Suoliston luumenin transmigroituneet neutrofiilit sitoutuvat ICAM-1 säätelemään epiteeliesteen ja neutrofiilien rekrytointia

ICAM-1 edistää PMN:n adheesiota ja liikkumista apikaalisella epiteelikalvolla tulehdusolosuhteissa

Kryptaabskessissa, kuten aktiivisessa IBD:ssä havaitaan, suoliston krypteihin tunkeutuvat PMN:t ovat usein läheisessä kosketuksessa apikaalisen (luminaalisen) epiteelin pinnan kanssa.14 PMN-IEC-vuorovaikutusten tutkimiseksi TEM:n myöhäisvaiheiden aikana mallinsimme PMN:n migraatiota suolen epiteelin poikki tulehdusolosuhteissa käyttämällä aiemmin kuvattua transwell-asennelmaa.19 PMN:n TEM fysiologisessa basolateraalisesta apikaaliseen suuntaan kontrolloidun tai interferoni-γ:llä (IFNγ) käsitellyn T84-IEC:n poikki indusoitiin lisäämällä siihen transsepiteliaalinen N-formyyli-Met-Leu-Phe-gradientti (fMLF, Nformyl-Met-Leu-Phe, fMLF-gradientti) (100 nM). T84 IEC:n altistaminen IFNγ:lle (100 U ml-1, 24 h) ei vaikuttanut merkittävästi IEC:n esteen toimintaan tai keskeisten liitosproteiinien JAM-A:n, Occludinin ja ZO-1:n ilmentymiseen ja subcellulaariseen lokalisaatioon (täydentävä kuva S1 verkossa). IFNγ-hoidolla ei ollut merkittävää vaikutusta TEM:n suorittaneiden PMN:ien määrään; se kuitenkin lisäsi merkittävästi apikaalisesti assosioituneiden PMN:ien määrää (8,7 ± 1,8 %:sta, käsittelemätön, 19,7 ± 1,9 %:iin, IFNγ, apikaalinen, kuva 1a). Yhdenmukaisesti tämän kasvun kanssa ei-migroituneiden PMN:ien (PMN:t ylemmässä kammiossa, basaalinen) määrä väheni merkittävästi (∼1,5-kertaisesti) IFNγ-hoidon jälkeen, mikä viittaa lisääntyneeseen migraationopeuteen (kuva 1a). PMN:n määrä epiteelin monokerroksessa (epith) ei muuttunut. Edustavat konfokaali-immunofluoresenssikuvat (kuva 1b, ylemmät paneelit) ja z-projektiot (alemmat paneelit) osoittavat apikaalisesti assosioituneet PMN:t sen jälkeen, kun ne ovat migroituneet IFNγ:llä stimuloidun, mutta ei kontrollin T84-monokerroksen läpi. Koska IFNγ:n on aiemmin osoitettu indusoivan ICAM-1:n ilmentymistä tulehtuneessa epiteelissä,27 oletimme, että tulehduksen aikana epiteelimonolikerrosten läpi vaeltavat PMN:t pysyvät kiinni apikaalikalvossa Mac-1- ja ICAM-1-riippuvaisten vuorovaikutusten kautta ja kykenevät näin ollen ICAM-1-riippuvaiseen liikkumiseen, kuten aiemmin on havaittu verisuonten endoteelissä24, 28 Aikaisemmat havainnot vahvistavat sen, että IFNγ-hoito (100 U ml-1, 24 h) indusoi voimakkaan, ajasta riippuvan ICAM-1-ekspression lisääntymisen (huipussaan 24 tuntia hoidon jälkeen, kuva 1c,d) T84 IEC:n apikaalikalvolla (kuva 1e). Tämä vaikutus oli spesifinen IFNγ:lle, sillä T84- ja SKCO15 IEC:n altistaminen tuumorinekroositekijä-α:lle (TNFα; 10 ng ml-1) ei indusoinut ICAM-1:n ilmentymistä (täydentävä kuva S2A,B). ICAM-1:n regulaatiota havaittiin myös aktiivista haavaista paksusuolen tulehdusta sairastavien potilaiden paksusuolen koepalojen kryptoepiteelissä verrattuna terveeseen limakalvoon (kuva 1f). ICAM-1- ja Mac-1-riippuvainen PMN-adheesio IEC:n apikaalisille kalvoille vahvistettiin lisäämällä joko anti-ICAM-1- tai anti-Mac-1-toimintaa estäviä vasta-aineita (Abs; 20 μg ml-1), jotka kumosivat IFNγ:n aiheuttaman PMN-adheesion lisääntymisen (lisäkuva S3A). Mielenkiintoista oli, että PMN:n Mac-1:n esto johti voimakkaampaan (>3-kertaiseen) PMN-adheesion vähenemiseen verrattuna ICAM-1:n estoon, mikä viittaa siihen, että Mac-1 sitoo ICAM-1:n lisäksi muita epiteelin pinnan ligandeja.

Kuva 1

Interferoni-γ:n (IFNγ) indusoima solujen välisen adheesiomolekyyli-1:n (ICAM-1) ilmentyminen edistää neutrofiilien (PMN) kiinnittymistä apikaaliseen epiteelikalvoon. (a) PMN stimuloitiin (100 nM N-formyyli-Met-Leu-Phe (fMLF)) siirtymään kontrolli- tai IFNγ-käsiteltyjen T84-suolen epiteelisolujen (IEC) läpi. Kvantifioitiin ei-migroituneet PMN:t (basaalinen), epiteelikerroksen sisällä olevat PMN:t (epith), IEC:n apikaaliseen kalvoon transsepiteliaalisen migraation (TEM) jälkeen assosioituneet PMN:t (apikaalinen) ja TEM:n suorittaneet PMN:t (TEM). (b) 1 tunnin TEM:n jälkeen IEC-monokerrokset kiinnitettiin ja värjättiin solujen ytimille (sininen) ja PMN Mac-1:lle (vihreä). Edustavat kuvat osoittavat PMN:n lisääntyneen apikaalisen kiinnittymisen sen jälkeen, kun se on siirtynyt IFNγ:llä käsiteltyjen T84 IEC:iden läpi. Palkki = 20 μm. Alimmat paneelit ovat sarjassa otettujen kuvien projektioita z-suunnassa. (c-f) Konfluentteja T84 IEC:itä käsiteltiin IFNγ:llä (100 U ml-1, 24 h) ICAM-1:n pintaekspression indusoimiseksi. (c) Edustava virtaussytometriakaavio ja (d) ICAM-1-ekspression kvantifiointi vasteena IFNγ-hoitoon. ICAM-1-ekspressio indusoitui ajasta riippuvaisesti ja saavutti huippunsa 24 tunnin kuluttua. (e) T84 IEC:t kiinnitettiin etanolissa ja leimattiin immunofluoresenssilla ICAM-1:n suhteen. Edustava kuva (z-projektio seitsemästä konfokaalisesta viipaleesta) osoittaa, että ICAM-1-ekspressio rajoittuu epiteelin apikaaliseen pintaan. (f) Tulehtumattomat ja tulehtuneet kudosleikkeet haavaista paksusuolentulehdusta sairastavan ihmispotilaan koepaloista värjättiin ICAM-1:n (vihreä) ja ytimien (Topro-3, sininen) osalta. Edustavat immunofluoresenssikuvat osoittavat ICAM-1:n ilmentymisen säätelyä tulehtuneessa kudoksessa (oikea paneeli) mutta ei normaalissa kudoksessa (vasen paneeli). Palkki = 50 μm. N=5 riippumatonta koetta kolmena kappaleena, **P<0.01, Studentin t-testin kaksoiskokeet (a), varianssianalyysi Newman-Keulsin moninkertaisella vertailutestillä (d).

PowerPoint-dia

Seuraavaksi tutkimme, osoittivatko apikaalisesti kiinnittyneet PMN:t epiteelin läpäisyn jälkeen apikaalista paikannusta. Vaihekontrastiaikamikroskopiaa käytettiin IEC:n apikaaliseen kalvoon kiinnittyneiden yksittäisten PMN:ien käyttäytymisen seuraamiseen ja kvantifiointiin. Ilman ulkoista ärsykettä PMN:t eivät juurikaan liikkuneet, mutta 59,3 ± 7,6 % apikaalisesti kiinnittyneistä PMN:istä sen jälkeen, kun ne olivat kulkeneet IEC:n läpi, käyttäytyivät erittäin liikkuvasti (kuva 2a), ja niiden keskimääräinen ryömintämatka oli 65,6 ± 6,2 μm (kuva 2b). TEM aiheutti Mac-1-ekspression voimakasta lisääntymistä PMN:n solupinnalla (kuva 2c), mikä on johdonmukaista sen roolin kanssa PMN:n ja IEC:n välisessä apikaalisessa vuorovaikutuksessa. Tärkeää on, että niiden PMN:ien määrä, jotka osoittivat apikaalista liikettä, lisääntyi merkittävästi, kun IEC:tä stimuloitiin IFNγ:llä ICAM-1:n säätelyn lisäämiseksi (88±3,6 %, IFNγ, vs. 59,3±7,6 %, käsittelemätön IEC). Näissä olosuhteissa PMN kulki huomattavasti pidempiä matkoja (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, käsittelemättömät IEC:t, kuva 2b) apikaalista epiteelikalvoa pitkin. ICAM-1:n rooli PMN:ien liikkumisen välittäjänä vahvistettiin lisäämällä IFNγ:n vaikutuksia estävä anti-ICAM-1-vasta-aine (Ab), joka vähensi sekä PMN:ien lukumäärää että PMN:ien kulkemien etäisyyksien pituutta (61,4 ± 7,8 % ja 73,6 ± 6,1 μm, kuva 2a,b). Mac-1:n estäminen poisti jäljelle jääneiden tarttuvien PMN:ien liikkumisen (kuva 2a ja lisäelokuvat S1 ja S2), mikä vahvistaa Mac-1:n yksinomaisen roolin tässä prosessissa. Mac-1:n eston vaikutuksia PMN:n liikkumiseen korostetaan edelleen time-lapse-kuvasekvensseissä (kuva 2d) ja kuuden edustavan PMN:n siirtymäradoilla (kuva 2e). PMN:n ryömintänopeudet vaihtelivat 3-7 μm min-1 välillä, eivätkä ne eronneet merkittävästi stimuloimattomilla ja IFNγ-stimuloiduilla IEC:llä (lisäkuva S3B).

Kuva 2

Apikaalisesti kiinnittyneillä neutrofiileillä (PMN) on solujenvälisestä adheesiomolekyylistä-1 (ICAM-1) ja Mac-1:stä riippuvainen liikkuminen. (a, b) Transepiteliaalisen migraation (TEM) jälkeen PMN:ien annettiin kiinnittyä apikaalisesti suoliston epiteelisoluihin (IEC), jotka kasvoivat transwellsin pohjakammiossa. Paikannusta osoittavien PMN:ien määrä (a) ja kuljettujen matkojen pituus (b) visualisoitiin ja kvantifioitiin asianmukaisen IgG-kontrollin tai anti-ICAM-1- ja Mac-1-toimintoa estävien vasta-aineiden (Abs; 20 μg ml-1) läsnäollessa tai puuttuessa käyttäen faasikontrastista time-lapse-mikroskopiaa (Zeiss, Axiovert-mikroskooppi) ja ImageJ-ohjelmistoa. (c) PMN ennen (yhtenäinen musta viiva) ja jälkeen TEM:n (katkoviiva) analysoitiin Mac-1-ekspression osalta virtaussytometrialla. Edustava virtausdiagrammi (n=4) osoittaa Mac-1:n voimakasta regulaatiota PMN:n pinnalla TEM:n jälkeen. Täytetty alue edustaa IgG-kontrollivärjäystä. (d) Kuvasekvenssi, jossa edustavat PMN:t liikkuvat T84 IEC:ssä ilman (ylemmät paneelit) ja Mac-1:tä estävän Ab:n läsnä ollessa (alemmat paneelit). *PMN:n alkuperäinen sijainti, valkoiset nuolet seuraavat PMN:n liikettä. Katkoviivat korostavat PMN:n kulkemaa reittiä 40 minuutin ajan. Palkki = 20 μm. (e) Kuuden edustavan PMN:n liikeradat (μm) kolmesta riippumattomasta kokeesta 40 minuutin ajanjakson aikana interferoni-γ (IFNγ) -stimuloitujen T84 IEC:iden apikaalisella pinnalla ilman (ylemmät paneelit) ja Mac-1:n salpaavan Ab:n läsnä ollessa (alemmat paneelit). n=4 riippumatonta koetta kaksoiskappaleina, **P<0.01, varianssianalyysi Newman-Keulsin moninkertaisella vertailutestillä (a,b).

PowerPoint-dia

PMN:n adheesio epiteelin apikaaliseen epiteelikalvoon heikentää epiteelin esteen toimintaa

Seuraavaksi tutkimme PMN:n vuorovaikutuksen vaikutuksia apikaalisesti ilmentyneiden epiteelin ligandien kanssa epiteelin esteen toimintaan. Näissä kokeissa PMN lisättiin apikaalisesti läpäisevillä alustoilla (0,4 μm:n huokoskoko, joka oli liian pieni PMN TEM:n sallimiseksi) viljeltyihin konfluentteihin T84 IEC:iin, ja TER, epiteelin esteen indeksinä, mitattiin 12 tunnin ajan määritellyissä olosuhteissa. 12 tunnin ajanjakso valittiin, jotta vältettäisiin apoptoottisten PMN:ien vaikutukset epiteeliesteeseen.29 fMLF:n (100 nM) stimuloima PMN:ien adheesio T84 IEC:iin aiheutti ajasta riippuvan TER:n laskun 12 tunnin aikana (∼60 %, kuva 3a). Tärkeää on, että PMN:n lisääminen IFNγ:llä esikäsiteltyjen T84 IEC:iden apikaaliseen kalvoon, jonka olemme osoittaneet johtavan tehostuneeseen ICAM-1-riippuvaiseen PMN-adheesioon (kuva 1a), johti TER:n pienenemiseen entisestään (∼40 % ensimmäisten 2 tunnin aikana ja ∼90 % 12 tunnin aikana). Pelkällä IFNγ-hoidolla ei ollut vaikutusta TER:ään. Testataksemme, johtuiko havaittu epiteelin läpäisevyyden lisääntyminen epiteelisolujen ja PMN:n välisestä suorasta kontaktista, käytimme anti-Mac-1:tä estävää Ab:tä (CBRM1/29, 20 μg ml-1) estämään PMN:n adheesiota IFNγ-stimuloituihin IEC-soluihin. Mac-1:n esto vaimensi merkittävästi PMN:n aiheuttamaa TER:n laskua IFNγ-stimulaation jälkeen (kuva 3a). Tärkeää on, että erillisissä kokeissa vahvistimme edelleen, että PMN:n aiheuttama TER:n lasku sekä stimuloimattomissa että IFNγ:llä käsitellyissä epiteelimonolaareissa riippui PMN:n ja apikaalisen epiteelikalvon välisestä suorasta kontaktista eikä välittynyt parakriinisten mekanismien kautta. Tällaisissa kokeissa PMN:t lisättiin transwells-kuoppien alempaan kammioon, joka sisälsi käänteisiä (apikaalinen puoli alaspäin) T84-monikerroksia, ja niitä stimuloitiin fMLF:llä (100 nM). Näissä olosuhteissa PMN:llä ei ollut vaikutusta epiteeliesteeseen TER:llä arvioituna (kuva 3b). Epiteelimonolaarien altistaminen 100 nM fMLF:lle 12 tunnin ajan ei vaikuttanut merkittävästi TER:ään.

Kuva 3

Neutrofiilien (PMN) vuorovaikutus apikaalisen epiteelikalvon kanssa heikentää esteen toimintaa. (a) PMN (2,5 × 105 solua) tuotiin käsittelemättömien (kontrolli) tai interferoni-γ:llä (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h) käsiteltyjen T84-suoliepiteelisolujen (IEC) apikaalipinnalle, joita kasvatettiin läpäisevillä alustoilla (0.4 μm suodatinkoko, estävät PMN:n transsepiteliaalisen migraation (TEM)), N-formyyli-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM) läsnäollessa tai poissaollessa ja anti-Mac-1:n inhiboivan vasta-aineen (Ab; 20 μg ml-1) läsnäollessa tai poissaollessa. Tuloksena olevat muutokset TER:ssä epiteelin esteen toiminnan indeksinä mitattiin ilmoitettuina ajankohtina. PMN-kontakti apikaalisen epiteelin pinnan kanssa johti ajasta riippuvaan TER:n pienenemiseen, joka kumoutui osittain PMN:n ja epiteelisolujen vuorovaikutuksen estämisellä. N=4 riippumatonta koetta kolmena kappaleena, *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001 eroaa merkitsevästi kontrolli+fMLF+PMN:stä, ^^^^P<0,001 eroaa merkitsevästi, varianssianalyysi Newman-Keulsin moninkertaisen vertailun testillä. (b) PMN:iä lisättiin stimuloimattomien (kontrolli) tai IFNγ-käsiteltyjen IEC:iden (IFNγ+PMN+fMLF) apikaalisen kalvon läheisyyteen ilman suoraa kosketusta (transwell-asetelman alempi kammio) fMLF-stimulaation (100 nM) läsnä ollessa tai ilman sitä. TER:ssä ei havaittu muutoksia, mikä viittaa kontaktista riippuviin vaikutuksiin. N=4 riippumatonta koetta kolmena kappaleena.

PowerPoint-dia

Epiteelin ICAM-1:n migraatio laukaisee MLCK-riippuvaisen suoliston epiteelin läpäisevyyden lisääntymisen

Havaitsimme, että ICAM-1:n apikaalinen kohoaminen voimisti merkittävästi Mac-1-riippuvaisen PMN-adheesion vaikutuksia epiteeliesteeseen (kuva 3a). Näin ollen oletimme, että PMN:n aiheuttama IFNγ:llä käsiteltyjen epiteelimonolikerrosten läpäisevyyden lisääntyminen johtui PMN:n kontaktin välityksellä tapahtuvasta ICAM-1:n klusteroitumisesta ja ICAM-1:stä riippuvaisten signalointitapahtumien induktiosta, kuten aiemmin on kuvattu verisuonten endoteelissa.30, 31 Läpäisevillä alustoilla olevia T84 IEC -monolikerroksia käsiteltiin IFNγ:llä ICAM-1:n ilmentymisen indusoimiseksi, minkä jälkeen niihin lisättiin ristisilloittavia Abs:iä ICAM-1:n kanssa. Vahvistimme, että Ab-välitteinen ristisilloitus indusoi ICAM-1:n klusteroitumista (lisäkuva S2C). Kuten kuvasta 4a käy ilmi, ICAM-1:n Ab-välitteinen ristisilloittaminen johti ajasta riippuvaan TER:n vähenemiseen, mikä korreloi fluoresiini-isotiosyanaatti (FITC)-dekstraanin (3 kDa, kuva 4b) lisääntyneen parasellulaarisen virtauksen kanssa. Tämä vaikutus oli spesifinen ICAM-1:lle, sillä muiden epiteelin pintamolekyylien, päähistokompatibiliteettikompleksi-1:n (MHC-1; kuva 4) ja tunnetun PMN-ligandin, CD55:n, ristisilloittamisella ei ollut merkittävää vaikutusta läpäisevyyteen (lisäkuva S5). Koska ICAM-1-ekspressiota ei esiinny stimuloimattomissa T84 IEC:ssä, ristisilloitusabs:n levittäminen näiden IEC:iden apikaalipinnalle ilman IFNγ-stimulaatiota ei vaikuttanut TER:ään (lisäkuva S4A). Vastaavasti IFNγ:n indusoiman ICAM-1:n lokalisoitumisen kanssa sopusoinnussa epiteelin apikaalisella kalvolla ristisilloittavien Abs:ien levittämisellä epiteelimonolikerrosten basolateraaliselle puolelle ei ollut merkittävää vaikutusta esteen toimintaan (Täydentävä kuva S4B).

Kuva 4

Antivasta-aineen (Ab) välittämä solujen välisen adheesiomolekyylin-1 (ICAM-1) ristisilloittuminen johtaa myosiinin kevytketjukinaasista (MLCK) riippuvaiseen epiteelin läpäisevyyden lisääntymiseen. Läpäisevillä alustoilla kasvatettuja T84-suolen epiteelisoluja (IEC) stimuloitiin interferoni-γ:llä (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h) ICAM-1:n ilmentymisen indusoimiseksi. ICAM-1 tai kontrollipintaproteiini päähistokompatibiliteettikompleksi-1 (MHC-1) ristisilloitettiin inkuboimalla primäärisellä Ab:llä (20 μg ml-1, 60 min) ja sen jälkeen sopivilla sekundäärisillä vasta-aineilla (20 μg ml-1, 30 min). TER (a) ja fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC)-dekstraanin (3 kDa) (b) virtaus T84-monokerrosten läpi ennen ja jälkeen ICAM-1:n ristisilloittamisen kvantifioitiin ilmoitettuina ajankohtina epiteelin läpäisevyyden indeksinä. MLCK:n farmakologinen estäjä ML-7 (20 μM) annettiin tunti ennen ristisilloitusprotokollien aloittamista. ICAM-1:n ligointi johti TER:n vähenemiseen ja FITC-dekstranin virtauksen lisääntymiseen, ja se oli riippuvainen MLCK:n fosforylaatiosta. (c) Edustavat western-blottaukset ja densitometrinen analyysi (ImageJ:n avulla) osoittavat lisääntyneen MLCK-fosforylaation ICAM-1-ristikytkennän jälkeen, mikä kumoutui ML-7:n lisäyksellä. (d) Konfokaalimikroskopiaa ja immunofluoresenssimerkintää käytettiin aktiinin uudelleenmuodostuksen tutkimiseen apikaalisesti ilmentyneen kontrollireseptorin MHC-1:n ja erityisesti ICAM-1:n ristisilloittamisen jälkeen ML-7:n (20 μM) läsnä ollessa tai ilman sitä. ICAM-1:n mutta ei MHC-1:n Ab-välitteinen ristisidonta johti apikaalisen harjasrajan ja liitosaktiinin vähenemiseen. Tämä vaikutus kumoutui ML-7:n läsnäollessa. Palkki = 50 μm. N=4 riippumatonta koetta kolmena kappaleena (a,b), *P<0.05, **P<0.01 eroaa merkitsevästi kontrollista (a), **P<0.01, ***P<0.01, n.s. ei merkitsevä, (b,c), varianssianalyysi Newman-Keulsin moninkertaisen vertailun testillä.

PowerPoint-dia

Olemme aiemmin osoittaneet, että PMN:n TEM:n varhaiset tapahtumat (basolateraalisen epiteelikalvon tasolla) laukaisevat MLCK:n välittämän TER:n vähenemisen.9 MLCK:lla on osoitettu olevan keskeinen rooli epiteelin läpäisevyyden säätelyssä säätelemällä perijunktionaalisen aktomyosiinirenkaan supistumista myosiini II:n säätelevän kevytketjun fosforylaation kautta.32 Kysyimme siksi, oliko lisääntynyt IEC:n läpäisevyys apikaalisesti ekspressoidun ICAM-1:n ligaation jälkeen MLCK:sta riippuvainen. ICAM-1:n Ab-välitteinen ristisidonta johti todellakin MLCK:n fosforylaatioon (Tyr 464), mikä oli yhdenmukaista MLCK:n aktivoitumisen kanssa (kuva 4c). Tällaiseen aktivoitumiseen liittyi apikaalisen harjanvarren ja perijunktionaalisen F-aktiinin väheneminen (kuva 4d), mikä viittaa aktiinisytoskeletonin uudelleenorganisoitumiseen. Tärkeää on, että ICAM-1-ligatoinnin aiheuttaman MLCK-fosforylaation estäminen T84-soluissa ML-7:llä (20 μM,33 Täydentävä kuva S4C) esti ICAM-1:n aiheuttaman F-aktiini-reorganisoitumisen (kuva 4d), TER:n vähenemisen (kuva 4a) ja parasellulaarisen dekstraanivirtauksen kasvun (kuva 4b). Pelkällä ML-7-hoidolla (20 μM) ei ollut vaikutusta TER:ään. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että tulehdusolosuhteissa PMN-kontakti kryptan epiteelisolujen apikaaliseen pintaan käynnistää ICAM-1-riippuvaisia signaalitapahtumia, jotka johtavat lisääntyneeseen läpäisevyyteen.

ICAM-1:n kiinnittyminen apikaaliseen epiteelikalvoon helpottaa PMN:n tehostettua TEM:ää

Koska apikaalisesti ilmentyvän ICAM-1:n ligoiminen lisäsi epiteelin läpäisevyyttä, teimme kokeita tutkiaksemme, johtaisivatko ICAM-1:stä riippuvaiset muutokset epiteelin esteen toiminnassa tehostuneeseen PMN:n TEM:ään. Tutkimme ensin, vaikuttaako PMN:n sitoutuminen ICAM-1:een IEC:n apikaalisella kalvolla PMN:n TEM:ään fysiologisesti merkityksellisessä basolateraalisesta apikaaliseen suunnassa.34 Näissä kokeissa PMN:t stimuloitiin vaeltamaan epiteelimonokerrosten läpi, ja siirtyneet solut kerättiin talteen, ja ne levitettiin uudestaan 1 h:n ajaksi uusien epiteelimonokerrosten apikaaliselle pinnalle (2,5 × 105 PMN:aa monokerrosta kohti) IFNγ:n esikäsittelyn kera tai sitä ilman. Kun PMN:n ja epiteelin välinen kontakti oli kestänyt 1 tunnin, monokerrokset pestiin puhtaiksi tarttuneista PMN:istä ja niitä käytettiin seuraaviin PMN:n TEM-testeihin basolateraalisesta apikaaliseen suuntaan. PMN:n tuominen apikaalisesti IFNγ-käsiteltyihin mutta ei käsittelemättömiin epiteelimonolayereihin aiheutti PMN:n TEM:n merkittävän lisääntymisen (1,7-kertaiseksi, kuva 5a). Pelkällä IFNγ-käsittelyllä tai PMN:n läsnäololla lähellä apikaalista pintaa, mutta ilman suoraa kosketusta monolayereihin, ei ollut vaikutusta PMN:n TEM:ään (kuva 5a). Rinnakkaisissa kokeissa PMN:n TEM tutkittiin ICAM-1:n spesifisen Ab-välitteisen ristisidonnan jälkeen. ICAM-1:n ristisilloittamisen vaikutuksen kanssa IEC:n esteen toimintaan sopusoinnussa ICAM-1:n Ab-välitteinen ristisilloittaminen IFNγ:llä käsitellyissä T84 IEC:ssä lisäsi merkittävästi PMN:n TEM:ää (1,9±kertaisesti, kuva 5b) verrattuna apikaalisesti ekspressoituneen kontrollimolekyylin, MHC-1:n, ristisilloittamiseen. Odotetusti ICAM-1:n ristisilloitusprotokollien soveltaminen käsittelemättömiin IEC-monolayereihin ei vaikuttanut merkittävästi PMN TEM:ään. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että IEC:n apikaaliseen (luminaaliseen) kalvoon ICAM-1:n sitoutumisen kautta kiinnittyvät PMN:t voivat aiheuttaa muutoksia epiteelin esteen toiminnassa ja vaikuttaa PMN:ien rekrytoinnin säätelyyn.

Kuva 5

Apikaalisesti ilmentyvän solunulkoisen adheesiomolekyyli-1:n (ICAM-1) sitoutuminen indusoi myosiinin kevytketjuisen kinaasin (MLCK) aiheuttaman neutrofiilien (PMN) transsepiteliaalisen migraation (TEM) lisääntymisen. PMN:n TEM basolateraalisesta apikaaliseen suuntaan käsittelemättömien (kontrolli) tai interferoni-γ:llä (IFNγ) käsiteltyjen (ICAM-1:n ilmentymisen indusoimiseksi) T84-monikerrosten läpi indusoitiin N-formyyli-Met-Leu-Phe (fMLF) -gradientilla (100 nM). (a) Transmigroituneet PMN:t kerättiin ja lisättiin uusien T84-monikerrosten apikaalipuolelle fMLF:n (100 nM) läsnä ollessa tai lisättiin transwells-kuoppien pohjakammioihin, jotka olivat apikaalikalvoa vasten, mutta ilman suoraa kosketusta monikerroksiin (2,5 × 105 PMN kuoppaa kohti, 1 h). Kun apikaalisesti kiinnittyneet PMN:t oli pesty pois, myöhempi PMN TEM kvantifioitiin. PMN:n apikaaliset vuorovaikutukset erityisesti IFNγ-käsiteltyjen T84-suolen epiteelisolujen (IEC) kanssa lisäsivät merkittävästi PMN:n TEM:ää. Tämä vaikutus kumoutui anti-Mac-1:tä estävän vasta-aineen (Ab; 20 μg ml-1) läsnäollessa. Kaikissa olosuhteissa määritettiin niiden PMN:ien lukumäärä, jotka jäivät kiinni apikaaliseen epiteelikalvoon pesujen jälkeen, ja vähennettiin siirtyneiden PMN:ien kokonaismäärästä. (b) PMN TEM ICAM-1:n tai kontrolliproteiinin (päähistokompatibiliteettikompleksi-1 (MHC-1)) Ab-välitteisen ristisidonnan jälkeen määriteltiin määrällisesti. ICAM-1:n mutta ei MHC-1:n ristisilloittaminen IFNγ:llä käsitellyissä T84-soluissa lisäsi merkittävästi PMN TEM:ää. (c) Kontrolli- ja IFNγ-käsiteltyjä T84-monikerroksia esi-inkuboitiin ML-7:llä (MLCK:n estäjä, 20 μM) tai Blebbistatinilla (myosiinimoottori II:n estäjä, 10 μm) yksinään tai ICAM-1:n ristisilloittamisen jälkeen. Näiden inhibiittoreiden vaikutukset ICAM-1-ristikytkennän aiheuttamaan PMN TEM:n lisääntymiseen kvantifioitiin. Molemmat inhibiittorit estivät ICAM-1-ristikytkennän aiheuttaman PMN TEM:n lisääntymisen. Kaikissa paneeleissa tiedot on esitetty moninkertaisena lisäyksenä verrattuna PMN TEM:ään stimuloimattomissa T84 IEC:ssä. N=4 riippumatonta koetta kolmena kappaleena, *P<0.05, **P<0.01, n.s. ei merkitsevä, varianssianalyysi Newman-Keulsin moninkertaisen vertailun testillä.

PowerPoint-dia

ICAM-1:n ristisilloittaminen johti MLCK:n aktivoitumiseen, mikä viittaa aktiini-myosiinisupistukseen (Kuva 4). Niinpä tutkimme seuraavaksi MLCK:n eston ja F-aktiinin supistumisvoimien eston vaikutuksia PMN:n TEM:ään ICAM-1-ristikytkennän jälkeen. ICAM-1-ristikytkennän aiheuttama PMN:n TEM:n lisääntyminen kumoutui, kun IEC:tä esikäsiteltiin joko MLCK:n estäjällä ML-7:llä (20 μM, 1 h33) tai myosiinimoottori II:n estäjällä Blebbistatiinilla (10 μM, 1 h,35 Kuva 5c). Nämä havainnot viittaavat siihen, että aktomyosiinisupistuksella on ICAM-1:n jälkeinen rooli PMN TEM:n säätelyssä. Käsittely ML-7:llä tai Blebbistatiinilla yksinään ei vaikuttanut PMN:n TEM:ään (kuva 5c).

Ab-välitteinen ICAM-1:n ligointi hiiren suolen luumenissa johtaa MLCK-riippuvaiseen epiteelin läpäisevyyden lisääntymiseen ja PMN:n lisääntyneeseen rekrytoitumiseen

Toteutimme seuraavaksi in-vivo-kokeita tutkiaksemme ICAM-1:n ligoimisen vaikutuksen suoliston epiteelin estotoimintaan ja PMN:n rekrytoitumiseen hiiren suolen silmukkamallilla (kuva 6b). Tässä mallissa arvioitiin ohutsuolen ehjien, verta läpäisevien segmenttien läpäisevyyttä sen jälkeen, kun suolen luumeniin oli lisätty FITC-dekstraania. Kuten kuvassa 6a on esitetty, vaikka ICAM-1:tä ei havaittu stimuloimattomassa epiteelissä (ylempi paneeli), IFNγ:n ja TNFα:n (500 ng, 24 h) antaminen vatsakalvon sisällä (i.p.) johti ICAM-1:n ilmentymisen voimakkaaseen induktioon. Erityisesti indusoitunut ICAM-1 lokalisoitui Claudin-2:n yläpuolelle hiiren kryptan IEC:n apikaalisille alueille (kuva 6a, alempi paneeli). Samanaikaisesti havaitsimme, että sytokiinikäsittely johti ∼2-kertaiseen 3 kDa:n FITC-dekstraanin läpäisevyyden lisääntymiseen (kuva 6c).

Kuva 6

Solujen välisen adheesiomolekyyli-1:n (ICAM-1) kytkeytyminen hiiren suolistossa in vivo johtaa myosiinin kevytketjukinaasi (MLCK) -riippuvaiseen suolen läpäisevyyden lisääntymiseen. ICAM-1:n ilmentymisen indusoimiseksi hiirille ruiskutettiin interferoni-γ:n (IFNγ) ja tuumorinekroositekijä-α:n (TNFα; 500 ng kumpikin, 24 h, intraperitoneaalisesti (i.p.)) seosta. (a) Hiiren suolen OCT-pakastetut segmentit leikattiin (7 μm leveinä) ja värjättiin immunofluoresenssivärjäyksellä ICAM-1:n (vihreä) ja tiukan liitoksen proteiinin Claudin-2:n (punainen) suhteen. Edustavat konfokaalikuvat osoittavat ICAM-1-ekspression apikaalisen induktion (valkoinen nuoli) IFNγ/TNFα-käsittelyn jälkeen (alapaneeli) verrattuna aktivoimattomaan kudokseen (yläpaneeli). Palkki = 50 μm. (b) Sarjakuva kuvaa hiiren suolistosilmukkamallia menetelmissä kuvatulla tavalla. (c) Suoliston epiteelin läpäisevyys mitattiin in vivo määritellyissä olosuhteissa menetelmissä kuvatulla tavalla. ICAM-1-häntäpeptidiä (100 μm ml-1) annettiin luminaalisesti 30 minuuttia ennen ICAM-1-ristikytkentäprotokollia. MLCK:n estäjä ML-7 (20 μM) annettiin i.p.-injektiona 2,5 tuntia ennen ICAM-1-ristikytkentää. Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC)-dekstraanivirtauksen lisääntyminen ICAM-1:n vasta-aineen (Ab) ristisilloittamisen jälkeen estettiin sekä ICAM-1:n pyrstöpeptidin lisäyksellä että esikäsittelyllä ML-7:llä. N=4 hiirtä olosuhdetta kohti, *P<0.05, varianssianalyysi Newman-Keulsin monivertailutestillä.

PowerPoint-dia

Tärkeää on, että ICAM-ristikytkentä-Abs:n, mutta ei kontrolliproteiinin Abs:n, MHC-1:n, tuominen sytokiinistimuloitujen suolistosilmukoiden luumeniin aiheutti vielä ∼1,5-kertaisen lisäyksen läpäisevyydessä dekstraanille verrattuna pelkkään sytokiinikäsittelyyn (kuva 6c). Vahvistaaksemme, että suolen epiteelin läpäisevyyden lisääntyminen johtui nimenomaan epiteelin ICAM-1:n aiheuttamista signaalitapahtumista, käytimme ICAM-1:n sytoplasmisesta domeenista peräisin olevia peptidejä (ICAM-1-peptidi) estämään ICAM-1:n kykyä välittää myöhemmän vaiheen signaalitapahtumia. Aiemmin on osoitettu verisuonten endoteelissa, että ICAM-1, mutta ei kontrollipeptidi, esti ICAM-1:n ja kohdeproteiinien väliset vuorovaikutukset ja esti siten ICAM-1:stä riippuvaisen signaloinnin vaikuttamatta sitoutumiseen solunulkoisiin leukosyyttien ligandeihin.22, 24 ICAM-1:n, mutta ei kontrollipeptidin, lisääminen (100 μg ml-1, 30 min) esti ICAM-1:n ligaation aiheuttaman suolen läpäisevyyden lisääntymisen (kuva 6c). Suolistosilmukoihin (stimuloimattomiin ja IFNγ/TNFα-aktivoinnin jälkeen) intraluminaalisesti syötettyjen Abs:ien vahvistettiin olevan epiteelin läpäisemättömiä, mikä sulkee pois lamina propria -solujen mahdollisen epäsuoran osuuden havaittuihin vaikutuksiin (lisäkuva S6).

Tukena MLCK:n roolille ICAM-1:n välittämässä signaalinvälityksessä MLCK:n aktivaation estäminen ML-7:llä (1 mg kg-1, i.p.36) ennen ICAM-1-ristikytkentää esti läpäisevyyden lisääntymisen (kuva 6c). Nämä tiedot osoittavat, että suolen epiteelin lisääntynyt läpäisevyys in vivo ICAM-1:n ligaation jälkeen on MLCK:sta riippuvainen.

Koska lisääntynyt epiteelin läpäisevyys liittyy PMN:n lisääntyneeseen migraatioon, kysyimme, johtaisiko ICAM-1:n ligaatio PMN:n lisääntyneeseen rekrytointiin in vivo. Käyttämällä hiiren suolen silmukkamallia PMN-infiltraatio suolen limakalvoon ja migraatio luumeniin indusoitiin antamalla luminaalisesti kemoattraktanttia CXCL1:tä (1 μM 200 μl:ssa Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS)+) ja kvantifioitiin immunofluoresenssimerkinnällä / konfokaalisella mikroskopialla ja analysoimalla huuhdeltua nestettä, joka valmistettiin sytospineille ja värjättiin Diff-Quik- väriaineella, vastaavasti. Ilman kemoattraktanttia PMN:iä ei havaittu suolen epiteelissä tai suolen luumenissa (ei esitetty); CXCL1:n luminaalinen anto käynnisti kuitenkin merkittävän PMN:n siirtymisen epiteelikerrokseen (kuva 7a) ja kertymisen suolen luumeniin (kuva 7c). Johdonmukaisesti sytokiinien aiheuttaman läpäisevyyden lisääntymisen kanssa IFNγ/TNFα-hoito lisäsi ∼2,2-kertaisesti PMN:n määrää suolen epiteelissä ja ∼1,7-kertaisesti lumenissa. Tärkeää on, että ICAM-1 crosslinking Abs:n lisääminen sytokiinikäsiteltyjen suolistosilmukoiden luumeniin lisäsi entisestään (pelkkään sytokiinikäsittelyyn verrattuna) PMN:n määrää sekä epiteelissä (∼1,6-kertaisesti, kuva 7a,b) että luumenissa (∼1,4-kertaisesti, kuva 7c,d). Suolen epiteeliin (punainen) tunkeutuvat PMN:t (vihreä) näkyvät edustavissa kuvissa kudosleikkeistä, jotka on otettu sytokiini-aktivoiduista suolen silmukoista ICAM-1-ligatoinnin jälkeen (kuva 7b). Vastaavasti PMN:t, jotka vaelsivat luumeniin ICAM-1-ligatoinnin jälkeen, näkyvät edustavissa kuvissa suolen silmukoiden huuhtelunesteistä (kuva 7d).

Kuva 7

Solujen välisen adheesiomolekyylin-1 (ICAM-1) sitoutuminen hiiren suolistossa in vivo johtaa myosiinikevytketjun kinaasista (MLCK) riippuvaiseen neutrofiilien (PMN) rekrytoitumisen lisääntymiseen. PMN:n transsepiteliaalinen migraatio (TEM) hiiren suolistosilmukkamallissa indusoitiin CXCL1:n (1 μM 200 μl:ssa Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS)+) lumeen. (a) PMN limakalvon epiteelissä kvantifioitiin suolistosilmukan kryoleikkauksista, jotka oli immunofluoresenssilla merkitty PMN:n (vihreä) ja F-aktiinin (punainen) suhteen. (b) Edustavat kuvat osoittavat voimakasta PMN-infiltraatiota ICAM-1:n ristisilloituksen jälkeen (oikeanpuoleinen paneeli) verrattuna suolistokudokseen, johon ei ole lisätty CXCL1:tä, jossa PMN:t ovat paikallistuneet verisuonten sisälle (valkoinen nuoli). Palkki = 50 μm. (c) Lumeniin siirtyneet PMN:t eristettiin huuhtelemalla ja kvantifioitiin Diff-Quikilla värjätyistä sytospineista. Tiedot esitetään prosentteina huuhtelunesteen kaikista soluista. (d) Sytospiinien edustavat kuvat kuvaavat siirtyneitä PMN:iä suolen lumenin huuhtelunesteessä ICAM-1:n ristisidonnan jälkeen (oikea paneeli, PMN:t on merkitty valkoisilla nuolilla). PMN:iä ei havaita suolen lumenissa ilman kemoattraktorin lisäämistä (vasen paneeli). Palkki = 10 μm. N=4 hiirtä per ehto, *P<0.05, varianssianalyysi Newman-Keulsin moninkertaisella vertailutestillä.

PowerPoint-dia

Yhtäpitävästi ICAM-1-ligatoinnin aiheuttaman epiteelin läpäisevyyden lisääntymisen kanssa PMN:ien lisääntynyt migraatio suolen luumeniin oli riippuvainen ICAM-1:n välittämistä signalointitapahtumista ja MLCK:n aktivoitumisesta. Sekä ICAM-1-peptidin intraluminaalinen lisäys, mutta ei kontrollipeptidiä (ei esitetty; 100 μg ml-1, 30 min), että MLCK:n esto (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) ennen ICAM-1:n Ab-välitteistä ristisilloittamista estivät täysin ICAM-1-ligatoinnin aiheuttaman PMN:n migraation lisääntymisen (Kuva 7a,c). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ICAM-1:n kiinnittyminen suolen epiteelikalvon apikaaliseen osaan tulehdusolosuhteissa heikentää esteen toimintaa, mikä helpottaa PMN:n lisääntynyttä rekrytointia in vivo.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.