PMC
KESKUSTELU
DNA-synteesin mallisysteemi sisältää kaikki proteiinit, joita tarvitaan tukemaan DNA:n replikaatioprosessin jokaista vaihetta, ja näiden proteiinien koko vaihtelee nykyisissä määritysolosuhteissa 20-240 kDa:n välillä, ja ne pystyvät suorittamaan DNA:n replikaatioprosessin kaikki vaiheet in vitro. Tässä tutkimuksessa luonnehdittiin synteesiin liittyvää DNA-primaasiaktiivisuutta tutkimalla DNA-synteesin in vitro katalysoimaa RNA-alukkeiden synteesiä ja pidennystä. Toiminnallisten analyysien tulokset osoittavat, että rintasyöpäsoluista saadun P4-fraktion synteesiin liittyvä DNA-primaasiaktiivisuus on 30-kertainen rintasyöpäsolujen raakauutteisiin verrattuna. DNA-synteesiä sisältävä P4-fraktio johdettiin MCF7-soluista valmistetuista yhdistetyistä ydin- ja sytoplasman liukoisista proteiinifraktioista, ja sitä käytettiin SV40:n in vitro DNA:n replikaatiomäärityksen suorittamiseen. DNA-polymeraasi α:n ja δ:n sekä DNA-primaasin aktiivisuudet P4-fraktiossa ovat 20-40 kertaa suuremmat kuin raaoissa soluuutteissa ; mikä tekee siitä hyödyllisen välineen näissä tutkimuksissa, koska se on täysin pätevä tukemaan RNA-alukkeiden synteesiä ja pidennystä in vitro -mallijärjestelmässä, jonka on osoitettu tukevan DNA:n replikaatioprosessin kaikkia vaiheita .
DNA-primaasilla on ainutlaatuista prosessinomaisuutta RNA-alkukkeiden synteesissä ja pidennyksessä. Tämä prosessinomaisuus määritellään kilpailulla seuraavan oikean nukleotidin lisäämisen ja alukkeen ja mallin välisen kompleksin dissosioitumisen välillä . DNA-primaasi on ainoa entsyymi, joka kykenee syntetisoimaan RNA-alukkeita DNA-synteesin käynnistymisen aikana . Kumpikaan yksittäisistä primaasin alayksiköistä ei kykene syntetisoimaan tai pidentämään RNA-aluketta yksinään . Synteesi sisältää molemmat primaasin alayksiköt (eli p49 ja p58), ja se voi katalysoida RNA-alukkeiden synteesiä in vitro käyttäen eksogeenista poly(dT)-templaattia. Synteesisomi syntetisoi yksikköpituisen (7-10 nt) toiminnallisen RNA-alukkeen. RNaasi hydrolysoi nämä RNA-alukkeet kokonaan lyhyiksi 1-4 bp:n fragmenteiksi, mutta DNaasi ei hydrolysoi niitä. Synteesiin liittyvän primaasin tunnusomainen piirre, joka erottaa sen eristetystä DNA-primaasista, on sen erityinen kyky pidentää RNA-alkuaista DNA-primer-juosteeksi. DNA-primer-juosteen synteesi edellyttää DNA-primaasiaktiivisuuden lisäksi myös DNA-polymeraasiaktiivisuutta. DNA-polymeraasiaktiivisuus kytkeytyy tavallisesti aloittamaan RNA-alukkeen pidentämisen alukkeen synteesin jälkeen. Polymeraasi hyödyntää vain ≥7 nukleotidin pituisia RNA-alukkeita; dNTP-pitoisuudesta riippumatta . Siten yksikköpituisen RNA-alukkeen synteesiin ja pidentämiseen ei tarvita ainoastaan primaasia, vaan siihen osallistuu myös DNA-polymeraasin α-alayksikkö p180 , ja synteesissä on erittäin aktiivisia DNA-polymeraaseja, jotka katalysoivat deoksiribonukleotidien sisällyttämistä RNA-alukkeen pidentämiseksi. Synteesiin liittyvät polymeraasit pidentävät RNA-alukkeita 20-40 nt:n pituisesta DNA-RNA-oligoprimeristä (DNA-alukkeesta). DNA-primer-säikeet sisältävät kaksi komponenttia: (1) 10 nt:n pituinen ribonukleotidi ja (2) 20-40 nt:n pituinen deoksiribonukleotidi. RNaasi ja DNaasi hydrolysoivat erikseen DNA-primer-juosteiden sopivat komponentit, mikä johtaa DNA-primer-juosteen lyhenemiseen, mutta epätäydelliseen hydrolyysiin.
Synteesin toinen piirre on RNA-alukkeen ja DNA-primer-juosteen nopea synteesi ja erilainen koko. Synteesisomi katalysoi sekä RNA-alukkeen että DNA-primer-juosteen synteesin nopeasti, ja vakaan tilan tasot näyttävät kertyvän (5-15 minuutissa). DNA-synteesin katalysoiman yksikköpituisen RNA-alukkeen (7-10 nt) ja DNA-primer-juosteen (20-40 nt) koko pysyy aina vakiona riippumatta synteesin pitoisuudesta tai reaktioajasta. Tämä tutkimus DNA-primaasiaktiivisuuden mekanismista viittaa siihen, että synteesiin liittyvän primaasin katalysoima RNA-alukkeiden synteesi tapahtuu synteesiin liittyvän primaasin hitaan aloituksen, nopean polymerisaation ja ”älykkään” lopetuksen kautta . DNA-primaasi sitoutuu DNA-templaattiin ja aloittaa hitaasti dinukleotidin synteesin. Dinukleotidin synteesin jälkeen DNA-primaasin polymeroimaan dinukleotidiin lisätään nopeasti lisää NTP:tä. DNA-primaasin aktiivisuudelle on ominaista, että kukin RNA-alkuaine syntetisoidaan pikemminkin yhdessä ”purskeessa” kuin distributiivisen synteesin kautta. Kun 7-10 nt:n pituiset yksikköpituiset alukkeet on tuotettu, primaasi-malli toimii lopetussignaalina ja estää RNA-synteesin jatkamisen. Tämä inhibitio johtuu stabiilin primer-templaatin muodostumisesta, joka todennäköisesti pysyy yhteydessä pol α-primaasikompleksiin. Mielenkiintoista on, että DNA-synteesin in vitro syntetisoimat DNA-primer-juosteet ovat samankaltaisia kuin synteesin katalysoimat RNA-primer-juosteet, jotka syntetisoidaan in vitro. DNA-primer-juosteen synteesi saavuttaa vakaan tilan nopeasti, ja DNA-primer-juosteen koko pysyy suhteellisen vakiona (20 ja 40 nt:n välillä) riippumatta reaktioajasta tai synteesireaktion aikana käytetystä synteesisomin pitoisuudesta. DNA-primer-juosteen synteesi edellyttää DNA-polymeraasi α:n aktiivisuutta DNA-primaasin lisäksi. Tuloksemme viittaavat siihen, että synteesiin liittyvälle polymeraasi α -aktiivisuudelle on ominaista myös nopea polymerisaatio ja ”älykäs” lopetus DNA-primer-juosteen synteesissä. Synteesi, jolla on nopean polymerisaation ja älykkään DNA-primer-juosteen päättymisen ominaisuus, eroaa E. coli DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentin lääkitsemästä synteesistä RNA-alukkeen pidentämisen aikana. Toisin kuin synteesissä, polymeraasi I:n katalysoima RNA-alukkeen pidennys riippuu voimakkaasti reaktioajan pituudesta. Reaktioajan pidentäminen lisää merkittävästi pidennettyjen RNA-alukkeiden määrää ja kokoa.
Kahta mahdollista mekanismia on ehdotettu selittämään siirtymistä alukesynteesistä alukkeen pidentämiseen DNA:n replikaatioprosessin aikana . Ensimmäisessä ehdotetaan, että alukepolymeraasi-polymeraasikompleksi dissosioituu alukepohjasta ja assosioituu uudelleen polymeraasin aktiiviseen kohtaan. Toisessa ehdotetaan, että kytkentä tapahtuu pol α-primaasikompleksin siirtyessä säikeen sisällä primaasin aktiivisesta kohdasta polymeraasi α:n aktiiviseen kohtaan. Tähän kytkentään ei liity pol α-primaasikompleksin dissosioitumista DNA-mallista. Kokeemme osoittavat, että polymeraasi I:n katalysoima RNA-alukkeen pidennys estyy DNA-synteesin suurilla pitoisuuksilla. Klenow-fragmentin kyky pidentää RNA-aluketta riippuu synteesin katalysoimasta RNA-alukkeiden synteesistä, joka tarvitsee myös vapaan sitoutumiskohdan RNA-alukkeen päätepisteessä. Siksi E. coli-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti edellyttää primaasi-polymeraasi-kompleksin dissosioitumista alukesabluunasta. Suuret pitoisuudet synteesiä kilpailevat kuitenkin polymeraasi I:n kanssa sitoutumiskohdasta alukemallissa, joten RNA-alukkeen pidentyminen estyy. Synteesisomi muodostaa RNA-alukkeen päätepisteeseen umpikujaan johtavan kompleksin, minkä seurauksena Klenow-fragmentti ei pysty osallistumaan RNA-alukkeen pidennysprosessiin. Tämä tulos viittaa siihen, että DNA-synteesin polymeraasi-primaasikompleksin on dissosioitava alukesabluunasta RNA-alukkeen synteesin jälkeen. Tuloksemme osoittaa, että synteesisomi kasvattaa yksikköpituisen RNA-alukkeen kokoa, kun reaktiolämpötilaa alennetaan. Reaktiolämpötilan alentaminen lisää polymeraasi-primaasikompleksin kytkeytymisen tehokkuutta ja vähentää alukkeen ja templaatin denaturoitumista . Lisäksi DNA-primaasin p49-alayksikkö sisältää RNA-polymeraasin katalyyttistä aktiivisuutta, jota tarvitaan yksikköpituisen RNA-alukkeen koon kasvattamiseen . Näin ollen tuloksemme viittaavat siihen, että DNA-synteesillä on asianmukainen RNA-polymeraasiaktiivisuus, jota tarvitaan RNA-primaattisten DNA-fragmenttien muodostamiseen.
RNA-primaattorin initiaation ja elongaation kineettinen analyysi osoittaa, että synteesiin assosioitunut DNA-primaasi on hidas ja suhteellisen heikko entsyymi templaattiin sitoutumisen suhteen . DNA-primaasi on myös virhealtis nukleiinihappopolymeraasi, koska tällä entsyymillä on hyvin heikko nukleotidien erottelukyky, mikä johtaa nukleotidien virheelliseen sisällyttämiseen . Näin ollen synteesiin liittyvän DNA-primaasiaktiivisuuden entsymaattista kinetiikkaa koskevaa analyysiämme voitaisiin käyttää synteesinopeuksien ja virhetiheyksien suhteen määrittämiseen RNA-alukkeiden synteesin aikana. DNA-fragmenttien (Okazaki) epäjatkuva synteesi replikaatiohaarukan jäljessä olevalla säikeellä on tärkeä biokemiallinen prosessi DNA:n replikaation aikana. Jotta DNA-primaasi voisi varmistaa tehokkaan koordinoinnin DNA:n jatkuvan synteesin johtavan säikeen ja DNA:n epäjatkuvan synteesin jälkeenjääneen säikeen välillä, DNA-primaasi tarvitsee täsmällisesti ajoitetun sarjan entsymaattisia vaiheita, jotka kontrolloivat RNA-alukkeen synteesiä. Bakteriofagi T7:n moniproteiinisen replikaatiokompleksin kineettinen tutkimus osoittaa, että primaasi toimii molekyylijarruna ja pysäyttää ohimenevästi replikaatiohaarukan etenemisen. DNA-polymeraasi δ:n ja pol α:n fysikaalisen vuorovaikutuksen vuoksi Leen ym. esittämä tulos viittaa siihen, että DNA-primaasi voi estää johtavan säikeen synteesiä ylittämästä jäljessä olevan säikeen synteesiä jäljessä olevan säikeen hitaiden entsymaattisten vaiheiden aikana.
DNA-primaasin toimintaa tutkittaessa on käytetty erilaisia eukaryoottisia DNA:n replikaatiomalleja. Kokosolulysaatin ydinmatriisireplikaatiojärjestelmää on käytetty tutkimaan natiivin RNA-alkuaineen ja RNA-alkuisen nascent-dna:n synteesiä ja jakautumista eukaryoottisolujen ytimissä käyttäen endogeenista ydinmatriisiin sitoutunutta kaksijuosteista DNA-templaattia . RNA-alukkeet ovat tiukasti sidoksissa nopeasti lisääntyvien nisäkässolujen ydinmatriisiin . RNA-alukkeet kiinnittyvät kovalenttisesti vasta replikoituneeseen DNA:han muodostaen RNA-alustettua nasenttia DNA:ta. RNA-primoitu DNA hajoaa DNaasi-digestion jälkeen noin 10 nt:n pituisiksi oligoribonukleotideiksi , ja vähintään 94 % natiivista RNA-alukkeista ja RNA-primoidusta nascent-dna:sta sijaitsee ytimen liukenemattomassa matriisifraktiossa. Pituudeltaan 8-10 nt:n pituiset RNA-alukkeet, joita löytyy ydinmatriisiin liittyneenä, muodostavat <1 % solun kokonais-RNA:sta ; mikä tekee RNA-alukkeiden ja RNA-primoidun nascent-dna:n tutkimisen solun ydinmatriisifraktiossa hyvin vaikeaksi RNA-alukkeiden hyvin alhaisen konsentraation ja muiden RNA:iden suhteellisen suuren määrän vuoksi. Lisäksi RNA-alkuaineiden ja RNA:lla pohjustetun nascent DNA:n eristäminen radionukleotidimerkinnällä varustetuista kokosolulysaateista on monimutkainen ja ei-triviaali puhdistusmenetelmä, kun sitä sovelletaan ydinmatriisin replikaatiomallilla välitetyn RNA-alkuaineiden synteesin analysointiin. Sitä vastoin yhdistetyistä ydin- ja sytoplasmafraktioista puhdistettu DNA-synteesomi sisältää erittäin aktiivisia DNA-primaaseja ja DNA-polymeraaseja, ja se tukee täysin natiivien RNA-alkuaineiden synteesiä in vitro käyttäen kaksijuosteista SV40-alkuperää sisältävää DNA-mallia. DNA-synteesin syntetisoimat RNA-alukkeet ovat normaalin pituisia (10-20 nukleotidia) ja näyttävät toimivan asianmukaisesti DNA-polymeraasin alukkeen pidentämisen tukemiseksi. Nämä RNA-alukkeet voidaan helposti pidentää muodostaen 100-200 nt:n pituista RNA-alkuista nasenttia DNA:ta. DNA (Okazaki) -fragmenttien epäjatkuva synteesi replikaatiohaarukan jäljessä olevalla säikeellä on tärkeä biokemiallinen prosessi, joka liittyy DNA:n replikaatioon, ja DNA-synteesin syntetisoimat täyspitkät RNA-primoidut DNA (Okazaki) -fragmentit ovat myös pituudeltaan noin 100-200 nukleotidia. Havaitsimme, että DNA-syntetisomi voi syntetisoida erilaisia RNA-primed-tuotteita, joiden pituus vaihtelee 10 ja 200 nt:n välillä. Tätä voidaan pitää kohtuullisena, koska myös natiivit RNA-alukkeet ja RNA-alustettu nasentti-DNA ovat suunnilleen tämän pituisia. Edellä esitetty havainto, jonka mukaan DNA-synteesin katalysoima RNA-alukkeen ja RNA-primoidun nasentti-DNA:n synteesi vastaa olennaisesti sitä, joka julkaistiin tutkimuksessa, jossa käytettiin kokosolulysaatin ydinmatriisireplikaatiomallia , viittaa siihen, että DNA-synteesimalli on erinomainen mallijärjestelmä, joka kykenee suorittamaan fysiologisesti merkittävän DNA-replikaatioprosessin in vitro.
DNA-synteesimalli on näin ollen ainutkertaisen arvokas työväline DNA-primaasien toiminnallisuuden tutkimisessa. DNA-synteesomilla toteutettu primaasin välittämä RNA-alukkeen synteesi ja pidennys sekä DNA-synteesin ja pidennyksen toteuttama synteesi ja pidennys muistuttavat läheisesti muiden soluvapaiden replikaatiomallien toteuttamaa synteesiä ja pidennystä. Synteesimalli tukee RNA-alukkeiden synteesiä ja pidentämistä in vitro käyttäen eksogeenisia yksijuosteisia DNA-malleja sekä ylikierrettyä kaksijuosteista DNA:ta, joka sisältää ehjän SV40-replikaatioalkuperän. Näin ollen DNA-synteesimalli kykenee täysin välittämään RNA-alukkeiden synteesiä ja pidentämistä in vitro, ja se voi helpottaa DNA-synteesin käynnistävien mekanismien jatkotutkimusta eukaryoottisoluissa. Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että synteesimalli tarjoaa ainutlaatuisen työkalun DNA-primaasin ja muiden replikaatioproteiinien vuorovaikutuksen tutkimiseen DNA:n replikaatioprosessin aikana.