Emberi albumin előállítása sertésekben CRISPR/Cas9-mediált kopogtatásával…Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
A humán szérumalbumin (HSA) a legnagyobb mennyiségben előforduló plazmafehérje, amely kritikus homeosztatikus funkciókat tölt be az emberi fiziológiában, beleértve a plazma onkotikus nyomásának fenntartását, a testnedvek eloszlásának szabályozása, kis molekulák szállítása stb1. Számos súlyos betegség, például májelégtelenség és traumás sokk esetén alkalmazzák2. A humán vérkészletek szűkössége és az emberi vérrel kapcsolatos kockázatok miatt régóta keresik a humán albumin alternatív előállításának lehetőségét. A rekombináns HSA előállítását korábban sertésekben kísérelték meg domináns transzgén expressziója révén, albumin-GFP fúzió formájában3. A transzgenikus megközelítéseknél azonban az endogén sertés albumin jelenléte miatt az rHSA elválasztása és tisztítása problémás. Kihasználva a CRISPR/Cas9 rendszer genommódosításban rejlő lehetőségeit, arra törekedtünk, hogy rHSA-t állítsunk elő sertésekben a humán albumin cDNS-nek a sertés albumin lókuszba történő kopogtatásával. A humán ALB cDNS és az SV40 poliA szignálszekvencia (összesen 2368 bp) sertés albumin lókuszba történő beillesztésével közvetlenül a kezdő kodon után, azt vártuk, hogy a humán ALB a sertés endogén albumin transzkripciós kontrollja alatt fejeződik ki, és egyúttal blokkolja a sertés endogén albumin kifejeződését (1a. ábra). Olyan sgRNS-t terveztünk, amely a kiindulási kodon régióját célozza (közvetlenül az ATG-től 5′-re és azt is beleértve), és olyan célzott fragmentumot (donor a homológ rekombinációhoz) hoztunk létre, amelynek mindkét oldalán 1 kb homológia szekvenciák szegélyezik az inszertet (1a. ábra). Mivel a donorban használt 5′ homológia szekvencia a kiindulási kodonig fut, tartalmazza az sgRNS szekvenciát, és így az sgRNS donorként vagy a homológ rekombinációt követő knockin allélként célozható. Ennek megakadályozása érdekében 6 bp-t (gccacc) illesztettünk be az sgRNS-szekvenciába közvetlenül a kezdő kodon előtt. Az sgRNS-t in vitro átírtuk, megtisztítottuk és befecskendeztük a megtermékenyített petesejtekbe a Cas9 mRNS4 és a célzott fragmentumot tartalmazó cirkuláris vektorral együtt. Az oociták forrása Bama minipig5 volt. Az injektált embriókat 1-2 órán át tenyésztettük, mielőtt ösztruszszinkronizált nőstényekbe ültettük volna. ~300 embriót ültettünk be 10 nősténybe, amelyek közül 5 vemhes lett és összesen 16 élő kölyköt hozott világra. A kölykök standard gondozásban részesültek, és nem mutatták szokatlan egészségügyi problémák jeleit.
A humán ALB kopogtatása a sertés Alb lókuszba.
(a) A kopogtatási stratégia ábrája. (b) Az alapítók genotipizálása. A PRC primerek az (a) ábrán láthatóak. (c) Az e/f (a) primerpárral kapott PCR-termékek szekvenálási eredményei. A termékeket klónoztuk, és legfeljebb 12 klónt (a #9 esetében) szekvenáltunk.
A 16 malac fülhegyét körülbelül 4 hetes korukban levágtuk, és genomi DNS-t nyertünk a genotipizáláshoz. Annak megállapítására, hogy sikerült-e a kopogtatás, az inszerciós hely 5′ és 3′ végét is felmértük. Két primerpárt használtunk, a/b és c/d (1a. ábra). Az a primer a használt homológia 5′-végén kívül van, és a b a humán ALB-n (az inszert); a c a humán ALB-n és a d a homológia 3′-végén kívül van. Amint az 1b. ábrán látható, mind a 16 malac hordozza a kívánt knockin allélt. Az összes amplifikált DNS-töredéket klónoztuk és szekvenáltuk. Ezek a várt homológ rekombinációs termékek voltak (S1. ábra). Ezután meghatároztuk a vad típusú allél státuszát ezekben a malacokban. Az e és f primereknek (az inzertben találhatóak) (1a. ábra) egy 705 bp fragmentumot kellett felszaporítaniuk a vad típusú lókuszból és egy 3085 bp fragmentumot a knockin allélból. A várakozásoknak megfelelően mindegyik a 3085 bp-s fragmentumot generálta. Váratlanul azonban a 16 minta közül csak 7-ből (5, 6, 9, 10, 12, 13 és 15) tudtuk kinyerni a 705 bp-os vad típusú fragmentumot, a többi 700 bp körüli halvány terméket generált (1b. ábra). A vad típusú allél látszólagos hiánya néhány malacnál arra utal, hogy a kopogtatás mindkét allélon megtörténhetett. Másik lehetőség, hogy a vad típusú allélt úgy szerkesztették, hogy a primer a szekvenciát törölték, ami a vad típusú allél amplifikációjának elmaradását eredményezte. A vad típusú allélon valóban megtörtént a szerkesztés, mivel az amplifikált fragmentumok mérete néhány malacnál eltért az előre jelzett 705 bp-tól (1b. ábra). Ennek megerősítésére klónoztuk és szekvenáltuk az összes amplifikált fragmentumot. Amint az 1c. ábrán látható, mindegyik szerkesztett volt, bár némelyik csak néhány bázispárnyi változást mutatott (ezért tűnt 705 bp-nek). Ezek közül a szerkesztett allélek közül a 10. és a 12. malacban találtak érdekesek. A #10-esben lévő a sertésszekvencia 29 bp hosszúságú szakaszának (az ATG-től a 3′ vége felé) 36 bp hosszúságú (6 bp az ATG-től 5′-re és 26 bp utána) donorszekvenciával való cseréjének eredménye volt. Nem világos, hogy ez hogyan történt. A 12. számban két különböző szerkesztett allél található, így az allélok száma összesen 3, ami mozaikosságra utal ebben a malacban, ami nem ritka, mivel a Cas9/sgRNS6,7,8,9,10 zigótainjekcióval létrehozott állatokban gyakran találtak mozaikosságot.
Hogy meghatározzuk, hogy történt-e off-targeting az sgRNS-sel, a CRISPR tervezőeszköz (http://tools.genome-engineering.org) javaslatai alapján kiválasztottunk 4 top potenciális off-target helyet, és a 14. malac fülhegy genomikus DNS-éből amplifikáltunk olyan fragmentumokat, amelyek ezeket a helyeket tartalmazzák. A fragmentumokat T4EN I vizsgálatnak vetettük alá4. Amint az S2. ábrán látható, nem találtunk célponton kívüli szerkesztést. Nem tudtuk azonban kizárni annak lehetőségét, hogy a célponton kívüli szerkesztés más lókuszokban vagy a többi 15 transzgenikus sertésben is megtörtént. Mindazonáltal, még ha volt is célon kívüli szerkesztés, a szerkesztett lókuszok valószínűleg nem jelentenek problémát az rHSA előállítására irányuló célunk szempontjából, amennyiben nem zavarják e transzgénikus sertések jólétét.
A humán ALB sikeres kopogtatásának bizonyítása után arra kerestük a választ, hogy kimutatható-e humán albumin e kopogtatott malacok vérplazmájában. Amint a 2a. ábrán látható, valamennyi malac vérplazmájában humán albumin volt kimutatható a humán albumin ellen specifikus antitestekkel, bár változó mennyiségben, ami valószínűleg legalább két tényezőnek köszönhető, annak, hogy mindkét allél knockin-e, valamint a mozaikosság mértékének (különösen a májban). A #7-ben a szint nagyon alacsony, csak a blot hosszú expozíciója után látható, a vad típusú sertés Alb allél nyilvánvaló hiánya ellenére (1a. ábra). Összességében a szintek sokkal alacsonyabbak, mint a felnőtt emberi szérumokban. Ismert, hogy a sertések véralbumin-koncentrációja az életkor előrehaladtával nő, és 6 hónapos korára eléri a felnőtt emberekéhez hasonló szintet11.
A humán ALB elemzése a vérben.
(a) A humán albumin Western blot kimutatása az alapító malacok vérében. Az egyes alapítókból származó 0,5 μl plazmát SDS-PAGE-on elválasztottuk és elemeztük. Pozitív kontrollként emberi vérplazmát (0,5 μl 30-szoros hígítás után) használtunk. C, vad típusú sertésből származó plazma. (b) A tömegspektrometriás elemzéssel detektált triptikus peptidek (zöld) illusztrációja. (c) Két triptikus peptid félkvantitációja humán és sertés albuminból az egyes peptidek csúcsterületeinek mérésével. Pirossal jelöltük a sertésre specifikus aminosavmaradványokat.
Az antitestekkel kopogtatott malacaink plazmájában kimutatott rHSA valóban emberi albumin, ezért két plazmamintát (2. és 6. malac) tömegspektrometriás elemzésnek vetettünk alá. A #2 nyilvánvalóan homozigóta a knockin allélre, a #6 pedig egy knockin és egy mutáns allélt (frameshift) tartalmaz (1. ábra). A 0,5 μl plazmát SDS-PAGE-n elválasztottuk, és a 70 KD körüli fehérjéket a gélben tripszinnel emésztettük. A triptikus peptideket a gélből eluáltuk, megszárítottuk és újra feloldottuk folyadékkromatográfiás elválasztáshoz és tömegspektrometriás elemzéshez. A 2-es malac esetében 14 egyedi humán ALB-tripsz peptidet tudtunk kimutatni, a 6-os malac esetében pedig 15-öt (2b. ábra). Az FKDLGEENFK humán peptid és az FKDLGEQYFK sertés peptid (mindkettő a #2-es malacból) M/Z spektrumát az S3. ábra mutatja. Két peptidet választottunk ki a mennyiségi meghatározáshoz a csúcsterületek mérésével. A Western blot eredményekkel összhangban ez a két peptid sokkal nagyobb (~5-szörös) mennyiségben volt jelen a #2-ben, mint a #6-ban (2c. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az antitestek által kimutatott rHSA autentikus humán albumin.
A fülhegyekből izolált DNS genotipizálása azt mutatja, hogy mind a #2, mind a #6 nem tartalmaz vad típusú sertés Alb allélt, vagy nincs jelen, vagy szerkesztett (1b,c ábra). Mindkét mintában azonban még mindig kimutattunk sertésalbuminból származó triptikus peptideket, de sokkal kisebb gyakorisággal (2c. ábra). Érdekes módon a sertés peptidek abundanciája nagyjából azonos volt a két minta között, annak ellenére, hogy a humán peptidek abundanciája nagymértékben különbözött. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mindkét malac hasonló számú vad típusú (vagy heterozigóta) hepatocitát tartalmaz, amelyek felelősek a két malac vérében kimutatott sertés ALB-ért. Ugyanakkor előfordulhat, hogy ilyen vad típusú allélt tartalmazó sejtek nem léteznek, vagy rendkívül alacsony százalékban vannak jelen a fülkagylókban, így a vad típusú allélt nem lehetett PCR-rel amplifikálni. Továbbá a Southern blot analízis egy belső szondával (a humán ALB CDS 3′ fele) jelezte a donor szekvencia egy további inszerciójának jelenlétét az 1., 4. és 5. malacokban (S4. ábra). Mindezek a komplikációk nem jelentenek problémát a rekombináns humán albumin előállítása szempontjából, mivel a knockin allél visszakeresztezéssel tisztítható.
Azért, hogy megállapítsuk, hogy a knockin allél átadható-e a következő generációra, a 2-es számú (hím, homozigóta) malacot kereszteztük az 5-ös számú (nőstény, heterozigóta) malacokkal, amikor azok szaporodóképessé váltak. A keresztezésből 6 kölyök született. Közülük 4 (#1, 3, 4 és 6) homozigóta a knockin allélra (AlbH/H, H jelöli az embert) és 2 (#2 és 5) heterozigóta (AlbP/H, P jelöli a sertést) (3a. ábra). #Az 5. és 6. számú egyedek hasmenésben haltak meg körülbelül 2 héttel a születés után. A megmaradt malacok vérében 4 hetes korukban elemeztük a humán albumin expresszióját. Amint a 3b. ábrán látható, mindegyikük vérében humán albumin található. Érdekes módon a humán albumin szintje a heterozigóta állatban (#2) sokkal alacsonyabb volt, mint a homozigótáké. Nem tudjuk, hogy ez az egyéni variáció eredménye-e, vagy a knockin allélt valamilyen módon elnyomja a vad típusú allél.
A knockin allél csíravonalbeli átadása.
(a) Az F1 utódok PCR genotipizálása. A felhasznált primerek megegyeznek az 1. ábrán bemutatottakkal. (b) A humán albumin Western blot kimutatása az F1 malacok vérében. Az egyes malacokból származó 0,5 μl plazmát SDS-PAGE-on elválasztottuk és elemeztük. C, vad típusú malacból származó plazma. M, molekulatömeg marker.
Mutatjuk itt a sertés Alb lókuszba kopogtatott humán ALB cDNS-t hordozó sertések sikeres generálását. Ez egy lépéssel továbbmegy, mint a Hai és munkatársai12 és mi13 által nemrégiben közölt egyszerű génszerkesztés sertés zigótákban. A nagy háziasított állatokat bioreaktorként használták biogyógyászati fehérjetermékek előállítására14,15,16,17,18,19,20 . Általában e fehérjék kódoló szekvenciáit a szükséges transzkripciós kontroll elemekkel együtt véletlenszerűen, transzgénként illesztették be a genomba, ami számos komplikációval jár, beleértve a transzgén expressziójának rövid távú jellegét. Az általunk bemutatott tény, hogy a homológ rekombináció nagy hatékonysággal történhet sertés zigótákban, megnyitja az utat az egyre jobb bioreaktorok, valamint az egyre több és több kívánatos tulajdonsággal rendelkező állattörzsek kifejlesztése előtt.