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DISCUSSION
Le système modèle du synthéome d’ADN contient toutes les protéines nécessaires pour soutenir chaque phase du processus de réplication de l’ADN, et ces protéines ont une taille de 20 à 240 kDa dans les conditions d’essai actuelles, et peuvent effectuer toutes les phases du processus de réplication de l’ADN in vitro . Dans cette étude, l’activité de l’ADN primase associée au synthéome a été caractérisée en examinant la synthèse et l’extension des amorces d’ARN catalysées in vitro par l’ADN synthéome. Les résultats de nos analyses fonctionnelles montrent que l’activité de l’ADN primase associée au synthéome dans la fraction P4 dérivée de cellules de cancer du sein est 30 fois plus élevée que celle des extraits bruts de cellules de cancer du sein. La fraction P4, contenant l’ADN synthésome, a été dérivée des fractions protéiques solubles combinées nucléaires et cytoplasmiques préparées à partir de cellules MCF7 et a été utilisée pour réaliser le test de réplication de l’ADN in vitro du SV40. Les activités de l’ADN polymérase α et δ et de l’ADN primase dans la fraction P4 sont 20-40 fois plus élevées que celles des extraits cellulaires bruts ; ce qui en fait un outil utile pour ces études car il est entièrement compétent pour soutenir la synthèse et l’extension des amorces d’ARN dans un système modèle in vitro qui a été montré pour soutenir toutes les phases du processus de réplication de l’ADN .
L’ADN primase présente une processivité unique dans la synthèse et l’extension des amorces d’ARN. Cette processivité est définie par une compétition entre l’ajout du nucléotide correct suivant et la dissociation du complexe amorce-template . L’ADN primase est la seule enzyme capable de synthétiser les amorces d’ARN pendant l’initiation de la synthèse de l’ADN. Aucune des sous-unités de la primase n’est capable de synthétiser ou d’étendre une amorce d’ARN par elle-même. Le synthéome contient les deux sous-unités de la primase (c’est-à-dire p49 et p58) et peut catalyser la synthèse d’amorces d’ARN in vitro en utilisant un modèle exogène de poly(dT). La synthase produit une amorce d’ARN fonctionnelle de longueur unitaire (7-10 nt). Ces amorces d’ARN sont complètement hydrolysées par la RNase en courts fragments de 1-4 pb, mais elles ne sont pas hydrolysées par la DNase. La caractéristique principale de la primase associée au synthésome, qui la distingue d’une ADN primase isolée, est sa capacité spécifique à étendre l’amorce d’ARN pour former un brin d’ADN-amorce. La synthèse d’un brin d’ADN-amorce nécessite également une activité d’ADN polymérase en plus de l’activité d’ADN primase. L’activité de l’ADN polymérase est normalement commutée pour commencer l’élongation d’une amorce d’ARN après la synthèse de l’amorce. Seules les amorces ARN de longueur ≥7 nucléotides sont utilisées par la polymérase ; quelle que soit la concentration en dNTP . Ainsi, la synthèse et l’extension d’une amorce d’ARN de longueur unitaire ne nécessitent pas seulement une primase mais impliquent également la sous-unité p180 de l’ADN polymérase α, et le synthésome contient des ADN polymérases hautement actives, qui catalysent l’incorporation de désoxyribonucléotides pour étendre l’amorce d’ARN. Les amorces d’ARN sont prolongées par les polymérases associées au synthéome à partir d’un oligoamorceur ADN-ARN de 20 à 40 nt de longueur (amorce d’ADN). Les brins d’ADN-amorce contiennent deux composants : (1) un ribonucléotide de 10 nt et, (2) un désoxyribonucléotide de 20-40 nt. La RNase et la DNase hydrolysent séparément les composants appropriés des brins d’ADN-amorce, ce qui entraîne un raccourcissement mais une hydrolyse incomplète du brin d’ADN-amorce.
Une autre caractéristique du synthéome est la synthèse rapide et les tailles distinctes de l’amorce d’ARN et du brin d’ADN-amorce. Le synthéome catalyse la synthèse d’une amorce d’ARN et d’un brin d’ADN-amorce rapidement, et les niveaux d’équilibre semblent s’accumuler en (5-15 min). Les tailles de l’amorce d’ARN de longueur unitaire (7-10 nt) et du brin d’ADN-amorce (20-40 nt) catalysées par le synthéome d’ADN restent toujours constantes, indépendamment de la concentration du synthéome ou du temps de réaction. Cette étude sur le mécanisme de l’activité de l’ADN primase implique que la synthèse des amorces d’ARN, catalysée par la primase associée au synthésome, se produit via une initiation lente, une polymérisation rapide et une terminaison » intelligente » de l’amorce . L’ADN primase se lie à la matrice d’ADN et initie lentement la synthèse d’un dinucléotide. Après la synthèse du dinucléotide, des NTP supplémentaires sont rapidement ajoutés au dinucléotide polymérisé par l’ADN primase. L’activité de l’ADN primase se caractérise par la synthèse de chaque amorce d’ARN en une seule » salve » d’activité, plutôt que par une synthèse distributive. Une fois que des amorces de longueur unitaire de 7 à 10 nt ont été générées, le modèle de la primase agit comme un signal de terminaison et inhibe la poursuite de la synthèse de l’ARN. Cette inhibition est due à la génération d’un modèle d’amorce stable, qui reste probablement associé au complexe pol α-primase. Il est intéressant de noter que les brins d’ADN-amorce synthétisés par le synthéome d’ADN in vitro sont similaires aux amorces d’ARN synthétisées par le synthéome in vitro. La synthèse d’un brin d’ADN-amorce atteint rapidement l’état d’équilibre et la taille du brin d’ADN-amorce reste relativement constante (entre 20 et 40 nt), quel que soit le temps de réaction ou la concentration du synthéome utilisé pendant la réaction de synthèse. La synthèse du brin d’ADN-amorce nécessite une activité d’ADN polymérase α en plus de l’ADN primase . Nos résultats suggèrent que l’activité polymérase α associée au synthéome est également caractérisée par une polymérisation rapide et une terminaison » intelligente » dans la synthèse du brin d’ADN-amorce. Le synthésome, avec la caractéristique de polymérisation rapide et de terminaison intelligente du brin d’ADN-amorce, diffère de la synthèse médicamentée par le fragment de Klenow de l’ADN polymérase I de E. coli pendant l’extension de l’amorce d’ARN. Contrairement au synthésome, l’extension de l’amorce d’ARN catalysée par la polymérase I dépend fortement de la durée du temps de réaction. L’augmentation du temps de réaction augmente significativement la quantité et la taille des amorces d’ARN étendues.
Deux mécanismes potentiels ont été proposés pour expliquer le passage de la synthèse des amorces à leur extension au cours du processus de réplication de l’ADN . Le premier propose que le complexe primase-polymérase se dissocie de la matrice d’amorce et se réassocie au site actif de la polymérase. La seconde propose que le changement se produise dans une translocation intrastrand du complexe pol α-primase du site actif de la primase au site actif de la polymérase α. Ce changement n’implique pas la dissociation du complexe pol α-primase de la matrice d’ADN. Nos expériences démontrent que l’extension de l’amorce d’ARN catalysée par la polymérase I est inhibée par des concentrations élevées de l’ADN synthésome. La capacité du fragment de Klenow à étendre une amorce d’ARN dépend de la synthèse des amorces d’ARN catalysée par le synthéome, qui a également besoin d’un site de liaison disponible à l’extrémité de l’amorce d’ARN. Par conséquent, le fragment de Klenow de la polymérase I d’E. coli nécessite la dissociation du complexe primase-polymérase de la matrice d’amorces. Cependant, des concentrations élevées du synthésome entrent en compétition avec la polymérase I pour le site de liaison sur la matrice d’amorce, de sorte que l’extension de l’amorce d’ARN est inhibée. Le synthésome forme un complexe en cul-de-sac à l’extrémité de l’amorce d’ARN, ce qui entraîne l’incapacité du fragment de Klenow à participer au processus d’extension de l’amorce d’ARN. Ce résultat suggère que le complexe polymérase-primase du synthéome d’ADN doit se dissocier de la matrice d’amorce après la synthèse de l’amorce d’ARN. Notre résultat montre que le synthésome augmente la taille de l’amorce ARN de longueur unitaire lorsque la température de réaction est réduite. La diminution de la température de réaction augmente l’efficacité de la commutation du complexe polymérase-primase et diminue la dénaturation de l’amorce-template . En outre, la sous-unité p49 de l’ADN primase contient l’activité catalytique de l’ARN polymérase, nécessaire pour augmenter la taille de l’amorce d’ARN de longueur unitaire. Par conséquent, nos résultats suggèrent que l’ADN synthéome possède l’activité ARN polymérase appropriée nécessaire pour former des fragments d’ADN amorcés par l’ARN.
L’analyse cinétique de l’initiation et de l’élongation de l’amorce ARN démontre que l’ADN primase associée au synthéome est une enzyme lente et relativement faible en ce qui concerne la liaison à la matrice . L’ADN primase est également une polymérase d’acide nucléique sujette aux erreurs car cette enzyme a une très faible capacité de discrimination des nucléotides, ce qui entraîne une mauvaise incorporation des nucléotides. Par conséquent, notre analyse de la cinétique enzymatique de l’activité de l’ADN primase associée au synthésome pourrait être utilisée pour déterminer la relation entre les taux de synthèse et les fréquences d’erreurs pendant la synthèse des amorces d’ARN. La synthèse discontinue de fragments d’ADN (Okazaki) sur le brin retardé de la fourche de réplication est un processus biochimique important pendant la réplication de l’ADN. Afin d’assurer une coordination efficace entre la synthèse continue de l’ADN sur le brin principal et la synthèse discontinue de l’ADN sur le brin secondaire, l’ADN primase a besoin d’une série d’étapes enzymatiques programmées avec précision qui contrôlent la synthèse de l’amorce d’ARN. Une étude cinétique d’un complexe de réplication multiprotéique du bactériophage T7 montre que la primase agit comme un frein moléculaire et arrête transitoirement la progression de la fourche de réplication. En raison de l’interaction physique de l’ADN polymérase δ avec la pol α, le résultat présenté par Lee et al. suggère que l’ADN primase pourrait être capable d’empêcher la synthèse du brin de tête de dépasser la synthèse du brin de queue pendant les étapes enzymatiques lentes sur le brin de queue.
Divers modèles eucaryotes de réplication de l’ADN ont été utilisés dans l’étude de la fonction de l’ADN primase. Le système de réplication de la matrice nucléaire du lysat de cellules entières a été utilisé pour examiner la synthèse et la distribution de l’amorce d’ARN native et de l’ADN naissant amorcé par l’ARN dans les noyaux de cellules eucaryotes en utilisant une matrice d’ADN double brin endogène liée à la matrice nucléaire . Les amorces d’ARN sont étroitement associées à la matrice nucléaire des cellules de mammifères en prolifération rapide. Les amorces d’ARN sont attachées de manière covalente à l’ADN nouvellement répliqué pour former de l’ADN naissant amorcé par l’ARN. L’ADN amorcé par l’ARN est dégradé en oligoribonucléotides de ~10 nt de longueur après digestion par la DNase, et au moins 94% des amorces d’ARN natives et de l’ADN naissant amorcé par l’ARN sont situés dans la fraction de matrice insoluble du noyau. Les amorces d’ARN de 8-10 nt de longueur qui sont trouvées associées à la matrice nucléaire, représentent <1% de l’ARN total dans la cellule ; il est donc très difficile d’examiner les amorces d’ARN et l’ADN naissant amorcé par l’ARN dans la fraction de la matrice nucléaire de la cellule en raison d’une très faible concentration d’amorces d’ARN et de la quantité relativement importante d’autres ARN. De plus, l’isolement des amorces d’ARN et de l’ADN naissant amorcé par l’ARN à partir de lysats de cellules entières marqués aux radio-nucléotides est une procédure de purification compliquée et non triviale lorsqu’elle est appliquée à l’analyse de la synthèse des amorces d’ARN médiée par le modèle de réplication de la matrice nucléaire. En revanche, l’ADN synthétiseur purifié à partir des fractions nucléaires et cytoplasmiques combinées contient une ADN primase et des ADN polymérases très actives, et prend entièrement en charge la synthèse d’amorces d’ARN natives in vitro en utilisant une matrice d’ADN double brin contenant une origine SV40. Les amorces d’ARN synthétisées par l’ADN sont de longueur normale (10 à 20 nucléotides) et semblent fonctionner correctement pour soutenir l’extension des amorces par l’ADN polymérase. Ces amorces d’ARN peuvent être facilement étendues pour former un ADN naissant amorcé par l’ARN de 100-200 nt. La synthèse discontinue de fragments d’ADN (Okazaki) sur le brin retardé de la fourche de réplication est un processus biochimique important impliqué dans la réplication de l’ADN, et les fragments d’ADN (Okazaki) amorcés par l’ARN synthétisés par le synthéome d’ADN sont également d’une longueur d’environ 100-200 nucléotides. Nous avons observé que le synthéome d’ADN pouvait synthétiser différents produits amorcés par l’ARN dont la taille varie de 10 à 200 nt. Cela peut être considéré comme raisonnable, car les amorces d’ARN natives et l’ADN naissant amorcé par l’ARN ont également cette longueur approximative. L’observation ci-dessus, selon laquelle la synthèse de l’amorce d’ARN et de l’ADN naissant amorcé par l’ARN, catalysée par le synthéome d’ADN, est essentiellement équivalente à celle de l’étude publiée en utilisant le modèle de réplication de la matrice nucléaire du lysat de cellules entières , suggère que le synthéome d’ADN est un excellent système modèle capable d’effectuer un processus de réplication d’ADN physiologiquement significatif in vitro.
Le modèle du synthéome d’ADN est donc un outil unique et précieux dans l’étude de la fonction de l’ADN primase. La synthèse et l’élongation des amorces d’ARN médiées par la primase, effectuées par le synthésome d’ADN, ressemblent étroitement à celles effectuées par d’autres modèles de réplication acellulaires. Le modèle du synthésome permet la synthèse et l’extension d’amorces d’ARN in vitro en utilisant des matrices d’ADN simple brin exogènes ainsi que de l’ADN double brin super enroulé contenant une origine de réplication SV40 intacte. Par conséquent, le synthéome d’ADN est tout à fait capable de médier la synthèse et l’extension d’amorces d’ARN in vitro, et peut faciliter l’étude plus approfondie des mécanismes initiant la synthèse d’ADN dans les cellules eucaryotes. Ensemble, nos résultats suggèrent que le modèle du synthésome fournit un outil unique pour étudier l’interaction de l’ADN primase et d’autres protéines de réplication pendant le processus de réplication de l’ADN.