Frontiers in Neuroscience

Frontiers in Neuroscience

Introduction

A felnőttkori hippokampuszban, az agy térbeli navigációban és memóriaképzésben részt vevő régiójában (Buzsaki and Moser, 2013) új idegsejtek termelődése a plaszticitás egy feltűnő formája, amely számos fajban, köztük az emberben is egész életen át fennmarad (Altman and Das, 1965; Eriksson et al., 1998; Moreno-Jiménez et al., 2019). A felnőttkori hippokampális neurogenezist szabályozó számos körülmény közül az egyik legmegbízhatóbb, széles körben leírt folyamat a neuronális termelés életkor által közvetített csökkenése, miközben a már meglévő neuronpopulációk a normál öregedés során állandóak maradnak (Kuhn et al., 1996; Kempermann et al., 1998; Burke és Barnes, 2010). Az öregedés számos funkciót érint az agyban, beleértve a szinaptikus átvitelt és a plaszticitást, amelyekről úgy gondolják, hogy hozzájárulnak a memóriavesztéshez (Burke és Barnes, 2006; Fan et al., 2017). Tekintettel arra, hogy a hippokampusz különösen érzékeny az életkorral összefüggő változásokra és a neurodegenerációra, az öregedés hatásainak megelőzése vagy enyhítése szempontjából fontossá válik az ebben a struktúrában a plaszticitást fokozó stratégiák megtalálása (Bartsch és Wulff, 2015). A testmozgás és a kognitív ingerek fokozzák az agy egészségét, és általában enyhítik az öregedés hatásait. Az egyik közvetlen előny a tevékenységtől függő agyi neurotrofikus faktor (BDNF) szintjének növekedéséből eredhet, amelyről kimutatták, hogy helyreállítja a szinaptikus plaszticitást, fokozza a neurogenezist és javítja a tanulást középkorú egerekben (Marlatt és mtsai., 2012; Trinchero és mtsai., 2017). A testmozgás csökkenti a mikroglia aktivációt is, növeli az aktivitásfüggő szinaptikus plaszticitást, a neurális progenitor sejtek proliferációját és felgyorsítja a felnőtt születésű szemcsesejtek (GC) fejlődését és integrációját az öregedő hippokampuszban (van Praag et al., 2005; Kronenberg et al., 2006; O’Callaghan et al., 2009; Marlatt et al., 2012; Gebara et al., 2013). Ezek a hatások hozzájárulnak a hippokampusz-függő plaszticitás helyreállításához és az adaptív viselkedéssel korrelálnak. Így azok az idős állatok, amelyek rosszul teljesítenek a térbeli tanulási és mintaszétválasztási feladatokban, edzés után javítják teljesítményüket (van Praag et al., 2005; Marlatt et al., 2012; Wu et al., 2015; Duzel et al., 2016; Xu et al., 2017).

Azt, hogy a neurogenezis milyen mértékben járul hozzá a mozgás pozitív viselkedési hatásaihoz idősödő állatokban, még vizsgálják. Lehetséges, hogy a testmozgás által kifejtett neurogenezis sebességének növekedése hozzájárul a viselkedésbeli javuláshoz. De más mechanizmusok is szerepet játszhatnak (Meshi és mtsai., 2006). Az új neuronok gyorsabb integrációja az öregedő dentate gyrusban a testmozgás után, ami módosítja az új GC-k minőségét, szintén hozzájárulhat a viselkedésbeli javuláshoz. Míg a középkorú egerekben született neuronok lassan fejlődnek, a tartós önkéntes testmozgás elősegíti a dendritikus növekedést, a gerincek kialakulását és a neuronális integrációt (Trinchero et al., 2017). Hasonló hatásokat figyeltek meg a környezeti gazdagításnak (EE) való rövid ideig tartó kitettséggel (Trinchero et al., 2019). Ha több neuronális kohorszra halmozódik, a testmozgás által kiváltott gyorsított neuronális integráció jelentős hatást gyakorolhat a hippokampusz-függő tanulásra és viselkedésre. Ebben a munkában azt mutatjuk be, hogy az új GC-k több kohorszát gyorsan integrálni lehet az önkéntes futást folytató egerek már meglévő áramköreibe, és hogy ezek a hatások fennmaradnak, miután az egerek abbahagyták a futást.

Anyagok és módszerek

Egerek és műtét

C57BL/6J hím egereket ketrecenként 4-5 állatot tartottunk standard körülmények között. Nyolc hónapos (8M) egereket választottunk, mivel ezen életkoron túl a hippokampusz neurogenezisében erős hanyatlás következik be, ami kizárja a jelölt neuronok vizsgálatát (Morgenstern et al., 2008; Trinchero et al., 2017). Az egereket elaltattuk (150 μg ketamin/15 μg xilazin 10 μl sóoldatban/g), és a retrovírust steril kalibrált mikrokapilláris pipetták segítségével sztereotaxiás műtéttel a jobb dentate gyrus szeptális régiójába infundáltuk (1,5 μl 0,15 μl/perc sebességgel); koordináták a bregmától (mm-ben): -2 anteroposterior, -1,5 laterálisan és -1,9 ventrálisan. A jelzett időpontokban az agyakat fixáltuk, és metszeteket készítettünk konfokális képalkotáshoz (Trinchero et al., 2017). Az elemzésbe csak a septalis dentate gyrusból származó GC-ket vontuk be, amelyek a bregmától -0,96 és -2,30 mm között lokalizált metszeteknek feleltek meg az egér agyi atlasz szerint (Paxinos és Franklin, 2001). A kísérleti protokollokat a Fundación Instituto Leloir intézményi állatgondozási és -felhasználási bizottsága hagyta jóvá, az Orvosi Tudományok Nemzetközi Szervezeteinek Tanácsának az állatokkal végzett orvosbiológiai kutatásokra vonatkozó elvei és a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóban foglalt rendelkezések szerint.

Futás

A futási távolságokat minden kísérlethez vezeték nélküli futókerékkel rögzítettük. Az 1. ábra kísérleteiben az állatokat a jelzetteknek megfelelően 7 vagy 21 napig tartották futókerékkel. Ebben az állapotban az egerek ∼2 km/nap futottak. A 2., 3. ábrákon, amelyekben az egerek 1, 2 vagy 3 hónapig futottak, a megfigyelt távolság ∼10 km/nap volt.

Immunofluoreszcencia

Az immunfestést 60μm-es szabadon lebegő koronális metszeteken végeztük. Az antitesteket 3% szamárszérumot és 0,25% Triton X-100-at tartalmazó tris-pufferelt sóoldatban (TBS) alkalmaztuk. Az immunfluoreszcenciát anti GFP (nyúl poliklonális; 1:500; Invitrogen), anti NeuN (egér monoklonális; 1:50; F.H. Gage (Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA, Egyesült Államok) ajándéka), szamár antinyúl Cy3 és szamár antiegér Cy5 antitestekkel (1:250; Jackson Immuno Research Laboratories) végeztük.

Konfokális mikroszkópia

A dendritikus hosszmérésekhez a képeket (40×; NA 1,3; olaj-immersion) 60μm vastagságú metszetekről szereztük be, 35-50 optikai szeletet tartalmazó Z halmokat véve, airy unit = 1 0,8μm-es időközönként (Trinchero et al, 2017). A dendritikus hosszúságot ezután az LSM Image Browser szoftver segítségével mértük a háromdimenziós rekonstrukciók egyetlen síkra történő vetítéséből a GFP-t expresszáló GC-kben. A CA3 régióban lévő GFP-jelölt MFB-k képeit 0,4μm-es intervallumokban (63×; NA 1,4; olaj-immersziós) és 6-os digitális nagyítással vettük fel. A filopodiák területét és számát a háromdimenziós rekonstrukciók egyetlen síkra történő vetítéséből elemeztük. A következő kritériumoknak megfelelő mohaszálas boutonokat (MFB) választottuk ki a számszerűsítéshez: (i) a bouton átmérője >háromszor nagyobb volt, mint a rost átmérője, (ii) a bouton legalább az egyik végén kapcsolódott a mohaszálhoz (Toni et al., 2008). A filopodiákat nagy mohás végződésekből (1 μm < hossza < 20 μm) eredő nyúlványokként azonosították (Acsady és mtsai., 1998). A filopodiális nyúlványokat a terminálonkénti nyúlványok számának megszámlálásával mértük. A képfelvétel és a morfológiai tulajdonságok elemzése során minden vizsgált kísérleti csoportot vakon kezeltünk.

Statisztikai elemzés

Az adatok – eltérő rendelkezés hiányában – átlag ± SEM-ben vannak megadva. A normalitást a Shapiro-Wilks-teszt, a D’Agostino-Pearson omnibusz teszt és a Kolmogorov-Smirnov teszt segítségével értékeltük, 0,05 p-értékkel. Ha az adatok megfeleltek a normalitási teszteknek (Gauss-eloszlás és egyenlő szórás), a jelzetteknek megfelelően párosítatlan t-próbát alkalmaztunk Welch-korrekcióval vagy ANOVA-t Bonferroni post hoc tesztjével. Azokban az esetekben, amelyek nem feleltek meg a normalitásnak, nem parametrikus teszteket alkalmaztunk az alábbiak szerint:

Eredmények

Már korábban kimutattuk, hogy a futás felgyorsítja az új GC-k fejlődését és funkcionális integrációját az öregedő hippokampuszban (Trinchero et al., 2017). Most azt vizsgáltuk, hogy ez a fajta plaszticitás igényel-e tartós, időben felhalmozódó aktivitási szintet, vagy a futás rövidebb időszakai is gyorsabb integrációt válthatnak ki, ahogyan azt korábban az EE-nek való kitettség esetében megfigyeltük (Trinchero et al., 2019). E kérdés megválaszolásához új neuronális kohorszokat jelöltünk középkorú egerekben (8 hónapos korban; 8M) egy GFP-t kifejező retrovírus (RV-GFP) segítségével. Az egerek a neuronális fejlődés különböző ablakaiban 1 héten keresztül futó kereket használhattak, vagy a neuronális növekedés teljes intervallumában (3 hét; 1A,B ábra) futhattak. Ahogy korábban leírtuk, az új GC-k lassú fejlődést mutattak az ülő egerekben, ami 3 hét alatt rövid, kevés elágazással rendelkező dendriteket eredményezett. Az egyhetes futás nem változtatta meg az új GC-k általános megjelenését egyik vizsgált intervallumban sem (1C,D ábra). Ezzel szemben a teljes 3 hetes intervallumon át tartó futás a dendritek hosszának és elágazásának növekedését eredményezte, ami összhangban van a felgyorsult neuronális integrációval.

A mozgás megfigyelt hatásait egyetlen neuronális kohorszon, a retrovírusosan jelölteken teszteltük. Mivel azonban folyamatosan új GC-k keletkeznek, elképzelhető, hogy az edzés időszakán belül különböző időpontokban született GC-ket is befolyásolhatja az aktivitás. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére egy egyszerű stratégiát alkalmaztunk az edzéskezdet tekintetében különböző időpontokban született neuronális kohorszok jelölésére úgy, hogy az egereket különböző időközönként futókeréknek tettük ki, de mindig a neuronális szerkezetet elemeztük 3 héttel a retrovírus beadása után (az egyszerűség kedvéért 1m-nek neveztük). Így három kohorszot hasonlítottunk össze; egy 3 hétig futó, közvetlenül az edzés megkezdésekor megjelölt (Run1m), egy 2 hónapig futó, 1 hónappal az edzés megkezdése után megjelölt (Run2m), és egy 3 hónapig futó, 2 hónappal az edzés megkezdése után megjelölt (Run3m) (2A ábra). Minden körülmények között hasonló mértékű neuronális növekedést figyeltünk meg az ülő egerekhez képest, ami azt jelzi, hogy az önkéntes futást végző középkorú egér agyában született összes neuronális kohorsz gyors növekedésen és integráción megy keresztül (2B,C ábra). A Run3m egerek GC-inek dendritikus fái kissé hosszabbak voltak, mint a Run1m vagy Run2m egereké, ami arra utal, hogy a neuronális integráció elősegítése olyan mechanizmusra válaszolhat, amelynek hatása idővel felhalmozódik. Mégis, 1 hónap futás közel maximális hatást eredményezett a GC fejlődésére.

Ezután megvizsgáltuk a testmozgás hatását az öregedő agyban az aktivitás befejezése után született neuronális kohorszokra. Összehasonlítottuk, hogy a 3-4 héten át tartó futás hogyan befolyásolja a közvetlenül az edzés kezdetén (Run1m), a végén (Run-1m) vagy 1 hónappal az edzés befejezése után (Run-2m; 3A ábra) született új GC-k fejlődését. Meglepő módon a futási időszak elején vagy végén született neuronális kohorszok hasonlóan reagáltak (3B,C ábra). Ezzel szemben az 1 hónappal az edzés vége után született kohorszok (Run-2m) csak finom hatást mutattak.

Az áramkörbe való teljes integrálódás érdekében a GC-k nagy MFB-ken keresztül glutamaterg gerjesztő kapcsolatokat hoznak létre a CA3 piramissejteken, és az ezekből a terminálokból eredő filopodiális nyúlványokon keresztül GABAerg feedforward gátlást toboroznak a piramissejteken (Acsady et al, 1998; Toni et al., 2008; Sun et al., 2013; Restivo et al., 2015). Míg a konfokális elemzés nem mutatott ki változásokat a Run-1m vagy Run1m-ben született neuronok MFB-jének területén a kontrollokhoz képest, a filopódiumok/MFB-k száma ∼100%-kal nőtt (3D,E ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a fizikai edzés specifikusan növeli az új GC-kből a gátló helyi hálózatra való kapcsolódást (Trinchero és mtsai., 2019).

Diszkusszió

A felnőttkori neurogenezis komplex fejlődési lépések sorozatát foglalja magában, amely új információfeldolgozó egységek integrációját eredményezi. A szubgranuláris zóna neurális őssejtjei nyugalmi állapotukból kilépve proliferáló neurális progenitorsejtekké válnak, amelyek bővítik a prekurzorpopulációt (tranzit amplifikáló sejtek) (Bonaguidi és mtsai., 2012). Az elődsejtek neuronokat hoznak létre, amelyek vándorolnak, fejlődnek és integrálódnak az áramkörbe. Ebben a meghosszabbított időablakban az apoptotikus sejthalál miatt jelentősen csökken a neuronális pool. Az önkéntes testmozgás és az EE erős stimulációt jelentenek a felnőttkori hippokampusz neurogenezis fokozására rágcsálókban egész életük során (van Praag et al., 1999a, b; Kronenberg et al., 2003, 2006; Wu et al., 2008; Kannangara et al., 2011). A neurogenezis csökken az öregedő agyban, főként a progenitorsejt-állomány méretének csökkenése következtében. Mind a futás, mind az EE ellensúlyozhatja az öregedő állatokban jelentett csökkent neurontermelődést, különböző mechanizmusokon keresztül hatva (Kempermann és mtsai., 2010). A futás két szinten hat a neurogenezis fokozására: növeli a neurális progenitorsejtek proliferációs sebességét (van Praag et al., 1999b, 2005; Cooper et al., 2018), és felgyorsítja a fejlődő neuronok érését és funkcionális integrációját (Trinchero et al., 2017). Az EE növeli a túlélést és felgyorsítja az új GC-k érését is, de nem befolyásolja a proliferációt (Trinchero et al., 2017, 2019).

A futás szintén elősegíti a neuronális konnektivitás újrakábelezését és az intrinzik tulajdonságok modulációját az új GC-kben a fejlődés első hetében fiatal felnőtt egerekben (Sah et al., 2017). Nemrégiben beszámoltunk egy kritikus időszakról a GC-k érésének második hetében az öregedő állatokban, amelyben az EE dendritikus növekedést és az új neuronok gyorsabb integrációját indukálja az áramkörbe (Trinchero et al., 2019). Itt azt kérdeztük, hogy az 1 héten át tartó futás a GC-k fejlődésének bármelyik időpontjában befolyásolja-e az integrációjukat, de nem találtunk hatást (1. ábra). A neurogenezis szabályozásához a teljes 3 hetes futási periódusra volt szükség. A rövid távú moduláció hiánya olyan mechanizmusra utal, amelyet olyan tényezők közvetítenek, amelyeknek fel kell épülniük ahhoz, hogy észrevehető változásokat fejtsenek ki. Érdekes módon az önkéntes testmozgás fokozza a BDNF termelését, amely hetek alatt felhalmozódik, mielőtt elér egy olyan platószintet, amely maximális hatást fejt ki (Vecchio és mtsai., 2018). Bár a neurotrofinok kulcsfontosságú közvetítők, az itt megfigyelt hatásokat valószínűsíthetően több mechanizmus közvetíti. A testmozgás fokozza az elektromos aktivitást a gyrus dentatusban, növeli a véráramlást és modulálja a neuroinflammációt (Piatti et al., 2011; Speisman et al., 2013; Trinchero et al., 2017). Az egyéb mechanizmusok hozzájárulása további vizsgálatokat igényel.

Ezekben azt mutatjuk be, hogy az öregedő egerekből származó ∼3 hetes GC-k, amelyek krónikusan (akár 3 hónapig) futó keréknek vannak kitéve, teljesen kifejlett fenotípust mutatnak hosszú és összetett dendritikus arborizációval, hasonlóan a fiatal felnőtt egerekben létrehozott új GC-khez (2. ábra). A fiatal felnőtt és középkorú egerek érett GC-jei a fejlődés végére elérik az egyenértékű dendritikus hosszúságot és komplexitást, ami hasonló az EE-nek vagy futásnak kitett öregedő egerek 3 hetes GC-jeihez (Piatti et al., 2011; Trinchero et al., 2017, 2019). Ez a felhalmozott bizonyíték a futás által kiváltott érési sebesség egyértelmű gyorsulása mellett szól.

A neuronális kimenet szintjén a futás elősegítette a filopodiális nyúlványok gyors növekedését, de nem módosította az MBF-ek méretét (3D,E ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy az új GC-k gyorsan integrálódnak, de kimenetük inkább a CA3-ban lévő (filopodiák által kontakcióba hozott) GABAerg interneuronok aktiválására irányulhat, mint az MFB-k által kontakcióba hozott piramissejtekre (Acsady et al., 1998; Toni et al., 2008; Sun et al., 2013; Restivo et al., 2015). Meglepő, hogy az EE az öregedő egerekben mind az MFB-k méretének, mind a filopodiális nyúlványok számának jelentős növekedését idézte elő, ami összhangban van a neuronális kimenet kiegyensúlyozottabb modulációjával (Trinchero et al., 2019). Feltételezésünk szerint az EE okozta változások a specifikus szinapszisok aktivitásfüggő átalakítását foglalják magukban, amelyek megerősödnek a térbeli jelek kódolásához (Nicoll és Schmitz, 2005; Holtmaat és Svoboda, 2009). Ezzel szemben a futás általános ösztönzést jelenthet az új GC-k számára, hogy felkészüljenek a specifikus célpontokhoz való kapcsolódásra, amikor a kódolás szükségessé válik, miközben megőrzi a GABAerg interneuronok gátló tónusát, amely a posztszinaptikus aktivitást korlátozó mechanizmusként működhet, amíg az új GC megfelelően össze nem épül a környező hálózatban.

Eredményeink azt mutatják, hogy az öregedő agy neurogén jeleket generál, amikor az egerek hosszabb ideig (hónapokig) folytatják a futást. Ebben az összefüggésben a futó egerekben született későbbi neuronális kohorszok gyorsan fejlődnek és integrálódnak, lehetővé téve az öregedő áramkörök számára, hogy jelentős számú új neuron felhalmozódjon (4. ábra). Az új GC-k folyamatos beépülése, amelyek jellemzői hasonlítanak a fiatalabb egereknél előforduló tulajdonságokra, egy megfiatalított hippokampuszt eredményez olyan neuronokkal, amelyek felkészülhetnek a jövőbeli tapasztalatokra való reagálásra.

Tágabb perspektívából nézve, a modern társadalomhoz kapcsolódó hosszú élettartam növekedése a kognitív hanyatlás nagyobb kockázatával jár együtt. Így fontossá válik a testmozgás agyműködésre gyakorolt jól ismert előnyeinek hátterében álló mechanizmusok megértése. Emellett hosszú távú különbségek lehetnek az élet különböző szakaszaiban testmozgást gyakorló és a folyamatosan testmozgást végző egyének között a neurodegeneratív betegségek kialakulásának kockázatát csökkentő tényezők tekintetében (Llorens-Martin, 2018). Eredményeink azt mutatják, hogy a folyamatos futás elősegíti számos neuronális kohorsz integrációját, így figyelemre méltó módon emeli a hálózat komplexitását. A hippokampuszban az új neuronok integrációjának hatékonyságát növelő különböző stratégiák tervezése a plaszticitás ígéretes mechanizmusaként szolgálhat az egészséges és beteg öregedő agyban bekövetkező kognitív hanyatlás végső soron történő javítására. Végül, az ilyen felgyorsult neuronintegráció és fejlődés különböző aspektusainak hátterében álló mechanizmusok boncolgatása sokat tanulhatunk az öregedő agyban az ideghálózatok plaszticitásának lehetőségeiről.

Adatok elérhetősége

A tanulmány eredményeit alátámasztó adatok indokolt kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.

Etikai nyilatkozat

Az állatkísérletet a Leloir Intézet laboratóriumi állatok felhasználásával és gondozásával foglalkozó bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta.

A szerzők hozzájárulása

MT és MH végezte a kísérleteket és elemezte az adatokat. MT, MH és AS tervezte a kísérleteket és írta a kéziratot. AS pénzügyi támogatást nyújtott.

Finanszírozás

Ezt a munkát az Argentin Tudományos és Technológiai Ügynökség (Grant# PICT2015-3814), a National Institute of Neurological Disorders and Stroke és a Fogarty International Center (Grant# R01NS103758) támogatta AS számára, aki a Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) kutatója. MT-t egy CONICET-ösztöndíj támogatta.

Enyilatkozat az érdekellentétről

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális érdekellentétként értelmezhetők.

Köszönet

Köszönjük AS laboratórium tagjainak az értő beszélgetéseket.