La variation génétique de différents stades de développement de Schistosoma japonicum : la distribution dans les escargots et la préférence d’appariement profitent-elles à la transmission ?
Collecte d’échantillons
La collecte d’échantillons et le plan expérimental sont résumés dans la figure 1. Les étapes de collecte des échantillons sont décrites ci-dessous, y compris la collecte des escargots, la collecte des cercaires, l’infection des souris et la collecte des vers adultes, et la collecte des miracidies.
Diagramme de flux de la collecte des échantillons et du plan expérimental
Collecte d’escargots
Les escargots d’Oncomelania hupensis ont été collectés en mars et septembre 2016 dans la zone orientale du lac Dongting (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), dans la province du Hunan, en Chine. Les escargots ont été localisés dans les fossés de 3 villages à une distance de 10 km. Le site de collecte est un marais et non un parc national ou une autre zone protégée ou un terrain privé. Les collectes ont été réalisées avec l’autorisation et l’assistance de l’Institut de lutte contre la schistosomiase de la province du Hunan, en Chine, qui supervise la lutte contre les escargots dans la région. Oncomelania hupensis n’est pas une espèce menacée ou protégée. Les escargots ont été ramenés au laboratoire et classés dans le groupe A pour ceux collectés en mars et dans le groupe B pour ceux collectés en septembre. Après un mois de captivité, les escargots ont été lavés et transférés dans des flacons individuels remplis d’eau pendant 3 h sous la lumière à 25 °C, afin de stimuler l’émergence de cercaires pour identifier l’infection par S. japonicum. Finalement, 20 escargots du groupe A et 25 escargots du groupe B ont été identifiés comme infectés par S. japonicum.
Collection des cercaires
Après que les cercaires aient été libérées des escargots individuels, certaines ont été transférées dans un plat à l’aide d’une anse et lavées dans une solution de lavage des cercaires (5 g/l d’hydrolysat de lactalbumine, 6,8 g/l de NaCl, 0,4 g/l de KCL, 0,2 g/l de CaCl2, 0,2 g/l de MgSO4-7H2O et 1 g/l de glucose) sous microscope. Après 3 lavages, les cercaires ont été pipetées individuellement avec 2 μl de solution de lavage stérilisée sur une carte Whatman™ FTA (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Après séchage, les cartes ont été stockées dans un sac plastique scellé dans un dessiccateur à température ambiante. Au moins 50 cercaires par escargot ont été collectées individuellement et stockées sur des cartes Whatman™ FTA.
Infection de souris avec des cercaires provenant d’un escargot individuel
Pour distinguer les escargots infectés par S. japonicum de sexe unique, 2 souris Kunming de laboratoire ont été infectées par voie percutanée avec 30 cercaires de chaque escargot par souris. Au total, 40 souris ont été infectées pour 20 escargots du groupe A, et 50 souris ont été infectées pour 25 escargots du groupe B. Les vers ont été récupérés dans les veines mésentériques de chaque souris par perfusion à l’aide de NaCl 0,9 % et par dissection 7 semaines après l’infection. On a pris soin de minimiser le potentiel de division des vers adultes appariés causé par la force mécanique pendant la perfusion et la dissection, en utilisant 3 techniciens expérimentés pour traiter les vers aussi rapidement que possible. Chaque paire de vers a été transférée dans des tubes séparés pour être lavée et marquée immédiatement, et a été conservée dans de l’éthanol absolu par paires après s’être séparée spontanément. Les vers non appariés de chaque souris ont été vérifiés au microscope pour confirmer le sexe, puis stockés dans l’éthanol.
Infection des souris avec des cercaires mises en commun à partir de tous les escargots (méthode I et II) et collecte de vers adultes
Pour les infections ultérieures, 17 des 20 escargots du groupe A et 16 des 25 du groupe B sont restés vivants et capables de produire suffisamment de cercaires. Deux méthodes différentes de mise en commun des cercaires ont été utilisées pour les deux groupes d’escargots. Pour les 17 escargots restants du groupe A, tous les escargots ont été regroupés dans un flacon contenant de l’eau pour stimuler l’émergence des cercaires (méthode I). Trente et une souris ont ensuite été infectées par voie percutanée à raison de 34 cercaires par souris. Pour l’infection à l’aide de 16 escargots du groupe B, 2 cercaires de chaque escargot excrétant individuellement ont été regroupées, et les 32 cercaires mélangées ont été utilisées pour infecter une souris (méthode II), se répétant pour infecter 22 souris au total. Toutes les souris ont été sacrifiées pour recueillir les vers de S. japonicum 7 semaines après l’infection, comme décrit ci-dessus. Finalement, 530 vers provenant de souris par la méthode I (groupe A), 484 vers provenant de souris par la méthode II (groupe B) ont été collectés.
Collection des miracidies
Avant que toutes les souris infectées ne soient sacrifiées pour collecter les vers adultes, les selles de chaque souris ont été collectées pendant 7 jours, afin de concentrer les œufs excrétés par l’intestin pour l’éclosion des miracidies. Le sédiment des œufs de chaque souris a été exposé à de l’eau déchlorée dans un flacon sous lumière à 25 °C pour faire éclore les miracidies. Les miracidies ont été récoltées dans l’eau supérieure de chaque flacon à l’aide d’une pipette et transférées dans un plat avec une solution de lavage des miracidies (5 g/l d’hydrolysat de lactalbumine, 6,5 g/l de NaCl, 0,14 g/l de KCl, 0,12 g/l de CaCl2, et 0,20 g/l de NaHCO3). Après 3 lavages, les miracidies ont été pipetées individuellement avec 2 μl de solution de lavage stérilisée sur une carte Whatman™ FTA. Après avoir été séchée, la carte a été conservée dans un sac plastique scellé dans un dessiccateur à température ambiante. Au moins 50 miracidies par selles de souris ont été collectées.
Les miracidies écloses à partir d’œufs piégés dans les foies de souris infectées ont également été collectées comme suit . Le foie de chaque souris infectée a été prélevé après la collecte des vers adultes, homogénéisé dans du NaCl froid à 1,2% et filtré pour obtenir le sédiment d’œufs. Les miracidies ont été écloses en utilisant la même méthode que celle utilisée pour l’échantillon de selles. Enfin, au moins 50 miracidies par foie de souris ont été pipetées individuellement et conservées sur des cartes Whatman™ FTA.
Extraction d’ADN génomique
Pour l’ADN d’un échantillon unique de cercaires ou de miracidies, un disque de 2 mm de diamètre a été retiré du centre de chaque zone de pipetage de l’échantillon d’une carte Whatman™ FTA à l’aide d’un micro-punch Harris de 2 mm (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Le disque a été placé dans la base d’une plaque à 96 puits de 1,2 ml à fond en U. Après un lavage avec 100 μl de réactif de purification FTA (GE Healthcare Life Sciences) pendant 5 minutes, suivi de 100 μl de tampon TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), 14 µ de NaOH 0,1 M avec 0,3 mM EDTA, pH 13,0 ont été ajoutés à chaque puits et la solution a été laissée en incubation pendant 5 minutes, après quoi 26 µl de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 ont été ajoutés. Ensuite, la plaque a été mélangée en pulsant avec un mélangeur vortex 3 fois pendant environ 10 s chacune. La solution a ensuite été laissée à température ambiante pendant 10 min, pulsée au vortex 10 fois, et l’éluat a été transféré dans une plaque 96 puits propre, et stocké à – 20 °C pour une utilisation ultérieure.
Comme pour les vers adultes individuels, la partie antérieure, y compris l’utérus, a été coupée au microscope de chaque ver femelle adulte pour éviter l’influence des œufs dans l’utérus sur le génotype du ver femelle. Les vers mâles entiers ou les vers femelles immatures ont été utilisés pour l’extraction de l’ADN. L’ADN génomique total a été extrait individuellement de chaque ver en utilisant une procédure standard de dodécylsulfate de sodium-protéinase K comme suit. Chaque ver a été incubé et décongelé dans 400 μl de tampon d’extraction contenant 50 mM de Tris-HCl, 50 mM d’EDTA, 100 mM de NaCl, 1 % de SDS et 100 mg/ml de protéinase K, à 56 °C pendant 1 h en mélangeant doucement. L’ADN en solution a été extrait par purification standard phénol/chloroforme, suivie d’une précipitation à l’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et à l’éthanol. Les culots d’ADN ont été lavés dans de l’éthanol à 70 %, séchés à l’air et remis en suspension dans 20 μl de TE (pH 8,0), stockés à – 20 °C comme extrait brut d’ADN de ver adulte pour une utilisation ultérieure.
Amplification par PCR et génotypage microsatellite
Pour confirmer l’existence d’ADN génomique dans l’élution de la carte FTA ou dans l’extrait brut de l’échantillon stocké dans l’éthanol, le fragment du gène de l’ADN ribosomal 28S a été amplifié à partir de la solution d’ADN d’une seule cercaire, d’un seul miracidium ou d’un seul ver adulte, en utilisant les amorces suivantes : avant (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) et inverse (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). Les PCR ont été réalisées en utilisant les billes PCR Illustra PuReTaq Ready-To-Go dans une plaque à 96 puits (GE Healthcare Life Sciences, États-Unis). Pour chaque bille, 2 µl d’élution FTA d’une seule larve ou 0,5 µl d’extrait brut d’un seul ver ont été ajoutés, avec 1 µl de chaque amorce, et de l’eau jusqu’à un volume final de 25 µl. L’amplification a été mise en œuvre avec le programme suivant : 95 °C pendant 5 min ; suivi de 40 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s à 60 °C, et 40 s à 72 °C ; et une étape d’extension finale à 72 °C pendant 7 min. Les réactions ont ensuite été vérifiées en faisant courir 5 µl sur un gel TAE d’agarose à 2%.
Un génotypage à petite échelle a été effectué pour 30 cercaires, 30 miracidies et 30 vers qui ont été choisis au hasard, afin de construire un panel optimal de loci microsatellites multiplex pour l’amplification par PCR. Vingt loci développés et validés dans des études précédentes et de notre laboratoire ont été vérifiés. Finalement, 9 loci microsatellites (Additional file 1 : Table S1) ont été sélectionnés pour former le panel. Les loci microsatellites de chaque échantillon d’ADN ont été génotypés en utilisant le kit Type-it Microsatellite PCR (Qiagen, Manchester, UK) avec le multiplex de 9 loci. L’amorce directe de chaque paire a été marquée avec un colorant fluorescent approprié, notamment 6-FAM, HEX, TAMRA et ROX (fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Les réactions PCR ont été préparées dans une plaque PCR 96 puits en utilisant 6,25 µl de master mix 2×, 1,25 μl de solution Q, 0,5 μl d’amorces (10 μM), 2 μl de matrice d’ADN et 2,5 μl de ddH2O, puis réalisées dans un thermocycleur Bio-Rad avec le programme suivant : 95 °C pendant 5 min ; suivi de 35 cycles de 30 s à 95 °C, 90 s à 60 °C, et 3 min à 72 °C ; suivi d’une étape d’extension finale à 60 °C pendant 45 min. Les réactions PCR ont été vérifiées en faisant passer 5 µl sur un gel d’agarose TAE à 2 %, et les amplifications réussies ont été envoyées à Sangon Biotech (Shanghai, Chine) pour une analyse des fragments sur un analyseur génétique ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les génotypes ont été notés à l’aide d’un plugin microsatellite de Geneious 11.0 . Tous les échantillons ont été amplifiés et génotypés deux fois afin de réduire la déviation. Au total, les génotypes de 346 cercaires, 701 vers adultes et 393 miracidies ont été générés pour les analyses suivantes.
Analyses de diversité génétique
La diversité génétique de chaque locus a été estimée dans toutes les cercaires génotypées en calculant le nombre observé d’allèles (Na), le nombre effectif d’allèles (Ae) dans GenAlEx 6.5 et la richesse allélique (Ar) et la diversité génique (Hs) dans hierfstat ver. 0.04-22, incluant 156 cercaires provenant de 20 escargots du groupe A et 190 cercaires provenant de 25 escargots du groupe B. L’écart par rapport à l’équilibre de Hardy-Weinberg (HWE) pour chaque locus a été testé avec le test du Chi carré dans GenAlEx, et le test de déséquilibre de liaison entre les loci a été calculé dans SHEsis.
Les Na, Ae, Ar et Hs ont été calculés pour différentes populations au cours du processus d’infection des souris comme suit. Pour les populations de cercaires utilisées dans l’infection, 132 cercaires de 17 escargots du groupe A (utilisées dans la méthode I) et 122 cercaires de 16 escargots du groupe B (utilisées dans la méthode II) ont été évaluées. Après génotypage et filtrage des données de faible qualité, au moins 5 paires de vers adultes (lorsqu’ils étaient présents) et tous les vers non appariés de chaque souris ont été génotypés avec succès. Au total, 357 vers de souris de la méthode I (en utilisant des cercaires provenant de 17 escargots regroupés du groupe A), 344 vers de souris de la méthode II (en utilisant des cercaires également mélangées provenant de 16 escargots individuels du groupe B) ont été impliqués. En outre, la diversité génétique des vers adultes de chaque souris a été estimée pour vérifier la cohérence allélique des vers adultes entre les souris des méthodes I et II séparément. Pour les populations de miracidium, la diversité génétique des miracidiums du foie et des selles a été calculée au niveau supra-populationnel (miracidiums du foie ou des selles de toutes les souris), en raison du fait que seulement 3-4 miracidiums du foie ou des selles de chaque souris ont été génotypés, dont 93 miracidiums du foie (3 par souris) et 124 miracidiums des selles (4 par souris) dans la méthode I, et 88 miracidiums à la fois du foie et des selles (4 par souris séparément) dans la méthode II.
Analyse de la variance moléculaire (AMOVA)
La différenciation génétique de toutes les cercaires génotypées du groupe A et du groupe B a été estimée par AMOVA dans Arlequin ver. 3.5.2.2 . Après avoir exclu les escargots non utilisés pour les infections des souris, la différenciation entre 132 cercaires provenant de 17 escargots du groupe A (pour la méthode I) et 122 cercaires provenant de 16 escargots du groupe B (pour la méthode II) a été testée. Après l’infection, la différenciation entre les 357 vers adultes de la méthode I et la population cercarienne d’origine (132 cercaires du groupe A) a été testée. De même, les 344 vers de la méthode II ont été testés par rapport aux 122 cercaires du groupe B. En outre, la variation des vers adultes parmi les 31 souris de la méthode I et les vers adultes parmi les 22 souris de la méthode II ont été évalués séparément. Pour les miracidies, la différenciation génétique a été testée entre 93 miracidies provenant de foies et 124 miracidies provenant de selles dans la méthode I, et de même pour 88 miracidies provenant à la fois de foies et de selles dans la méthode II.
Analyse de parenté pour les singletons de cercaires avec niMLGs
Le nombre de génotypes de cercaires de chaque escargot a été compté. Comme il est difficile de distinguer les erreurs de typage ou les mutations somatiques pendant la multiplication des sporocystes du génotype original du miracidium, un groupe de génotypes de cercaires avec moins de 2 allèles non appariés a été identifié comme niMLGs et assigné à une lignée dérivée du même miracidium dans chaque escargot. Enfin, le nombre de miracidiums qui ont établi des clones génétiques dans chaque escargot a été évalué en fonction du nombre de lignées à l’aide du package R allelematch ver. 2.5 .
Puisque les cercaires avec des niMLG dans un escargot étaient supposées être dérivées d’un miracidium , un des génotypes (singleton) pour les niMLG a été assigné pour représenter un groupe de cercaires qui provenaient d’un miracidium avec la fonction amCluster dans allelematch, pour produire l’ensemble de données filtrées pour l’analyse de parenté entre miracidia. Ensuite, la parenté entre les singletons (miracidies) a été estimée en utilisant le coefficient de corrélation de la taille des allèles (I′) selon Streiff dans SPAGeDi ver. 1.5a aux niveaux intra-escargot et inter-escargot pour 20 escargots du groupe A et 25 escargots du groupe B, afin de savoir si l’agrégation des miracidia dans un escargot était corrélée avec la similarité génétique des miracidia.
Distribution des allèles pour les sous-ensembles de cercaires provenant du nombre différent d’escargots
La distribution génétique non uniforme des cercaires parmi les escargots implique que la taille de l’échantillon d’escargots hôtes affecterait la distribution des allèles de la suprapopulation de cercaires (cercaires provenant de tous les escargots). Na, l’indice de base pour indiquer l’abondance des gènes d’une population, a été évalué pour chaque locus dans différents sous-ensembles de cercaires en sélectionnant au hasard différents nombres d’escargots. Les escargots ont été sélectionnés au hasard à chaque nombre donné d’escargots, qui a été fixé de 1 à un maximum dans chaque groupe en utilisant la fonction de base sample dans R, avec 100 réplicats. Dans chaque réplique, le nombre de cercaires dans chaque escargot a été fixé à 5, ce qui a été déterminé en fonction de la faisabilité pratique et du nombre moyen de cercaires génotypées dans chaque escargot dans cette étude. Les génotypes de cercaires pour le même nombre d’escargots ont été fusionnés, et le Na a ensuite été estimé pour chaque locus avec la fonction nb.alleles du package R hierfstat. La relativité entre la diversité génétique et le nombre d’escargots a été évaluée en calculant la plus petite taille d’échantillon d’escargots lorsque 50 % et 95 % de la Na totale étaient fixés.
Distance génétique entre les vers adultes femelles et mâles
Pour détecter une préférence génétique potentielle pour S. japonicum pendant l’accouplement, la distance génétique interindividuelle Dsw entre le mâle et la femelle de chaque paire chez les souris individuelles a été mesurée avec Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), et comparée à celle entre la femelle appariée et les vers non appariés (si disponible, les non appariés sont principalement des mâles) dans le même hôte.
Identification de la paternité pour les miracidies
Les fréquences alléliques de tous les vers adultes et des miracidies dans chaque souris ont été analysées et calculées à l’aide de la fonction d’analyse de la fréquence allélique dans Cervus 3.0 . Les 9 loci ont finalement été évalués comme des marqueurs appropriés pour une analyse de parenté supplémentaire avec une probabilité de non-exclusion combinée inférieure à 0,01%. La fonction Simulation de l’analyse de la filiation a été appliquée sur la base de la fréquence des allèles, pour estimer le pouvoir de résolution des loci codominants et les valeurs critiques de la log-vraisemblance (LOD) avec les hypothèses suivantes : 10 000 descendants (miracidies) pour chaque souris individuelle ; 10 mères et pères candidats dans chaque souris (taille estimée de l’échantillon en fonction du nombre de vers adultes collectés dans un hôte) ; la proportion de candidats a été fixée à 100 % des vers adultes génotypés ; les autres options ont été définies par défaut. Enfin, les deux sorties de l’analyse de la fréquence des allèles et de la simulation de l’analyse de la filiation ont été référencées dans le module d’analyse de la filiation, afin d’attribuer chaque progéniture à ses parents les plus probables. Les parents qui ont plus de 2 allèles mésappariés avec la progéniture ont été exclus, et ceux qui avaient le plus grand LOD ont été considérés comme les plus probables comme les parents.
Analyse statistique
Toutes les données utilisées dans l’analyse statistique dans cette étude sont des données continues. La signification de la différence sur les indices de diversité génétique (Na, Ae, Ar et Hs) des loci, le coefficient de parenté (I′) et la distance génétique interindividuelle (Dsw) entre deux groupes ont été évalués avec le niveau de signification de 0,05. Tout d’abord, la distribution normale des ensembles de données a été vérifiée avec le test de Sharpiro-Wilk. Le test t indépendant/échantillons appariés a ensuite été appliqué lorsque les ensembles de données répondaient à une distribution normale. Sinon, le test du rang signé de Wilcoxon et le test U de Mann-Whitney ont été appliqués pour les échantillons apparentés/indépendants. La correction de Bonferroni a été utilisée pour corriger la valeur P dans les comparaisons multiples.