Hmisen albumiinin tuottaminen sioilla CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Human serum albumin (HSA) on plasman runsain proteiini, jolla on kriittisiä homeostaattisia tehtäviä ihmisen fysiologiassa, mukaan lukien plasman onkoottisen paineen ylläpitäminen, elimistön nesteiden jakautumisen säätely, pienten molekyylien kuljettaminen jne.1. Sitä määrätään useisiin vakaviin sairauksiin, kuten maksan vajaatoimintaan ja traumaattiseen sokkiin2. Koska ihmisverestä on pulaa ja ihmisveren käyttöön liittyy riskejä, ihmisalbumiinin vaihtoehtoista tuotantoa on etsitty jo pitkään. HSA:n rekombinanttituotantoa on aiemmin yritetty toteuttaa sioilla dominoivan siirtogeenin ilmentymisen avulla albumiini-GFP-fuusion muodossa3. Siirtogeenisissä menetelmissä rHSA:n erottaminen ja puhdistaminen on kuitenkin ongelmallista, koska sian endogeeninen albumiini on läsnä. Hyödyntämällä CRISPR/Cas9-järjestelmän tehoa genomin muokkauksessa pyrimme tuottamaan rHSA:ta sioille koputtamalla ihmisen albumiini-cDNA:ta sian albumiinilokukseen. Lisäämällä ihmisen ALB-cDNA:n ja SV40:n polyA-signaalisekvenssin (yhteensä 2368 bp) sian albumiinilokukseen välittömästi aloituskodonin alapuolelle odotamme ihmisen ALB:n ilmentyvän sian endogeenisen albumiinin transkriptionaalisen kontrollin alaisena ja samalla estävän sian endogeenisen albumiinin ilmentymisen (kuva 1a). Suunnittelimme sgRNA:n, joka kohdistuu aloituskodonin alueelle (välittömästi 5′:n päässä ATG:stä ja sisältäen ATG:n), ja tuotimme kohdistusfragmentin (homologisen rekombinaation luovuttaja), jossa inserttiä reunustavat 1 kb:n suuruiset homologiset sekvenssit molemmin puolin (kuva 1a). Koska luovuttajana käytetty 5′-homologinen sekvenssi ulottuu lähtökodoniin asti, se sisältää sgRNA-sekvenssin, joten sgRNA voidaan kohdistaa siihen luovuttajana tai knockin-alleeliin homologisen rekombinaation jälkeen. Tämän estämiseksi lisäsimme 6 bp (gccacc) sgRNA-sekvenssiin juuri ennen aloituskodonia. sgRNA transkriboitiin in vitro, puhdistettiin ja injektoitiin hedelmöittyneisiin munasoluihin yhdessä Cas9 mRNA4:n ja kohdistusfragmentin sisältävän kiertovektorin kanssa. Munasolujen lähteenä käytettiin Bama minipig5. Injektoituja alkioita kasvatettiin 1-2 tuntia ennen kuin ne istutettiin estrus-synkronoituihin naaraisiin. ~300 alkiota istutettiin 10 naaraaseen, joista viisi tuli tiineeksi ja synnytti yhteensä 16 elävää pentua. Pennut olivat tavanomaisessa hoidossa, eikä niillä ollut merkkejä epätavallisista terveysongelmista.
Miehen ALB:n kopinointi sian Alb-lokukseen.
(a) Kaavio knockin-strategiasta. (b) Perustajien genotyypitys. PRC-alukkeet on esitetty kuvassa (a). (c) Aloitinparilla e/f (a) saatujen PCR-tuotteiden sekvensointitulokset. Tuotteet kloonattiin ja enintään 12 kloonia (#9:lle) sekvensoitiin.
Leikkasimme 16 porsaan korvakärjet, kun ne olivat noin 4 viikon ikäisiä, ja saimme genomista DNA:ta genotyypitystä varten. Määrittääksemme, oliko knockin onnistunut, arvioimme insertiokohdan sekä 5′- että 3′-päätä. Käytimme kahta alukeparia, a/b ja c/d (kuva 1a). Alukkeet a on käytetyn homologian 5′-pään ulkopuolella ja b on ihmisen ALB:ssä (insertti); c on ihmisen ALB:ssä ja d homologian 3′-pään ulkopuolella. Kuten kuvasta 1b käy ilmi, kaikki 16 porsasta kantavat aiottua knockin-alleelia. Kloonasimme ja sekvensoimme kaikki monistetut DNA-fragmentit. Ne olivat odotettuja homologisia rekombinaatiotuotteita (kuva S1). Seuraavaksi määritimme villityyppisen alleelin tilan näissä porsaissa. Alukkeiden e ja f (jotka sisältyvät inserttiin) (kuva 1a) pitäisi monistaa 705 bp:n fragmentti villityyppilokuksesta ja 3085 bp:n fragmentti knockin-alleelista. Odotetusti kaikki ne tuottivat 3085 bp:n fragmentin. Yllättäen pystyimme kuitenkin saamaan näennäisen 705 bp:n villityyppifragmentin vain seitsemästä (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 ja 15) näytteestä 16:sta, ja loput tuottivat noin 700 bp:n heikkoja tuotteita (kuva 1b). Villityyppisen alleelin ilmeinen puuttuminen joistakin porsaista viittaa siihen, että knockin on saattanut kohdistua molempiin alleeleihin. Vaihtoehtoisesti villityyppistä alleelia on voitu muokata siten, että alukkeen a-sekvenssi on poistettu, jolloin villityyppistä alleelia ei pystytä monistamaan. Villiintyneen alleelin muokkaaminen tapahtui todellakin, koska monistettujen fragmenttien koko poikkesi ennustetusta 705 bp:stä joillakin porsailla (kuva 1b). Vahvistaaksemme tämän kloonasimme ja sekvensoimme kaikki monistetut fragmentit. Kuten kuvasta 1c käy ilmi, kaikki niistä olivat muokattuja, vaikka joissakin oli vain muutaman emäsparin muutos (joten ne näyttivät olevan 705 bp:n suuruisia). Näistä muokatuista alleeleista kiinnostavia ovat ne, jotka löytyivät porsaista nro 10 ja 12. Sian #10 tapauksessa 29 bp:n pituinen (ATG:stä 3′-päähän päin) sian sekvenssi korvattiin 36 bp:llä (6 bp 5′ ATG:stä ja 26 bp sen jälkeen) luovuttajasekvenssillä. On epäselvää, miten tämä tapahtui. Numerossa 12 on kaksi erilaista muokattua alleelia, joten alleelien kokonaismäärä on kolme, mikä viittaa mosaiikillisuuteen tässä porsaassa, mikä ei ole harvinaista, sillä mosaiikillisuutta on usein havaittu eläimissä, jotka on tuotettu injektoimalla Cas9/sgRNA:ta6,7,8,9,10 zygoottiin.
Määrittääksemme, oliko sgRNA:lla tapahtunut off-targetingia, valitsimme CRISPR-suunnittelutyökalun (http://tools.genome-engineering.org) ehdotusten perusteella neljä parasta potentiaalista off-targeting-kohdetta ja monistimme näitä kohtia sisältäviä fragmentteja porsaan nro 14 korvakärjen genomisesta DNA:sta. Fragmenteille tehtiin T4EN I -testi4. Kuten kuvasta S2 käy ilmi, kohteen ulkopuolista muokkausta ei havaittu. Emme kuitenkaan voineet sulkea pois sitä mahdollisuutta, että muissa lokuksissa tai muissa 15:ssä siirtogeenisessä possussa olisi tapahtunut off-target-editointia. Siitä huolimatta, vaikka kohteen ulkopuolinen muokkaus olisikin tapahtunut, muokatut lokukset eivät todennäköisesti ole ongelmallisia tarkoituksessamme tuottaa rHSA:ta, kunhan ne eivät vaikuta näiden siirtogeenisten sikojen hyvinvointiin.
Kun olimme osoittaneet, että ihmisen ALB:n knockin on onnistunut, halusimme selvittää, voitaisiinko ihmisen albumiinia havaita näiden knockin-porsaiden veriplasmassa. Kuten kuvasta 2a käy ilmi, kaikkien porsaiden veriplasmassa oli ihmisalbumiinia, joka oli havaittavissa ihmisalbumiinille spesifisillä vasta-aineilla, vaikkakin vaihtelevilla määrillä, mikä johtuu todennäköisesti ainakin kahdesta tekijästä, siitä, ovatko molemmat alleelit knockinoituja, ja mosaiikisuuden laajuudesta (erityisesti maksassa). Taso #7:ssä on hyvin alhainen, ja se on nähtävissä vasta, kun blottia on altistettu pitkään, vaikka villityyppinen sian Alb-alleeli ilmeisesti puuttuu (kuva 1a). Kaiken kaikkiaan tasot ovat paljon alhaisemmat kuin aikuisen ihmisen seerumissa. Tiedetään, että sikojen veren albumiinipitoisuus kasvaa iän myötä ja saavuttaa aikuisten ihmisten tasoa vastaavan tason kuuden kuukauden ikään mennessä11.
Ihmisen ALB:n analyysi veressä.
(a) Ihmisen albumiinipitoisuuden havaitseminen Western blot -näytteellä perustajaporsaiden verestä. Kunkin perustajan 0,5 μl plasmaa erotettiin SDS-PAGE:lla ja analysoitiin. Positiivisena kontrollina käytettiin ihmisen veriplasmaa (0,5 μl 30 kertaa laimennettuna). C, villityypin sian plasma. (b) Kuva massaspektrianalyysillä havaituista tryptisistä peptideistä (vihreä). (c) Kahden tryptisen peptidin puolikvantitointi ihmisen ja sian albumiinista mittaamalla kunkin peptidin piikin pinta-alat. Punaisella on merkitty ne aminohappojäännökset, jotka ovat spesifisiä sialle.
Vahvistaaksemme, että vasta-aineiden avulla knockin-porsaidemme plasmassa havaittu rHSA on todella ihmisen albumiinia, teetimme kahdesta plasmanäytteestä (porsaat nro 2 ja nro 6) massaspektrianalyysin. #Porsas nro 2 on ilmeisesti homotsygootti knockin-alleelin suhteen, ja porsas nro 6 sisältää yhden knockin- ja yhden mutanttialleelin (frameshift) (kuva 1). 0,5 μl plasmaa erotettiin SDS-PAGE:lla ja noin 70 KD:n proteiinit sulatettiin geelissä trypsiinillä. Tryptiset peptidit eluoitiin geelistä, kuivattiin ja liuotettiin uudelleen nestekromatografista erottelua ja massaspektrianalyysiä varten. Porsaasta nro 2 havaittiin 14 ainutlaatuista ihmisen ALB:n tryptistä peptidiä ja porsaasta nro 6 15 (kuva 2b). Ihmisen peptidin FKDLGEENFK ja sian peptidin FKDLGEQYFK (molemmat porsaasta nro 2) M/Z-spektrit esitetään kuvassa S3. Kaksi peptidiä valittiin kvantifioitavaksi mittaamalla piikkien pinta-alat. Western blot -tulosten kanssa sopusoinnussa nämä kaksi peptidiä olivat paljon runsaampia (~5 kertaa) porsas #2:ssa kuin porsas #6:ssa (kuva 2c). Nämä tulokset osoittavat, että vasta-aineilla havaittu rHSA on aitoa ihmisalbumiinia.
Korvanpäistä eristetyn DNA:n genotyypitys osoittaa, että sekä #2 että #6 eivät sisällä yhtään villityyppistä sian Alb-alleelia, joko sitä ei ole tai sitä on muokattu (kuvat 1b,c). Molemmista näytteistä pystyttiin kuitenkin edelleen havaitsemaan sian albumiinista peräisin olevia tryptisiä peptidejä, mutta paljon pienemmällä määrällä (kuva 2c). Mielenkiintoista on, että sian peptidien runsaus oli suunnilleen sama molemmissa näytteissä, vaikka ihmisen peptidien runsaus erosi suuresti. Nämä tulokset viittaavat siihen, että molemmissa porsaissa on samanlainen määrä villityyppisiä (tai heterotsygoottisia) hepatosyyttejä, jotka ovat vastuussa näiden kahden porsaan veressä havaitusta sian ALB:stä. Tällaisia villityyppistä alleelia sisältäviä soluja ei kuitenkaan välttämättä ole tai niitä on erittäin pieni prosenttiosuus korvakärjissä, joten villityyppistä alleelia ei voitu monistaa PCR:llä. Lisäksi Southern blot -analyysi, jossa käytettiin sisäistä koetinta (ihmisen ALB:n CDS:n 3′-puolisko), osoitti, että porsaissa nro 1, 4 ja 5 oli ylimääräinen luovuttajasekvenssin insertio (kuva S4). Kaikki nämä komplikaatiot eivät ole ongelma rekombinantti-ihmisen albumiinin tuottamisen kannalta, koska knockin-alleeli voidaan puhdistaa takaisinristeytyksellä.
Määrittääksemme, voiko knockin-alleeli periytyä seuraavaan sukupolveen, risteytimme porsas #2:n (uros, homotsygootti) ja #5:n (naaras, heterotsygootti) keskenään, kun ne tulivat lisääntymiskykyisiksi. Risteytyksestä syntyi 6 pentua. Niistä neljä (#1, 3, 4 ja 6) on homotsygoottisia knockin-alleelin suhteen (AlbH/H, H tarkoittaa ihmistä) ja kaksi (#2 ja 5) heterotsygoottisia (AlbP/H, P tarkoittaa sikaa) (kuva 3a). #5 ja 6 kuolivat ripuliin noin 2 viikkoa syntymän jälkeen. Analysoimme ihmisen albumiinin ilmentymistä jäljelle jääneiden porsaiden verestä 4 viikon iässä. Kuten kuvasta 3b käy ilmi, kaikkien niiden veressä oli ihmisalbumiinia. Mielenkiintoista oli, että heterotsygoottisen eläimen (nro 2) ihmisalbumiinin määrä oli paljon alhaisempi kuin homotsygoottien. Emme tiedä, johtuuko tämä yksilöllisestä vaihtelusta vai onko knockin-alleeli jotenkin tukahdutettu villityyppisellä alleelilla.
K knockin-alleelin perimän välityksellä tapahtuva periytyminen.
(a) F1-alkuisten jälkeläisten PCR-genotyypitys. Käytetyt alukkeet olivat samat kuin kuvassa 1. (b) Ihmisen albumiinin Western blot -määritys F1-possujen verestä. Kunkin porsaan 0,5 μl plasmaa erotettiin SDS-PAGE:lla ja analysoitiin. C, villityypin porsaan plasma. M, molekyylipainomarkkeri.
Esittelemme tässä sikojen onnistunutta sukupolvea sioista, jotka kantavat ihmisen ALB-cDNA:ta, joka on koputettu sian Alb-lokukseen. Tämä on askeleen pidemmällä kuin Hai ym.12 ja me13 olemme hiljattain raportoineet yksinkertaisesta geenieditoinnista sikojen zygooteissa. Suuria kotieläimiä on käytetty bioreaktoreina biolääketieteellisten proteiinituotteiden valmistukseen14,15,16,17,18,19,20. Yleensä näiden proteiinien koodaavat sekvenssit ja tarvittavat transkription ohjauselementit on lisätty genomiin satunnaisesti siirtogeeneinä, mihin liittyy monia komplikaatioita, kuten siirtogeenin ilmentymisen lyhytaikaisuus. Osoituksemme siitä, että homologinen rekombinaatio voi tapahtua erittäin tehokkaasti sian zygoteissa, avaa oven yhä parempien bioreaktoreiden sekä yhä enemmän toivottuja ominaisuuksia omaavien kotieläinkantojen kehittämiselle.