Producción de albúmina humana en cerdos mediante el knockin mediado por CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
La albúmina sérica humana (HSA) es la proteína plasmática más abundante que desempeña funciones homeostáticas críticas en la fisiología humana, incluyendo el mantenimiento de la presión oncótica del plasma, la regulación de la distribución de los fluidos corporales, el transporte de pequeñas moléculas, etc1. Se prescribe para una serie de enfermedades graves como la insuficiencia hepática y el shock traumático2. Debido a la escasez de suministro de sangre humana y a los riesgos asociados a la misma, hace tiempo que se busca una producción alternativa de albúmina humana. La producción de HSA recombinante se intentó anteriormente en cerdos mediante la expresión dominante de transgenes en forma de fusión albúmina-GFP3. Sin embargo, en los enfoques transgénicos, debido a la presencia de albúmina porcina endógena, la separación y purificación de la rHSA son problemáticas. Aprovechando el poder del sistema CRISPR/Cas9 en la modificación del genoma, buscamos producir rHSA en cerdos a través del knocking del cDNA de la albúmina humana en el locus de la albúmina porcina. Al insertar el cDNA de ALB humana más la secuencia de señal SV40 polyA (2368 bp en total) en el locus Alb porcino inmediatamente después del codón de inicio, esperamos que la ALB humana se exprese bajo el control transcripcional de la albúmina endógena porcina y que al mismo tiempo bloquee la expresión de la albúmina endógena porcina (Fig. 1a). Diseñamos un sgRNA dirigido a la región del codón de inicio (inmediatamente 5′ de la ATG e incluyéndola) y generamos un fragmento dirigido (donante para la recombinación homóloga) con el inserto flanqueado por secuencias homológicas de 1 kb a ambos lados (Fig. 1a). Dado que la secuencia de homología 5′ utilizada en el donante llega hasta el codón de inicio, contiene la secuencia del sgRNA y, por tanto, puede ser el objetivo del sgRNA como donante o del alelo knockin tras la recombinación homóloga. Para evitarlo, insertamos 6 pb (gccacc) en la secuencia del sgARN justo antes del codón inicial. El sgRNA se transcribió in vitro, se purificó y se inyectó en los ovocitos fecundados junto con el ARNm de Cas94 y el vector circular que contenía el fragmento de orientación. La fuente de ovocitos fue Bama minipig5. Los embriones inyectados se cultivaron durante 1-2 horas antes de ser implantados en hembras sincronizadas con el celo. ~Se implantaron unos 300 embriones en 10 hembras, 5 de las cuales quedaron preñadas y dieron a luz un total de 16 crías vivas. Las crías recibieron los cuidados habituales y no mostraron ningún signo de problemas de salud inusuales.
Knockin del ALB humano en el locus Alb porcino.
(a) Diagrama de la estrategia de knockin. (b) Genotipado de los fundadores. Los cebadores PRC se ilustran en (a). (c) Resultados de la secuenciación de los productos de la PCR obtenidos con el par de cebadores e/f (a). Los productos se clonaron y se secuenciaron hasta 12 clones (para #9).
Cortamos las puntas de las orejas de los 16 lechones cuando tenían unas 4 semanas de edad y obtuvimos ADN genómico para el genotipado. Para determinar si habíamos logrado el knockin, evaluamos los extremos 5′ y 3′ del sitio de inserción. Utilizamos dos pares de cebadores, a/b y c/d (Fig. 1a). El cebador a está fuera del extremo 5′ de la homología utilizada y b está en el ALB humano (el inserto); c está en el ALB humano y d fuera del extremo 3′ de la homología. Como se muestra en la Fig. 1b, los 16 lechones llevan el alelo knockin previsto. Clonamos y secuenciamos todos los fragmentos de ADN amplificados. Eran los productos de recombinación homóloga esperados (Fig. S1). A continuación, determinamos el estado del alelo de tipo salvaje en estos lechones. Los cebadores e y f (contenidos en el inserto) (Fig. 1a) debían amplificar un fragmento de 705 pb del locus wildtype y un fragmento de 3085 pb del alelo knockin. Como era de esperar, todos ellos generaron el fragmento de 3085 pb. Sin embargo, inesperadamente, pudimos obtener el fragmento aparente de 705 pb del locus wildtype sólo en 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 y 15) de las 16 muestras, y el resto generó productos débiles de alrededor de 700 pb (Fig. 1b). La aparente ausencia del alelo de tipo salvaje en algunos lechones sugiere que el knockin podría haber ocurrido en ambos alelos. Alternativamente, el alelo de tipo salvaje podría haber sido editado de tal manera que la secuencia del cebador a fuera eliminada, resultando en el fracaso de la amplificación del alelo de tipo salvaje. De hecho, la edición en el alelo de tipo salvaje ocurrió porque el tamaño de los fragmentos amplificados difería de los 705 pb predichos en algunos lechones (Fig. 1b). Para confirmarlo, clonamos y secuenciamos todos los fragmentos amplificados. Como se muestra en la Fig. 1c, todos ellos estaban editados, aunque algunos tenían sólo unos pocos cambios de pares de bases (por lo que parecían estar a 705 pb). Entre estos alelos editados, los encontrados en el lechón #10 y #12 son de interés. El del #10 fue el producto de la sustitución de un tramo de 29 pb (desde el ATG hacia el extremo 3′) de la secuencia del cerdo por 36 pb (6 pb 5′ del ATG y 26 pb después) de la secuencia del donante. No está claro cómo ocurrió esto. En el #12, hay dos alelos editados diferentes, lo que sitúa el número total de alelos en 3, indicando mosaicismo en este lechón, lo que no es infrecuente ya que el mosaicismo se encontró a menudo en animales generados a través de la inyección en el cigoto de Cas9/sgRNA6,7,8,9,10.
Para determinar si se había producido un off-targeting con el sgRNA, elegimos 4 sitios potenciales off-target basados en las sugerencias de la herramienta de diseño CRISPR (http://tools.genome-engineering.org) y amplificamos fragmentos que contenían estos sitios del ADN genómico de la punta de la oreja del lechón #14. Los fragmentos se sometieron al ensayo T4EN I4. Como se muestra en la Fig. S2, no se encontró ninguna edición fuera del objetivo. Sin embargo, no pudimos eliminar la posibilidad de que la edición fuera del objetivo ocurriera en otros loci o en los otros 15 cerdos transgénicos. No obstante, incluso si hubiera edición fuera del objetivo, es poco probable que los loci editados sean problemáticos para nuestro propósito de producir rHSA, siempre y cuando no interfieran con el bienestar de estos cerdos transgénicos.
Habiendo demostrado el éxito del knockin del ALB humano, tratamos de determinar si la albúmina humana podría ser detectada en el plasma sanguíneo de estos lechones knockin. Como se muestra en la Fig. 2a, todos los lechones contenían albúmina humana en su plasma sanguíneo detectable con los anticuerpos específicos contra la albúmina humana, aunque a niveles variables, lo cual es probablemente un resultado de al menos dos factores, si ambos alelos son knockin y el grado de mosaicismo (especialmente en el hígado). El nivel en el #7 es muy bajo, sólo visible tras una larga exposición del blot, a pesar de la aparente ausencia del alelo Alb de cerdo de tipo salvaje (Fig. 1a). En general, los niveles son mucho más bajos que los del suero humano adulto. Se sabe que la concentración de albúmina en sangre en los cerdos aumenta con la edad, alcanzando un nivel similar al de los humanos adultos a los 6 meses de edad11.
Análisis de ALB humana en sangre.
(a) Detección por Western blot de albúmina humana en sangre de lechones fundadores. Se separaron 0,5 μl de plasma de cada fundador en SDS-PAGE y se analizaron. Se utilizó plasma de sangre humana (0,5 μl después de diluirlo 30 veces) como control positivo. C, plasma de un cerdo de tipo salvaje. (b) Ilustración de los péptidos trípticos (verde) detectados con el análisis de espectros de masas. (c) Semicuantificación de dos péptidos trípticos de albúmina humana y porcina mediante la medición de las áreas de pico de cada péptido. En rojo se marcan los residuos de aminoácidos que son específicos del cerdo.
Para confirmar que la rHSA detectada en el plasma de nuestros lechones knockin con anticuerpos es realmente albúmina humana, sometimos dos muestras de plasma (lechón #2 y #6) al análisis espectral de masas. El #2 es aparentemente homocigoto para el alelo knockin y el #6 contiene un alelo knockin y otro mutante (frameshift) (Fig. 1). Se separaron 0,5 μl de plasma en SDS-PAGE y las proteínas alrededor de 70 KD se digirieron en el gel con tripsina. Los péptidos trípticos se eluyeron del gel, se secaron y se volvieron a disolver para su separación por cromatografía líquida y análisis de espectros de masas. Para el lechón #2, pudimos detectar 14 péptidos trípticos humanos únicos del ALB y 15 para el #6 (Fig. 2b). Los espectros M/Z para el péptido humano FKDLGEENFK y el péptido porcino FKDLGEQYFK (ambos del lechón #2) se muestran en la Fig. S3. Se eligieron dos péptidos para su cuantificación midiendo las áreas de los picos. De acuerdo con los resultados del western blot, estos dos péptidos eran mucho más abundantes (~5 veces) en el #2 que en el #6 (Fig. 2c). Estos resultados demuestran que la rHSA detectada por los anticuerpos es auténtica albúmina humana.
El genotipado del ADN aislado de las puntas de las orejas indica que tanto el #2 como el #6 no contienen ningún alelo Alb de cerdo de tipo salvaje, ya sea no presente o editado (Fig. 1b,c). Sin embargo, aún pudimos detectar péptidos trípticos de albúmina de cerdo en ambas muestras, pero en una abundancia mucho menor (Fig. 2c). Curiosamente, la abundancia de los péptidos del cerdo era casi la misma entre las dos muestras, a pesar de que la abundancia de los péptidos humanos era muy diferente. Estos resultados sugieren que ambos lechones contienen un número similar de hepatocitos de tipo salvaje (o heterocigotos) que son responsables del ALB porcino detectado en la sangre de estos dos lechones. Sin embargo, estas células que contienen alelos de tipo salvaje podrían no existir o existir en un porcentaje extremadamente bajo en las puntas de las orejas, de modo que el alelo de tipo salvaje no podría ser amplificado por PCR. Además, el análisis de Southern blot con una sonda interna (la mitad 3′ del CDS del ALB humano) indicó la presencia de una inserción adicional de la secuencia donante en los lechones #1, 4 y 5 (Fig. S4). Todas estas complicaciones no serán un problema para el propósito de producir albúmina humana recombinante ya que el alelo knockin puede ser purificado a través del retrocruzamiento.
Para determinar si el alelo knockin puede ser transmitido a la siguiente generación, cruzamos a #2 (macho, homocigoto) con #5 (hembra, heterocigoto) cuando llegaron a ser reproductivamente maduros. Del cruce nacieron 6 crías. 4 de ellos (#1, 3, 4 y 6) son homocigotos para el alelo knockin (AlbH/H, H denota humano) y 2 (#2 y 5) heterocigotos (AlbP/H, P denota cerdo) (Fig. 3a). #5 y 6 murieron de diarrea unas dos semanas después del nacimiento. Analizamos la expresión de albúmina humana en la sangre de los lechones restantes a las 4 semanas de edad. Como se muestra en la Fig. 3b, todos ellos tienen albúmina humana en la sangre. Curiosamente, el nivel de albúmina humana en el animal heterocigoto (#2) era mucho menor que en los homocigotos. No sabemos si esto es el resultado de una variación individual o si el alelo knockin está suprimido de alguna manera por el alelo de tipo salvaje.
Transmisión por línea germinal del alelo knockin.
(a) genotipado por PCR de la descendencia F1. Los cebadores utilizados fueron los mismos que en la Fig. 1. (b) Detección por Western blot de albúmina humana en la sangre de los lechones F1. Se separaron 0,5 μl de plasma de cada lechón en SDS-PAGE y se analizaron. C, plasma de un cerdo de tipo salvaje. M, marcador de peso molecular.
Mostramos aquí la generación exitosa de cerdos portadores del cDNA de la ALB humana golpeada en el locus Alb porcino. Esto es un paso más allá de la simple edición de genes en cigotos de cerdo reportado recientemente por Hai et al.12 y nosotros13. Los grandes animales domésticos han sido utilizados como biorreactores de productos proteicos biomédicos14,15,16,17,18,19,20 . Por lo general, las secuencias codificadoras de estas proteínas se insertaron al azar junto con los elementos de control de la transcripción necesarios en el genoma como transgenes, lo que se asocia con muchas complicaciones, incluida la naturaleza a corto plazo de la expresión del transgén. Nuestra demostración de que la recombinación homóloga puede producirse con gran eficacia en los cigotos de los cerdos abre la puerta al desarrollo de biorreactores cada vez mejores, así como de cepas de ganado con rasgos cada vez más deseables.