blebbistatina (10 μM, 1 h,35 Figura 5c). Estos resultados sugieren un papel de la contracción de la actomiosina en la corriente descendente de la ICAM-1 en la regulación de la TEM de los PMN. El tratamiento con ML-7 o blebbistatina por sí solos no tuvo ningún efecto sobre la TEM de los PMN (Figura 5c).
La ligadura de ICAM-1 mediada por un anticuerpo en la luz intestinal murina provoca un aumento de la permeabilidad epitelial dependiente de MLCK y un mayor reclutamiento de PMN
A continuación realizamos experimentos in vivo para examinar el efecto de la ligadura de ICAM-1 sobre la función de barrera epitelial intestinal y el reclutamiento de PMN, utilizando un modelo de asa intestinal de ratón (Figura 6b). En este modelo, se evaluó la permeabilidad de segmentos intactos del intestino delgado con perfusión sanguínea tras la introducción de FITC-dextrano en la luz intestinal. Como se muestra en la Figura 6a, aunque no se detectó ICAM-1 en el epitelio no estimulado (panel superior), la administración intraperitoneal (i.p.) de IFNγ y TNFα (500 ng, 24 h) dio lugar a una fuerte inducción de la expresión de ICAM-1. En particular, la ICAM-1 inducida se localizó en las regiones apicales de las CEI de criptas murinas por encima de la Claudina-2 (Figura 6a, panel inferior). Paralelamente, observamos que el tratamiento con citoquinas dio lugar a un aumento de ∼2 veces la permeabilidad del FITC-dextrano de 3 kDa (Figura 6c).
La expresión de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) en el intestino murino in vivo provoca un aumento de la permeabilidad intestinal dependiente de la miosina-cadena ligera (MLCK). Para inducir la expresión de ICAM-1, se inyectó a los ratones una mezcla de interferón-γ (IFNγ) y factor de necrosis tumoral-α (TNFα; 500 ng cada uno, 24 h, por vía intraperitoneal (i.p.)). (a) Se seccionaron segmentos de intestino de ratón congelados con OCT (7 μm de ancho) y se tiñeron con inmunofluorescencia para ICAM-1 (verde) y la proteína de unión estrecha Claudina-2 (rojo). Las imágenes confocales representativas muestran la inducción apical de la expresión de ICAM-1 (flecha blanca) tras el tratamiento con IFNγ/TNFα (panel inferior) en comparación con el tejido no activado (panel superior). Barra = 50 μm. (b) La viñeta representa el modelo de asa intestinal de ratón descrito en Métodos. (c) Se midió la permeabilidad epitelial intestinal in vivo en las condiciones especificadas como se describe en Métodos. El péptido de cola de ICAM-1 (100 μm ml-1) se introdujo lumínicamente 30 min antes de los protocolos de entrecruzamiento de ICAM-1. El inhibidor de MLCK ML-7 (20 μM) se introdujo por inyección i.p. 2,5 h antes del entrecruzamiento de ICAM-1. El aumento del flujo de isotiocianato de fluoresceína (FITC) tras el entrecruzamiento de anticuerpos (Ab) de ICAM-1 se evitó tanto con la adición del péptido de cola de ICAM-1 como con el pretratamiento con ML-7. N=4 ratones por condición, *P<0,05, análisis de varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls.
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Es importante destacar que la introducción de Abs de entrecruzamiento de ICAM, pero no de Abs a la proteína de control, MHC-1 en el lumen de las asas intestinales estimuladas con citoquinas indujo un aumento adicional de ∼1,5 veces en la permeabilidad al dextrano en comparación con el tratamiento de citoquinas solo (Figura 6c). Para confirmar que los aumentos de la permeabilidad epitelial intestinal estaban mediados específicamente por eventos de señalización inducidos por la ICAM-1 epitelial, utilizamos péptidos derivados del dominio citoplásmico de la ICAM-1 (péptido ICAM-1) para inhibir la capacidad de la ICAM-1 de mediar eventos de señalización descendentes. Se ha demostrado previamente en el endotelio vascular que el ICAM-1, pero no el péptido de control, inhibe las interacciones entre el ICAM-1 y las proteínas diana, impidiendo así la señalización dependiente del ICAM-1 sin afectar a la unión con los ligandos leucocitarios extracelulares.22, 24 La adición de ICAM-1, pero no del péptido de control (100 μg ml-1, 30 min), inhibió los aumentos de la permeabilidad intestinal inducidos por la ligadura del ICAM-1 (Figura 6c). Se confirmó que los Abs introducidos intraluminalmente en las asas intestinales (sin estimular y tras la activación de IFNγ/TNFα) no atravesaban el epitelio, descartando así la posible contribución indirecta de las células de la lámina propia a los efectos observados (Figura suplementaria S6).
En apoyo adicional del papel de la MLCK en la señalización mediada por ICAM-1, la inhibición de la activación de la MLCK utilizando ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) antes de la reticulación de ICAM-1 impidió el aumento de la permeabilidad (Figura 6c). Estos datos demuestran que el aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal in vivo tras la ligadura de la ICAM-1 depende de la MLCK.
Como el aumento de la permeabilidad epitelial se asocia con un aumento de la migración de PMN, nos preguntamos si la ligadura de la ICAM-1 conduciría a un mayor reclutamiento de PMN in vivo. Utilizando el modelo de asa intestinal murina, se indujo la infiltración de PMN en la mucosa intestinal y la migración hacia el lumen mediante la administración luminal del quimioatrayente CXCL1 (1 μM en 200 μl de solución salina equilibrada de Hank (HBSS)+) y se cuantificó mediante etiquetado por inmunofluorescencia/microscopía confocal y análisis del líquido lavado preparado en citospines, y teñido con Diff-Quik, respectivamente. En ausencia de quimioatrayente, no se detectaron PMN en el epitelio intestinal ni en la luz intestinal (no se muestra); sin embargo, la administración luminal de CXCL1 desencadenó una migración significativa de PMN hacia la capa epitelial (Figura 7a) y su acumulación en la luz intestinal (Figura 7c). En consonancia con el aumento de la permeabilidad inducido por las citocinas, el tratamiento con IFNγ/TNFα aumentó en ∼2,2 veces el número de PMN en el epitelio intestinal, y en ∼1,7 veces en la luz. Es importante destacar que la adición de ICAM-1 crosslinking Abs en el lumen de las asas intestinales tratadas con citoquinas aumentó aún más (en comparación con el tratamiento de citoquinas solo) el número de PMN tanto en el epitelio (∼1,6 veces, Figura 7a,b) como en el lumen (∼1,4 veces, Figura 7c,d). Los PMN (en verde) que se infiltran en el epitelio intestinal (en rojo) se muestran en imágenes representativas de secciones de tejido de asas intestinales activadas por citoquinas tras la ligadura de ICAM-1 (Figura 7b). Del mismo modo, los PMN que migraron al lumen tras la ligadura de ICAM-1 se muestran en imágenes representativas de fluidos de lavado de asas intestinales (Figura 7d).
La ligadura de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) en el intestino murino in vivo conduce a un aumento del reclutamiento de neutrófilos (PMN) dependiente de la miosina de cadena ligera (MLCK). La migración transepitelial (TEM) de PMN en el modelo de asa intestinal murina se indujo mediante la introducción luminal de CXCL1 (1 μM en 200 μl de solución salina equilibrada de Hank (HBSS)+). (a) Se cuantificaron los PMN en los epitelios de la mucosa a partir de criosecciones del asa intestinal marcadas con inmunofluorescencia para PMN (verde) y F-actina (rojo). (b) Las imágenes representativas muestran una fuerte infiltración de PMN tras el entrecruzamiento de ICAM-1 (panel derecho) en comparación con el tejido intestinal sin introducción de CXCL1, donde los PMN se localizan dentro de los vasos sanguíneos (flecha blanca). Barra = 50 μm. (c) Los PMN que migraron al lumen fueron aislados por lavado y cuantificados a partir de citospinas teñidas con Diff-Quik. Los datos se presentan como porcentaje de todas las células en el líquido de lavado. (d) Las imágenes representativas de las citospinas muestran los PMN transmigrados en el lavado luminal intestinal tras el entrecruzamiento de ICAM-1 (panel derecho, los PMN se indican con flechas blancas). Los PMN no se detectan en la luz intestinal sin la introducción del quimioatrayente (panel izquierdo). Barra = 10 μm. N=4 ratones por condición, *P<0,05, análisis de varianza con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls.
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En consonancia con los aumentos de la permeabilidad epitelial inducidos por la ligadura de ICAM-1, el aumento de la migración de PMN a la luz intestinal dependía de los eventos de señalización mediados por ICAM-1 y la activación de MLCK. Tanto la adición intraluminal del péptido ICAM-1, pero no el péptido de control (no mostrado; 100 μg ml-1, 30 min), como la inhibición de la MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) antes de la reticulación mediada por Ab de ICAM-1, inhibieron completamente los aumentos inducidos por la ligadura de ICAM-1 en la migración de PMN (Figura 7a,c). Estos resultados sugieren que el compromiso de ICAM-1 en la membrana epitelial apical del intestino en condiciones de inflamación compromete la función de barrera, facilitando así un mayor reclutamiento de PMN in vivo.