Chloroforme deutéré
13.4.4 Évaluation et maintien des performances de l’instrument
L’incorporation des instruments de laboratoire dans les systèmes de gestion de la qualité utilisés pour les certifications de laboratoire (c’est-à-dire la norme ISO17025 pour les laboratoires d’analyse) nécessite l’évaluation et le maintien des performances de l’instrument à intervalles réguliers. Ces certifications permettent au scientifique analytique du laboratoire de créer des tests de qualification de fonctionnement (QF) et de qualification de performance (QP) autour de l’utilisation prévue de l’instrument. Ainsi, pour la RMN, les tests OQ/PQ peuvent varier en fonction des tests analytiques courants à réaliser sur l’instrument. Les instruments modernes ont des procédures automatiques qui demandent à l’utilisateur d’insérer l’échantillon approprié, puis une série de tests est effectuée de manière automatisée. A la fin de ces tests, un rapport est émis qui permet à l’utilisateur d’évaluer la performance globale du spectromètre.
Pour tester des protéines thérapeutiques dans des solutions aqueuses, ces tests OQ doivent inclure : l’étalonnage de la température, la forme des lignes sur le signal de l’acétone dans le chloroforme deutéré, la sensibilité sur les signaux de l’éthylbenzène dans le chloroforme deutéré et/ou la suppression de l’eau avec évaluation de la sensibilité sur les protons anomériques d’une solution de saccharose 2 mM. L’étalonnage de la température est important car la dynamique d’une protéine est influencée par les conditions ambiantes de la solution, qui peuvent avoir des effets importants sur les largeurs de ligne et les fréquences des signaux observés. La régulation de la température de l’échantillon dans les spectromètres RMN repose sur un contrôle minutieux de la température et du débit de l’air de la sonde. L’impact de l’air de la sonde sur la température de l’échantillon peut être mesuré en mesurant les déplacements chimiques d’une solution à 100 % de méthanol ou à 100 % d’éthylène glycol. Ces décalages ont été soigneusement mesurés afin que la température réelle de l’échantillon puisse être évaluée avec un réglage donné de la température de l’air de la sonde et du débit.
L’impact d’avoir un bon calage de l’échantillon (c’est-à-dire un champ magnétique uniforme sur la partie observée d’un échantillon) sur la qualité spectrale ne peut pas être exagéré : plus les pics sont étroits, meilleure est la résolution et la sensibilité des signaux à mesurer. Plus précisément, si des techniques de suppression du signal sont utilisées, plus la base du pic à supprimer est étroite, plus les techniques de présaturation ou de suppression sélective du signal à bande étroite seront efficaces. Heureusement, l’avènement des techniques de cartographie de champ et de calage de gradient a simplifié cette tâche, souvent longue, de réglage des paramètres de calage pour chaque échantillon. Cependant, il y aura des échantillons pour lesquels les cartes de calage ne fonctionneront pas bien et il faudra consacrer du temps à l’ajustement des cales pour obtenir une réponse optimale de l’instrument.
L’évaluation de la sensibilité du spectromètre avec des échantillons standard est un moyen idéal de suivre les performances du système et les valeurs obtenues à partir des tests standard doivent respecter ou dépasser les spécifications du spectromètre fixées par le fabricant. Il convient de noter que les spécifications du spectromètre sont souvent fixées de manière conservatrice par le fabricant afin de s’assurer que son instrument passe ces tests avec succès lors de l’installation. Cependant, l’exécution des tests OQ/PQ à intervalles réguliers permet au propriétaire du spectromètre de se familiariser avec les capacités de son instrument particulier. Les écarts par rapport à l’ensemble des valeurs établies par les tests de routine doivent être examinés attentivement, car ils pourraient indiquer un mauvais fonctionnement de l’instrument.
Dans le cas de l’analyse des petites molécules dans les solvants organiques, l’utilisation du signal de l’acétone dans le chloroforme deutéré pour obtenir non seulement une forme de ligne lorentzienne et un FWHH étroit, mais aussi une base étroite (par exemple, <20 Hz aux 20% du signal du 13C-satellite) conduit généralement à la meilleure sensibilité sur les signaux de l’éthylbenzène dans le chloroforme deutéré. Pour les spectromètres utilisés pour obtenir des spectres dans des solutions aqueuses, une deuxième mesure de sensibilité est plus importante : la capacité du spectromètre à obtenir une bonne sensibilité et une bonne résolution à partir des signaux proches du pic de l’eau. Ainsi, la mesure de la sensibilité avec les signaux de protons anomériques d’un étalon composé de 2 mM de saccharose dans une solution à 95 % de H2O/5 % de D2O avec une suppression de l’eau appliquée est une mesure plus réaliste de la performance signal-bruit du spectromètre pour la RMN d’échantillons de protéines thérapeutiques.
Pour un QP sur un spectromètre évaluant la qualité des protéines thérapeutiques, un attribut de qualité critique de ces médicaments est une structure tertiaire spécifique conférée par le repliement de la chaîne d’acides aminés. Par conséquent, en tant que QP sur un spectromètre effectuant une analyse de carte de structure 2D, les spectres 2D-HSQC peuvent être exécutés en peu de temps sur un échantillon enrichi en isotopes 15N ou 13C pour établir la capacité du spectromètre à exécuter des programmes d’impulsions avec des schémas de découplage et une sélection de cohérence de gradient efficaces. Des solutions standard de protéines enrichies en isotopes 13C ou 15N (par exemple, protéine à domaine SH3 ou ubiquitine) dans des tubes scellés sont disponibles dans le commerce à des concentrations permettant de recueillir des données en quelques heures. Des spectromètres convenablement étalonnés à 500 MHz et plus, et équipés d’une cryosonde peuvent mesurer des cartes de structure 2D à des protéines d’abondance naturelle (c’est-à-dire non enrichies en isotopes) à une concentration de ∼1,0 mM en 2 à 3 jours de spectromètre .
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