The genetic variation of different developmental stages of Schistosoma japonicum : do the distribution in snails and pairing preference benefit the transmission?
Näytteiden keruu
Näytteiden keruu ja koejärjestelyt on esitetty tiivistetysti kuvassa 1. Näytteenottovaiheet on kuvattu jäljempänä, mukaan lukien etanoiden kerääminen, sercarioiden kerääminen, hiiri-infektion ja aikuisten matojen kerääminen sekä miracidioiden kerääminen.
Virtauskaavio näytteiden keruusta ja koesuunnitelmasta
Etanoiden keruu
Oncomelania hupensis -etanat kerättiin maalis- ja syyskuussa 2016 Dongting-järven itäiseltä alueelta (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), Hunanin maakunta, Kiina. Etanat löydettiin kolmen kylän ojista 10 kilometrin etäisyydeltä. Keräyspaikka on suoalue eikä kansallispuisto tai muu suojelualue tai yksityismaa. Keräykset suoritettiin Hunanin maakunnan (Kiina) skistosomiaasin valvontalaitoksen (Institute of Schistosomiasis Control of the Hunan Province, China) luvalla ja avustuksella, joka valvoo etanoiden valvontaa alueella. Oncomelania hupensis ei ole uhanalainen tai suojeltu laji. Etanat tuotiin takaisin laboratorioon ja luokiteltiin maaliskuussa kerätyistä etanoista ryhmään A ja syyskuussa kerätyistä etanoista ryhmään B. Kuukauden vankeuden jälkeen etanat pestiin ja siirrettiin yksittäisiin, vedellä täytettyihin maljoihin 3 tunniksi valossa 25 °C:n lämpötilassa S. japonicum -tartunnan tunnistamiseksi tarvittavien sercarioiden syntymisen edistämiseksi. Lopuksi 20 etanaa ryhmästä A ja 25 etanaa ryhmästä B todettiin S. japonicum -tartunnan saaneiksi. Kolmen pesukerran jälkeen cercariat pipetoitiin yksitellen 2 μl:lla steriloitua pesuliuosta Whatman™ FTA -kortille (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Kuivauksen jälkeen kortit säilytettiin suljetussa muovipussissa eksikaattorissa huoneenlämmössä. Vähintään 50 cercariaa etanaa kohti kerättiin yksitellen ja varastoitiin Whatman™ FTA -kortteihin.
Hiiren infektio yksittäisen etanan cercariaeilla
Yksisukupuolisten S. japonicum -tartunnan saaneiden etanoiden erottamiseksi 2 laboratoriossa olevaa Kunming-hiirtä infektoitiin perkutaanisesti 30:llä cercariaeilla kustakin etanasta hiirtä kohti. Yhteensä 40 hiirtä infektoitiin 20 etanalle ryhmässä A ja 50 hiirtä infektoitiin 25 etanalle ryhmässä B. Madot otettiin talteen kunkin hiiren suoliliepeen suonista perfuusiolla 0,9-prosenttisella NaCl:llä ja leikkelemällä ne 7 viikkoa infektion jälkeen. Huolehdittiin siitä, että mekaanisen voiman aiheuttama parittaisten aikuisten matojen halkeaminen perfuusion ja dissektioinnin aikana oli mahdollisimman vähäistä, ja käytettiin kolmea kokenutta teknikkoa käsittelemään madot mahdollisimman nopeasti. Kukin matopari siirrettiin erillisiin putkiin pesua ja merkitsemistä varten välittömästi, ja ne säilytettiin absoluuttisessa etanolissa pareittain, kun ne olivat eronneet toisistaan spontaanisti. Kustakin hiirestä saadut parittomat madot tarkistettiin mikroskoopilla sukupuolen vahvistamiseksi, minkä jälkeen ne varastoitiin etanoliin.
Hiiren infektio kaikista etanoista kootuilla cercarioilla (menetelmät I ja II) ja aikuisten matojen keräys
Seuraavissa infektioissa 17 ryhmän A 20 etanasta ja 16 ryhmän B 25:stä etanasta säilyi elossa ja kykeni tuottamaan riittävästi cercarioita. Kahdessa etanaryhmässä käytettiin kahta erilaista cercariae pooling -menetelmää. Ryhmän A 17 jäljelle jääneen etanan osalta kaikki etanat koottiin yhteen vettä sisältävään pulloon, jotta sirkarioiden syntymistä voitaisiin stimuloida (menetelmä I). Tämän jälkeen kolmekymmentäyksi hiirtä infektoitiin perkutaanisesti 34:llä sercarialla kutakin hiirtä kohti. Ryhmän B 16 etanalla tehdyssä tartunnassa yhdistettiin 2 sercariaa kustakin erikseen irtoavasta etanasta, ja sekoitettuja 32 sercariaa käytettiin hiiren tartuttamiseen (menetelmä II), jolloin tartutettiin yhteensä 22 hiirtä. Kaikki hiiret teurastettiin S. japonicum -matojen keräämiseksi 7 viikkoa tartunnan jälkeen edellä kuvatulla tavalla. Lopuksi kerättiin 530 matoa hiiristä menetelmällä I (ryhmä A) ja 484 matoa hiiristä menetelmällä II (ryhmä B).
Miracidioiden kerääminen
Etukäteen, ennen kuin kaikki infektoidut hiiret uhrattiin aikuisten matojen keräämiseksi, jokaiselta hiireltä kerättiin ulostetta 7 päivän ajan, jotta saatiin konsentroitua suolen kautta erittyvät munat miracidioiden kuoriutumista varten. Kunkin hiiren munasakka altistettiin kloorittomalle vedelle pullossa valossa 25 °C:ssa miracidioiden kuoriutumiseksi. Miracidiat kerättiin pipetillä kunkin pullon ylemmästä vedestä ja siirrettiin astiaan, jossa oli miracidioiden pesuliuosta (5 g/l laktalbumiinihydrolysaattia, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 ja 0,20 g/l NaHCO3). Kolmen pesukerran jälkeen miracidia pipetoitiin yksitellen 2 μl:lla steriloitua pesuliuosta Whatman™ FTA -kortille. Kuivauksen jälkeen kortti säilytettiin suljetussa muovipussissa eksikaattorissa huoneenlämmössä. Hiiren ulosteesta kerättiin vähintään 50 miracidiaa.
Tartunnan saaneiden hiirten maksaan loukkuun jääneistä munista kuoriutuneet miracidiat kerättiin myös seuraavasti. Kunkin tartunnan saaneen hiiren maksa kerättiin aikuisten matojen keräämisen jälkeen, homogenisoitiin kylmässä 1,2-prosenttisessa NaCl:ssä ja suodatettiin munasedimentin saamiseksi. Miracidia kuoriutui samalla menetelmällä kuin ulostenäytteessä. Lopuksi vähintään 50 miracidiaa hiiren maksaa kohti pipetoitiin yksitellen ja tallennettiin Whatman™ FTA -kortteihin.
Genomisen DNA:n uuttaminen
Yksittäisen cercaria- tai miracidiumnäytteen DNA:ta varten otettiin halkaisijaltaan 2 mm:n suuruinen kiekko kunkin näytteen pipetointialueen keskeltä Whatman™ FTA -kortista 2 mm:n suuruisella Harrisin mikro-lyöntipuristimella (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Kiekko asetettiin 96-kuoppaisen, 1,2 ml:n U-pohjalevyn pohjaan. Sen jälkeen, kun 100 μl FTA-puhdistusreagenssilla (GE Healthcare Life Sciences) oli pesty 5 minuutin ajan ja sen jälkeen 100 μl TE-puskuria (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) oli pesty 5 minuutin ajan, kuhunkin kuoppaan lisättiin 14 µl 0,1 M NaOH:ta, jossa oli 0,3 mM EDTA:ta, pH 13,0, ja liuoksen annettiin inkuboitua 5 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 26 µl 0,1 M:sta 0,1 M:n Tris-HCl-puskuria, pH 7,0. Tämän jälkeen levy sekoitettiin sykkimällä vortex-sekoittimella 3 kertaa noin 10 sekunnin ajan. Tämän jälkeen liuoksen annettiin olla huoneenlämmössä 10 min, pulssitettiin vorteksilla 10 kertaa, ja eluaatti siirrettiin puhtaaseen 96-kuoppalevyyn ja säilytettiin – 20 °C:ssa myöhempää käyttöä varten.
Yksittäisten aikuisten matojen osalta jokaisesta aikuisesta naarasmadosta leikattiin mikroskoopin alla pois etummainen osa, mukaan luettuna kohtu, jotta vältettäisiin kohtuontelossa olevien mätimunien vaikutus naarasmadon genotyyppiin. DNA:n uuttamiseen käytettiin kokonaisia urosmatoja tai epäkypsiä naarasmatoja. Kokonaisgenominen DNA uutettiin erikseen kustakin madosta käyttäen standardia natriumdodekyylisulfaatti-proteinaasi K -menetelmää seuraavasti. Kutakin matoa inkuboitiin ja sulatettiin 400 μl:ssa uuttopuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS ja 100 mg/ml proteinaasi K:ta, 56 °C:ssa 1 tunnin ajan varovasti sekoittaen. Liuoksessa oleva DNA uutettiin käyttämällä tavanomaista fenoli/kloroformipuhdistusta, jota seurasi 3 M natriumasetaatti (pH 5,2) ja etanolin saostus. DNA-pelletit pestiin 70-prosenttisella etanolilla, ilmakuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 20 μl:aan TE-liuosta (pH 8,0), joka säilytettiin – 20 °C:ssa aikuisen madon raa’ana DNA-uutteena jatkokäyttöä varten.
PCR-monistaminen ja mikrosatelliittigenotyypin määritys
Varmistaaksemme, että FTA-kortin eluutiossa tai etanolivarastoidusta näytteestä saadussa raa’assa uutteessa oli genomista DNA:ta, 28S-ribosomaalisen DNA:n geenifragmentti monistettiin yksittäisen cercarian, miracidiumin tai aikuisen madon DNA-ratkaisun liuoksessa käyttäen seuraavia alukkeita: (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) ja käänteisellä (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR:t tehtiin käyttämällä Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads -helmiä 96-kuoppalevyssä (GE Healthcare Life Sciences, Yhdysvallat). Jokaista helmiä kohden lisättiin 2 µl yksittäisestä toukasta peräisin olevaa FTA-eluutiota tai 0,5 µl yksittäisen madon raakauutetta, 1 µl kutakin aluketta ja vettä, kunnes lopullinen tilavuus oli 25 µl. Monistus toteutettiin seuraavalla ohjelmalla: 95 °C:ssa 5 minuutin ajan, jota seurasi 40 sykliä, joissa 30 sekuntia 95 °C:ssa, 30 sekuntia 60 °C:ssa ja 40 sekuntia 72 °C:ssa, ja viimeinen pidennysvaihe 72 °C:ssa 7 minuutin ajan. Tämän jälkeen reaktiot tarkistettiin ajamalla 5 µl 2-prosenttiselle agaroosi-TAE-geelille.
Pienessä mittakaavassa genotyypitys tehtiin 30:lle cercarialle, 30:lle miracidialle ja 30:lle madolle, jotka valittiin satunnaisesti optimaalisen multipleksimikrosatelliittilokuspaneelin rakentamiseksi PCR:n monistamista varten. Tarkistettiin kaksikymmentä aiemmissa tutkimuksissa ja laboratoriossamme kehitettyä ja validoitua lokusta. Lopulta paneeliin valittiin 9 mikrosatelliittilokusta (lisätiedosto 1: taulukko S1). Kunkin DNA-näytteen mikrosatelliittilokit genotyypit määritettiin Type-it Microsatellite PCR kitillä (Qiagen, Manchester, Yhdistynyt kuningaskunta) 9 lokin multipleksillä. Kunkin parin forward-alkuaine merkittiin sopivalla fluoresoivalla väriaineella, mukaan lukien 6-FAM, HEX, TAMRA ja ROX (lisätiedosto 1: taulukko S1). PCR-reaktiot valmistettiin 96-kuoppaisessa PCR-levyssä käyttäen 6,25 µl 2 × master mixiä, 1,25 μl Q-liuosta, 0,5 μl alukkeita (10 μM), 2 μl DNA-templaattia ja 2,5 μl ddH2O:ta, minkä jälkeen ne suoritettiin Bio-Radin termosyklaattorissa seuraavalla ohjelmalla: Sen jälkeen 35 sykliä, joissa 30 sekuntia 95 °C:ssa, 90 sekuntia 60 °C:ssa ja 3 minuuttia 72 °C:ssa, ja viimeinen pidennysvaihe 60 °C:ssa 45 minuutin ajan. PCR-reaktiot tarkistettiin ajamalla 5 µl 2-prosenttiselle TAE-agaroosigeelille, ja onnistuneet monistukset lähetettiin Sangon Biotechille (Shanghai, Kiina) fragmenttianalyysiä varten ABI3100-geneettisellä analysaattorilla (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genotyypit pisteytettiin käyttämällä Geneious 11.0 -ohjelman mikrosatelliittilaajennusta. Kaikki näytteet monistettiin ja genotyypitettiin kahdesti poikkeamien vähentämiseksi. Seuraavia analyysejä varten generoitiin yhteensä 346 cercarian, 701 aikuisen madon ja 393 miracidian genotyypit.
Geneettisen diversiteetin analyysit
Kunkin lokuksen geneettinen diversiteetti arvioitiin kaikissa genotyypatuissa cercarioissa laskemalla havaittu alleelien määrä (Na), efektiivinen alleelien määrä (Ae) GenAlEx 6.5:ssä ja alleelirikkaus (Ar) ja geenidiversiteetti (Hs) hierfstat ver. 0.04-22 , mukaan lukien 156 cercariaa 20 etanasta ryhmästä A ja 190 cercariaa 25:stä etanasta ryhmästä B. Poikkeama Hardy-Weinbergin tasapainosta (HWE) kunkin lokuksen osalta testattiin khiin neliö -testillä GenAlEx-ohjelmassa, ja lokusten välinen linkitysepätasapainotesti laskettiin SHEsis-ohjelmassa .
Na-, Ae-, Ar- ja Hs-arvot laskettiin eri populaatioiden osalta hiirien infektioprosessin aikana seuraavasti. Tartunnassa käytetyistä sercariapopulaatioista arvioitiin 132 sercariaa 17 etanasta ryhmästä A (käytetty menetelmässä I) ja 122 sercariaa 16 etanasta ryhmästä B (käytetty menetelmässä II). Genotyypityksen ja heikkolaatuisen datan suodattamisen jälkeen vähintään 5 paria aikuisia matoja (jos niitä oli) ja kaikki parittomat madot kustakin hiirestä onnistuttiin genotyypittämään. Menetelmässä I oli mukana yhteensä 357 hiiren matoa (käyttäen ryhmään A kuuluvien 17 yhdistetyn etanan cercarioita) ja 344 hiiren matoa menetelmässä II (käyttäen ryhmään B kuuluvien 16 yksittäisen etanan cercarioita, jotka oli sekoitettu tasaisesti). Lisäksi arvioitiin aikuisten matojen geneettinen monimuotoisuus kussakin hiiressä, jotta voitiin tarkistaa aikuisten matojen alleelien yhdenmukaisuus menetelmien I ja II hiirissä erikseen. Miracidium-populaatioiden osalta maksasta ja ulosteesta saatujen miracidioiden geneettinen monimuotoisuus laskettiin populaatioiden yläpuolisella tasolla (kaikkien hiirten maksasta tai ulosteesta saadut miracidiat), koska kustakin hiirestä genotyypiteltiin vain 3-4 maksasta tai ulosteesta saatua miracidiaa, mukaan luettuna 93 miracidiaa maksasta (3 hiirtä kohti) ja 124 miracidiaa ulosteesta (4 hiirtä kohti) menetelmässä I ja 88 miracidiaa sekä maksasta että ulosteesta (4 hiirtä kohti erikseen) menetelmässä II.
Molekulaarisen varianssin analyysi (AMOVA)
Ryhmän A ja ryhmän B kaikkien genotyypillisten cercarioiden geneettistä erilaistumista arvioitiin käyttämällä AMOVA-menetelmää Arlequin ver. 3.5.2.2 . Kun etanat, joita ei käytetty hiiri-infektioihin, oli jätetty pois, testattiin ryhmän A (menetelmää I varten) 17 etanasta peräisin olevien 132 ja ryhmän B (menetelmää II varten) 16 etanasta peräisin olevien 122 sercarian välinen erotus. Tartunnan jälkeen testattiin menetelmän I 357 aikuisen madon ja alkuperäisen sercariapopulaation (132 sercariaa ryhmästä A) välinen erotus. Myös 344 matoa menetelmässä II testattiin verrattuna 122:een sercariaan ryhmästä B. Lisäksi arvioitiin erikseen aikuisten matojen vaihtelua 31 hiiren välillä menetelmässä I ja aikuisten matojen vaihtelua 22 hiiren välillä menetelmässä II. Miracidioiden osalta testattiin geneettistä erilaistumista 93 maksasta saadun miracidion ja 124 ulosteesta saadun miracidion välillä menetelmässä I, ja sama tehtiin 88:lle miracidialle sekä maksasta että ulosteesta saadulle miracidialle menetelmässä II.
Sukulaisuusanalyysi niMLG:llä varustettujen sercarioiden singletonien osalta
Kustakin etanasta saatujen sercarioiden perimän genotyyppien lukumäärät laskettiin. Koska tyyppivirheitä tai somaattista mutaatiota sporokystan lisääntymisen aikana on vaikea erottaa alkuperäisestä miracidium-genotyypistä, ryhmä cercaria-genotyyppejä, joissa oli vähemmän kuin kaksi yhteensopimatonta alleelia, tunnistettiin niMLG:ksi ja luokiteltiin kussakin etanassa samasta miracidiumista peräisin olevaan sukulinjaan. Lopuksi arvioitiin kussakin etanassa geneettisiä klooneja muodostaneiden miracidioiden lukumäärä linjaluvun perusteella käyttäen R-pakettia allelematch ver. 2.5 .
Koska yhdessä etanassa niMLG:n omaavien cercarioiden oletettiin olevan peräisin yhdestä miracidiumista , yksi niMLG:n genotyypeistä (singleton) määritettiin edustamaan ryhmää cercarioita, jotka olivat peräisin miracidiumista allelematchin funktiolla amCluster, jotta saatiin suodatettu tietokokonaisuus miracidien välistä sukulaisuusanalyysia varten. Tämän jälkeen singletonien (miracidioiden) välinen sukulaisuus arvioitiin käyttämällä Streiffin mukaan SPAGeDi-ohjelmassa SPAGeDi ver:ssä käytettyä alleelikokokorrelaatiokerrointa (I′). 1.5a etanan sisäisellä ja etanoiden välisellä tasolla 20 etanan osalta ryhmässä A ja 25 etanan osalta ryhmässä B, jotta saataisiin selville, korreloiko miracidioiden aggregoituminen yhdessä etanassa miracidioiden geneettisen samankaltaisuuden kanssa.
Alleleiden jakautuminen eri etanamääristä saatujen cercaria-alaryhmien osalta
Cercaria-alaryhmien epäyhtenäinen geneettinen jakautuminen etanoiden kesken viittaa siihen, että etanoiden isäntien otoskoko vaikuttaisi cercaria-supropopulaation (cercaria-alaryhmien kaikista etanoista peräisin olevat cercaria-alaryhmät) alleleiden jakautumiseen. Na-indeksiä, joka on perusindeksi populaation geenirunsauden osoittamiseksi, arvioitiin edelleen kunkin lokuksen osalta eri cercaria-alajoukoissa valitsemalla satunnaisesti eri määrä etanoita. Etanat valittiin satunnaisesti jokaisesta tietystä etanoiden lukumäärästä, joka asetettiin 1:stä maksimiin kussakin ryhmässä käyttäen R:n perusfunktiota sample, 100 toistoa. Kussakin toistossa kunkin etanan sercarioiden lukumääräksi asetettiin 5, mikä määritettiin käytännön toteutettavuuden ja tässä tutkimuksessa kussakin etanassa genotyypiksi määritettyjen sercarioiden keskimääräisen lukumäärän perusteella. Saman etanamäärän sercarioiden genotyypit yhdistettiin, ja Na arvioitiin sitten kullekin lokukselle R-paketin hierfstat-funktiolla nb.alleles. Geneettisen monimuotoisuuden ja etanoiden lukumäärän välistä suhdetta arvioitiin laskemalla etanoiden pienin otoskoko, kun Na:n kokonaismääräksi asetettiin 50 % ja 95 %.
Aikuisten naaras- ja urosmatojen välinen geneettinen etäisyys
S. japonicum -lajin mahdollisen geneettisen preferenssin havaitsemiseksi parittelun aikana mitattiin kunkin parin uroksen ja naaraan välinen yksilöiden välinen geneettinen etäisyys Dsw yksittäisissä yksilöllisissä yksilöllisissä yksilöhiirissä käyttäen Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), ja sitä verrattiin parittaisen naaraan ja parittomien matojen (jos saatavilla, parittomat ovat useimmiten uroksia) väliseen etäisyyteen samassa isännässä.
Paternity identification for miracidia
Kunkin hiiren kaikkien täysikasvuisten matojen ja miracidia-yksilöiden alleelifrekvenssejä analysoitiin ja ne laskettiin Cervus 3.0 -ohjelman alleelifrekvenssianalyysitoiminnolla. Kaikki 9 lokusta arvioitiin lopulta sopiviksi markkereiksi jatkojalostusanalyysiä varten, kun yhteenlaskettu poissulkemistodennäköisyys oli alle 0,01 %. Toimintoa Simulation of Parentage Analysis sovellettiin alleelifrekvenssin perusteella codominanttien lokusten erottelukyvyn ja log-likelihoodin (LOD) kriittisten arvojen arvioimiseksi seuraavin oletuksin: 10 000 jälkeläistä (miracidia) kutakin yksittäistä hiirtä kohti; 10 ehdollista äitiä ja isää kutakin hiirtä kohti (arvioitu otoskoko isännästä kerättyjen aikuisten matojen lukumäärän mukaan); ehdokkaiden osuudeksi asetettiin 100 % genotyypitetyistä aikuisista matoista; muut vaihtoehdot asetettiin oletusarvoisesti. Lopuksi sekä alleelien frekvenssianalyysin että vanhemmuusanalyysin simuloinnin tuloksiin viitattiin vanhemmuusanalyysimoduulissa, jotta kukin jälkeläinen voitiin määrittää sen todennäköisimmille vanhemmille. Vanhemmat, joilla oli yli kaksi alleelia, jotka eivät sopineet yhteen jälkeläisten kanssa, jätettiin pois, ja ne vanhemmat, joilla oli suurin LOD, katsottiin todennäköisimmiksi vanhemmiksi.
Tilastollinen analyysi
Kaikki tässä tutkimuksessa tilastollisessa analyysissä käytetyt tiedot ovat jatkuvia tietoja. Lokkien geneettisen monimuotoisuuden indeksien (Na, Ae, Ar ja Hs), sukulaisuuskertoimen (I′) ja yksilöiden välisen geneettisen etäisyyden (Dsw) erojen merkitsevyyttä kahden ryhmän välillä arvioitiin merkitsevyystasolla 0,05. Aineistojen normaalijakauma tarkistettiin ensin Sharpiro-Wilk-testillä. Tämän jälkeen sovellettiin parillisten otosten/riippumattomien t-testiä, jos aineistot vastasivat normaalijakaumaa. Muussa tapauksessa Wilcoxonin allekirjoitetun järjestyksen testiä ja Mann-Whitneyn U-testiä sovellettiin toisiinsa liittyviin/riippumattomiin näytteisiin. Bonferronin korjausta käytettiin P-arvon korjaamiseen moninkertaisissa vertailuissa.