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DISCUSIÓN
El sistema modelo del sintetizador de ADN contiene todas las proteínas necesarias para apoyar cada fase del proceso de replicación del ADN, y estas proteínas tienen un tamaño de entre 20 y 240 kDa en las condiciones de ensayo actuales, y pueden llevar a cabo todas las fases del proceso de replicación del ADN in vitro . En este estudio, se caracterizó la actividad de la primasa de ADN asociada al sintetizador, examinando la síntesis y extensión de los cebadores de ARN catalizados in vitro por el sintetizador de ADN. Los resultados de nuestros análisis funcionales muestran que la actividad de la ADN primasa asociada al sintetizador en la fracción P4 derivada de las células de cáncer de mama es 30 veces mayor que la de los extractos crudos de células de cáncer de mama. La fracción P4, que contiene el sintasa de ADN, se derivó de las fracciones combinadas de proteínas solubles nucleares y citoplasmáticas preparadas a partir de células MCF7 y se utilizó para realizar el ensayo de replicación de ADN SV40 in vitro . Las actividades de la ADN polimerasa α y δ y de la ADN primasa en la fracción P4 son 20-40 veces superiores a las de los extractos celulares crudos ; lo que la convierte en una herramienta útil para estos estudios, ya que es totalmente competente para soportar la síntesis y extensión de los cebadores de ARN en un sistema modelo in vitro que ha demostrado soportar todas las fases del proceso de replicación del ADN .
La ADN primasa exhibe una procesividad única en la síntesis y extensión de los cebadores de ARN. Esta procesividad se define por una competencia entre la adición del siguiente nucleótido correcto y la disociación del complejo cebador-plantilla . La primasa de ADN es la única enzima capaz de sintetizar cebadores de ARN durante la iniciación de la síntesis de ADN . Ninguna de las subunidades de la primasa es capaz de sintetizar o extender un cebador de ARN por sí misma. El sintetizador contiene ambas subunidades de la primasa (es decir, p49 y p58) y puede catalizar la síntesis de cebadores de ARN in vitro utilizando una plantilla exógena de poli(dT). El sintetizador sintetiza un cebador de ARN funcional de longitud unitaria (7-10 nt). Estos cebadores de ARN son completamente hidrolizados por la RNasa en fragmentos cortos de 1-4 pb, pero no son hidrolizados por la DNasa. La característica distintiva de la primasa asociada al sintetizador, que la distingue de una primasa de ADN aislada, es su capacidad específica de extender el cebador de ARN para formar una cadena de ADN-primer. La síntesis de una cadena de ADN-primer también requiere la actividad de la ADN polimerasa además de la actividad de la ADN primasa. La actividad de la ADN polimerasa se conmuta normalmente para iniciar la elongación de un cebador de ARN después de la síntesis del cebador. Sólo los cebadores de ARN de longitud ≥7 nucleótidos son utilizados por la polimerasa; independientemente de la concentración de dNTP . Por lo tanto, la síntesis y extensión del cebador de ARN de longitud unitaria no sólo requiere de la primasa, sino que también implica a la subunidad α de la ADN polimerasa p180 , y el sintetizador contiene ADN polimerasas altamente activas, que catalizan la incorporación de desoxirribonucleótidos para extender el cebador de ARN. Los cebadores de ARN son extendidos por las polimerasas asociadas al sintetizador a partir de un oligoprímero de ADN-ARN de 20-40 nt de longitud (cebador de ADN). Las cadenas del cebador de ADN contienen dos componentes: (1) un ribonucleótido de 10 nt y, (2) un desoxirribonucleótido de 20-40 nt. La RNasa y la DNasa hidrolizan por separado los componentes apropiados de las cadenas de ADN-primer, lo que da como resultado un acortamiento pero una hidrólisis incompleta de la cadena de ADN-primer.
Otra característica del sintetizador es la rápida síntesis y los distintos tamaños del cebador de ARN y de la cadena de ADN-primer. El sintetizador cataliza la síntesis de un cebador de ARN y una cadena de cebador de ADN rápidamente, y los niveles de estado estable parecen acumularse en un plazo de (5-15 minutos). Los tamaños del cebador de ARN de longitud unitaria (7-10 nt) y de la cadena de cebador de ADN (20-40 nt) catalizados por el sintetizador de ADN permanecen siempre constantes, independientemente de la concentración del sintetizador o del tiempo de reacción. Este estudio sobre el mecanismo de la actividad de la primasa de ADN implica que la síntesis de los cebadores de ARN, catalizada por la primasa asociada al sintetizador, se produce mediante una iniciación lenta, una polimerización rápida y una terminación «inteligente» del cebador . La primasa de ADN se une al molde de ADN e inicia lentamente la síntesis de un dinucleótido. Tras la síntesis del dinucleótido, se añaden rápidamente NTPs adicionales al dinucleótido polimerizado por la ADN primasa. La actividad de la ADN primasa se caracteriza por la síntesis de cada cebador de ARN en una sola «ráfaga» de actividad, en lugar de hacerlo mediante una síntesis distributiva. Una vez que se han generado cebadores de longitud unitaria de 7-10 nt, el cebador-plantilla actúa como señal de terminación e inhibe la síntesis posterior de ARN. Esta inhibición se debe a la generación de un cebador-plantilla estable, que probablemente permanece asociado al complejo pol α-primasa. Curiosamente, las cadenas de ADN-primer sintetizadas por el sintetizador de ADN in vitro son similares a los primers de ARN sintetizados in vitro. La síntesis de una hebra de ADN-primer alcanza rápidamente los niveles de estado estacionario y el tamaño de la hebra de ADN-primer permanece relativamente constante (entre 20 y 40 nt), independientemente del tiempo de reacción o de la concentración del sintetizador utilizada durante la reacción de síntesis. La síntesis de la cadena de ADN-primer requiere la actividad de la ADN polimerasa α además de la ADN primasa . Nuestros resultados sugieren que la actividad de la polimerasa α asociada al sintetizador también se caracteriza por una polimerización rápida y una terminación «inteligente» en la síntesis de la cadena de ADN-primer. El synthesome, con la característica de polimerización rápida y terminación inteligente de la cadena de ADN-primer, difiere de la síntesis medicada por el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli durante la extensión del cebador de ARN. En contraste con el sintetizador, la extensión del cebador de ARN catalizada por la polimerasa I depende en gran medida de la duración del tiempo de reacción. El aumento del tiempo de reacción aumenta significativamente la cantidad y el tamaño de los cebadores de ARN extendidos.
Se han propuesto dos mecanismos potenciales para explicar el cambio de la síntesis del cebador a la extensión del mismo durante el proceso de replicación del ADN . El primero propone que el complejo cebador-polimerasa se disocia del cebador-placa y se vuelve a asociar con el sitio activo de la polimerasa. La segunda propone que el cambio se produce en una translocación intraestral del complejo pol α-primasa desde el sitio activo de la primasa al sitio activo de la polimerasa α. Este cambio no implica la disociación del complejo pol α-primasa de la plantilla de ADN. Nuestros experimentos demuestran que la extensión del cebador de ARN catalizada por la polimerasa I es inhibida por altas concentraciones del sintetizador de ADN. La capacidad del fragmento Klenow para extender un cebador de ARN depende de la síntesis de cebadores de ARN catalizada por el sintetizador, que también necesita un sitio de unión disponible en el extremo del cebador de ARN. Por lo tanto, el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli requiere la disociación del complejo primasa-polimerasa del cebador-plantilla. Sin embargo, altas concentraciones del sintetizador compiten con la polimerasa I por el sitio de unión en el cebador-placa, de modo que se inhibe la extensión del cebador de ARN. El sintetizador forma un complejo sin salida en el extremo del cebador de ARN, lo que hace que el fragmento de Klenow no pueda participar en el proceso de extensión del cebador de ARN. Este resultado sugiere que el complejo polimerasa-primasa del sintetizador de ADN debe disociarse del cebador-plantilla tras la síntesis del cebador de ARN. Nuestro resultado muestra que el sintetizador aumenta el tamaño del cebador de ARN de longitud unitaria cuando se reduce la temperatura de reacción. La reducción de la temperatura de reacción aumenta la eficacia de la conmutación del complejo polimerasa-primasa y disminuye la desnaturalización del cebador-placa. Además, la subunidad p49 de la ADN primasa contiene la actividad catalítica de la ARN polimerasa, necesaria para aumentar el tamaño del cebador de ARN de longitud unitaria. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el sintetizador de ADN tiene la actividad polimerasa de ARN adecuada necesaria para formar fragmentos de ADN cebados con ARN.
El análisis cinético de la iniciación y elongación del cebador de ARN demuestra que la primasa de ADN asociada al sintetizador es una enzima lenta y relativamente débil con respecto a la unión de plantillas . La ADN primasa es también una polimerasa de ácido nucleico propensa a errores porque esta enzima tiene una capacidad de discriminación de nucleótidos muy pobre; lo que da lugar a la incorporación errónea de nucleótidos . Por lo tanto, nuestro análisis de la cinética enzimática de la actividad de la ADN primasa asociada al sintetizador podría utilizarse para determinar la relación de las tasas de síntesis y las frecuencias de error durante la síntesis de los cebadores de ARN. La síntesis discontinua de fragmentos de ADN (Okazaki) en la hebra rezagada de la horquilla de replicación es un proceso bioquímico importante durante la replicación del ADN. Para garantizar una coordinación eficaz entre la síntesis continua de ADN en la hebra principal y la síntesis discontinua de ADN en la hebra rezagada, la ADN primasa requiere una serie de pasos enzimáticos programados con precisión que controlen la síntesis del cebador de ARN. Un estudio cinético de un complejo de replicación multiproteico del bacteriófago T7 muestra que la primasa actúa como un freno molecular y detiene transitoriamente la progresión de la horquilla de replicación. Debido a la interacción física de la ADN polimerasa δ con la pol α, el resultado presentado por Lee et al. sugiere que la ADN primasa puede ser capaz de evitar que la síntesis de la cadena principal supere a la síntesis de la cadena retrasada durante los pasos enzimáticos lentos en la cadena retrasada.
En el estudio de la función de la ADN primasa se han utilizado diversos modelos de replicación del ADN eucariótico. El sistema de replicación de la matriz nuclear del lisado de células enteras se ha utilizado para examinar la síntesis y la distribución del cebador de ARN nativo y del ADN naciente cebado por ARN en los núcleos de las células eucariotas utilizando una plantilla de ADN de doble cadena endógena unida a la matriz nuclear. Los cebadores de ARN están estrechamente asociados a la matriz nuclear de las células de mamíferos de rápida proliferación. Los cebadores de ARN se unen covalentemente al ADN recién replicado para formar ADN naciente cebado por ARN. El ADN cebado por ARN se degrada en algunos oligorribonucleótidos de ~10 nt de longitud tras la digestión con DNasa , y al menos el 94% de los cebadores de ARN nativos y del ADN naciente cebado por ARN se localizan dentro de la fracción de la matriz insoluble del núcleo. Los cebadores de ARN de 8-10 nt de longitud que se encuentran asociados a la matriz nuclear, constituyen <1% del ARN total de la célula ; por lo que es muy difícil examinar los cebadores de ARN y el ADN naciente cebado por ARN en la fracción de la matriz nuclear de la célula debido a una concentración muy baja de cebadores de ARN y a la relativa gran cantidad de otros ARN. Además, el aislamiento de los cebadores de ARN y del ADN naciente cebado por ARN a partir de lisados de células enteras marcados con radionucleótidos es un procedimiento de purificación complicado y no trivial cuando se aplica al análisis de la síntesis de cebadores de ARN mediada por el modelo de replicación de la matriz nuclear. Por el contrario, el sintetizador de ADN purificado a partir de las fracciones nucleares y citoplasmáticas combinadas contiene primasa de ADN y ADN polimerasas altamente activas, y admite plenamente la síntesis de cebadores de ARN nativos in vitro utilizando una plantilla de ADN de origen SV40 de doble cadena. Los cebadores de ARN sintetizados por el ADN son de longitud normal (10-20 nucleótidos) y parecen funcionar correctamente para soportar la extensión del cebador por la ADN polimerasa. Estos cebadores de ARN pueden extenderse fácilmente para formar ADN naciente cebado con ARN de 100-200 nt. La síntesis discontinua de fragmentos de ADN (Okazaki) en la hebra rezagada de la horquilla de replicación es un importante proceso bioquímico implicado en la replicación del ADN, y los fragmentos de ADN de longitud completa cebados con ARN (Okazaki) sintetizados por el sintetizador de ADN también tienen una longitud de unos 100-200 nucleótidos. Hemos observado que el sintetizador de ADN puede sintetizar diferentes productos de ARN cebado de entre 10 y 200 nt de longitud. Esto puede considerarse razonable, ya que los cebadores de ARN nativos y el ADN naciente cebado con ARN también tienen esta longitud aproximada. La observación anterior, de que la síntesis del cebador de ARN y del ADN naciente cebado con ARN, catalizada por el sintetizador de ADN, es esencialmente equivalente a la del estudio publicado utilizando el modelo de replicación de la matriz nuclear del lisado de células enteras , sugiere que el sintetizador de ADN es un excelente sistema modelo capaz de llevar a cabo un proceso de replicación de ADN fisiológicamente significativo in vitro.
El modelo del sintetizador de ADN es, por tanto, una herramienta única y valiosa en el estudio de la función de la primasa de ADN. La síntesis y extensión de cebadores de ARN mediada por la primasa y la elongación llevada a cabo por el sintetizador de ADN se asemeja mucho a la llevada a cabo por otros modelos de replicación sin células. El modelo del sintetizador admite la síntesis y extensión de cebadores de ARN in vitro utilizando plantillas exógenas de ADN monocatenario, así como ADN bicatenario superenrollado que contiene un origen de replicación SV40 intacto. Por lo tanto, el sintetizador de ADN es totalmente capaz de mediar en la síntesis y extensión de cebadores de ARN in vitro, y puede facilitar la investigación adicional de los mecanismos que inician la síntesis de ADN en las células eucariotas. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el modelo del sintasa proporciona una herramienta única para estudiar la interacción de la primasa de ADN y otras proteínas de replicación durante el proceso de replicación del ADN.