PMC
DISCUSSION
A DNS-szintézis modellrendszer tartalmazza a DNS-replikációs folyamat minden egyes fázisának támogatásához szükséges összes fehérjét, és ezek a fehérjék a jelenlegi vizsgálati körülmények között 20 és 240 kDa közötti méretűek, és képesek a DNS-replikációs folyamat minden fázisát in vitro elvégezni. Ebben a tanulmányban a DNS-szintézishez kapcsolódó DNS-primer aktivitást jellemeztük a DNS-szintézis által in vitro katalizált RNS-primerek szintézisének és hosszabbításának vizsgálatával. Funkcionális elemzéseink eredményei azt mutatják, hogy az emlőrákos sejtekből származó P4 frakcióban a szinesztézóma-asszociált DNS-primáz aktivitás 30-szor nagyobb, mint a nyers emlőrákos sejtkivonatoké. A DNS-szintézómát tartalmazó P4 frakciót az MCF7 sejtekből készített kombinált nukleáris és citoplazmatikus oldható fehérjefrakciókból nyertük, és az SV40 in vitro DNS-replikációs vizsgálat elvégzésére használtuk . A P4 frakcióban a DNS-polimeráz α és δ és a DNS-primáz aktivitása 20-40-szer nagyobb, mint a nyers sejtkivonatoké ; ami hasznos eszközzé teszi e vizsgálatokhoz, mivel teljes mértékben alkalmas az RNS-primerek szintézisének és meghosszabbításának támogatására egy olyan in vitro modellrendszerben, amelyről kimutatták, hogy a DNS-replikációs folyamat minden fázisát támogatja .
A DNS-primáz egyedülálló folyamatosságot mutat az RNS-primerek szintézisében és meghosszabbításában. Ezt a folyamatosságot a következő helyes nukleotid hozzáadása és a primer-minta komplex disszociációja közötti verseny határozza meg . A DNS-primáz az egyetlen enzim, amely képes RNS-primereket szintetizálni a DNS-szintézis beindítása során . Az egyes primáz alegységek egyike sem képes önállóan RNS primer szintetizálására vagy meghosszabbítására . A szintézis mindkét primáz alegységet tartalmazza (azaz a p49 és a p58), és exogén poli(dT) templát felhasználásával képes in vitro katalizálni az RNS-primerek szintézisét. A szintézis-szintetizátor egységnyi hosszúságú (7-10 nt) funkcionális RNS-primereket szintetizál. Ezeket az RNS-primereket az RNáz teljesen hidrolizálja rövid, 1-4 bp hosszúságú fragmentumokká, de a DNáz nem hidrolizálja őket. A szintézishez kapcsolódó primáz jellegzetes tulajdonsága, amely megkülönbözteti az izolált DNS-primáztól, az a specifikus képessége, hogy az RNS-primert egy DNS-primer szál kialakítására képes meghosszabbítani. A DNS-primer szál szintéziséhez a DNS-primáz aktivitás mellett DNS-polimeráz aktivitás is szükséges. A DNS-polimeráz aktivitást általában úgy kapcsolják be, hogy a primer szintézisét követően megkezdődjön az RNS-primer megnyújtása. Csak az ≥7 nukleotid hosszúságú RNS-primereket hasznosítja a polimeráz; a dNTP-koncentrációtól függetlenül . Így az egységnyi hosszúságú RNS-primer szintéziséhez és meghosszabbításához nemcsak primázra van szükség, hanem a DNS-polimeráz α alegység p180 is részt vesz, és a szintézisszómában nagy aktivitású DNS-polimerázok találhatók, amelyek katalizálják a dezoxiribonukleotidok beépítését az RNS-primer meghosszabbításához. Az RNS-primereket a szintézisszómához kapcsolódó polimerázok hosszabbítják meg egy 20-40 nt hosszúságú DNS-RNS oligoprimerből (DNS-primer). A DNS-primer szálak két komponenst tartalmaznak: (1) egy 10 nt hosszúságú ribonukleotidot és (2) egy 20-40 nt hosszúságú dezoxiribonukleotidot. Az RNáz és a DNáz külön-külön hidrolizálja a DNS-primer szálak megfelelő komponenseit, ami a DNS-primer szál rövidülését, de nem teljes hidrolízisét eredményezi.
A szintézis másik jellemzője az RNS-primer és a DNS-primer szál gyors szintézise és eltérő mérete. A szinteszóma gyorsan katalizálja mind az RNS-primer, mind a DNS-primer szál szintézisét, és úgy tűnik, hogy az állandósult szintek (5-15 perc alatt) felhalmozódnak. A DNS-szintézis által katalizált egységnyi hosszúságú RNS-primer (7-10 nt) és DNS-primer szál (20-40 nt) mérete mindig állandó marad, függetlenül a szintézis koncentrációjától vagy a reakcióidőtől. A DNS-primáz aktivitás mechanizmusának ez a vizsgálata arra utal, hogy a szintézisszómához kapcsolódó primáz által katalizált RNS-primerek szintézise a primer lassú iniciációján, gyors polimerizációján és “intelligens” terminációján keresztül történik . A DNS-primáz megköti a DNS-templát és lassan kezdeményezi a dinukleotid szintézisét. A dinukleotid szintézise után további NTP-ket adnak hozzá gyorsan a DNS-primáz által polimerizált dinukleotidhoz. A DNS-primáz aktivitását az jellemzi, hogy az egyes RNS-primerek szintézise egyetlen “robbanás” aktivitással történik, nem pedig disztributív szintézis útján . Miután 7-10 nt hosszúságú egységnyi hosszúságú primerek keletkeztek, a primáz-mintázat terminációs jelként működik, és gátolja a további RNS-szintézist. Ez a gátlás egy stabil primer-sablon létrehozásának köszönhető, amely valószínűleg a pol α-primáz komplexhez társulva marad. Érdekes módon a DNS-szintézis által in vitro szintetizált DNS-primer szálak hasonlóak az in vitro szintetikusan szintetizált RNS-primerekhez. A DNS-primer szál szintézise gyorsan eléri az állandósult állapotot, és a DNS-primer szál mérete viszonylag állandó marad (20 és 40 nt között), függetlenül a reakcióidőtől vagy a szintézisreakció során használt szintézis-szóma koncentrációjától. A DNS-primer szál szintéziséhez a DNS-primáz mellett DNS-polimeráz α aktivitás is szükséges. Eredményeink arra utalnak, hogy a szintézishez kapcsolódó polimeráz α aktivitást is gyors polimerizáció és “intelligens” befejezés jellemzi a DNS-primer szál szintézisében. A szintézis a gyors polimerizáció és az intelligens DNS-primer szálvégződés jellemzőjével különbözik az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma által az RNS-primer hosszabbítása során végzett szintézistől. A szintézissel ellentétben a polimeráz I által katalizált RNS-primer-hosszabbítás erősen függ a reakcióidő hosszától. A reakcióidő növelése jelentősen növeli a meghosszabbított RNS-primerek mennyiségét és méretét.
Két lehetséges mechanizmust javasoltak a DNS-replikációs folyamat során a primer szintézisről a primer hosszabbításra történő átváltás magyarázatára . Az első azt javasolja, hogy a primáz-polimeráz komplex disszociál a primer-sablontól és újra asszociálódik a polimeráz aktív helyével. A második azt javasolja, hogy a váltás a pol α-primáz komplexnek a primáz aktív helyéről a polimeráz α aktív helyére történő intrastrand-transzlokációjával történik. Ez a váltás nem jár a pol α-primáz komplexnek a DNS-templátról történő disszociációjával. Kísérleteink azt mutatják, hogy a polimeráz I által katalizált RNS-primer-hosszabbítást gátolja a DNS-szintézis magas koncentrációja. A Klenow-fragment RNS-primer hosszabbító képessége a szintézis által katalizált RNS-primerek szintézisétől függ, amelynek szintén szüksége van egy elérhető kötőhelyre az RNS-primer terminusán. Ezért az E. coli I polimeráz Klenow-fragmentje megköveteli a primer-polimeráz komplex disszociációját a primer-sablontól. A szintézis nagy koncentrációi azonban versenyeznek a polimeráz I-vel a primer-templáton lévő kötőhelyért, így az RNS-primer hosszabbítása gátolt. A szinteszóma zsákutcás komplexet képez az RNS-primer terminusánál; ennek következtében a Klenow-fragmentum nem tud részt venni az RNS-primer hosszabbításában. Ez az eredmény arra utal, hogy a DNS-szintetoszóma polimeráz-primáz komplexének az RNS-primer szintézise után disszociálnia kell a primer-templátról. Eredményünk azt mutatja, hogy a reakcióhőmérséklet csökkentésekor a szintézis növeli az egységnyi hosszúságú RNS-primer méretét. A reakcióhőmérséklet csökkentése növeli a polimeráz-primáz komplex átkapcsolásának hatékonyságát és csökkenti a primer-templát denaturációját . Ezenkívül a DNS-primáz p49 alegység tartalmazza az RNS-polimeráz katalitikus aktivitását, amely szükséges az egységhosszúságú RNS-primer méretének növeléséhez . Ezért eredményeink arra utalnak, hogy a DNS-szintézom rendelkezik a megfelelő RNS-polimeráz aktivitással, amely az RNS-primer DNS fragmentumok kialakításához szükséges.
Az RNS-primer iniciáció és elongáció kinetikai elemzése azt mutatja, hogy a szintézishez kapcsolódó DNS-primeráz egy lassú és viszonylag gyenge enzim a templátkötés tekintetében . A DNS primáz is egy hibás nukleinsav polimeráz, mert ez az enzim nagyon gyenge nukleotid megkülönböztető képességgel rendelkezik; ami a nukleotidok téves beépülését eredményezi . Ezért a szintézishez kapcsolódó DNS-primáz aktivitás enzimkinetikájának elemzése felhasználható a szintetizálási sebesség és a hibafrekvenciák kapcsolatának meghatározására az RNS-primerek szintézise során. A DNS (Okazaki) fragmentumok diszkontinuus szintézise a replikációs villa lemaradó szálán fontos biokémiai folyamat a DNS replikáció során. Annak érdekében, hogy a vezető szálon a DNS folyamatos szintézise és a lemaradó szálon a DNS diszkontinuus szintézise között hatékony koordinációt biztosítson, a DNS-primáznak pontosan időzített enzimlépések sorozatára van szüksége, amelyek az RNS-primer szintézisét szabályozzák. A T7 bakteriofágból származó multiprotein replikációs komplex kinetikai vizsgálata azt mutatja, hogy a primáz molekuláris fékként működik, és átmenetileg megállítja a replikációs villa előrehaladását. A DNS-polimeráz δ és a pol α fizikai kölcsönhatása miatt a Lee és munkatársai által bemutatott eredmény arra utal, hogy a DNS-primáz képes lehet megakadályozni, hogy a vezető szál szintézise megelőzze a lemaradó szál szintézisét a lemaradó szál lassú enzimatikus lépései során.
A DNS-primáz működésének vizsgálatához különböző eukarióta DNS-replikációs modelleket használtak. A nukleáris mátrix replikációs rendszer teljes sejt lizátumot használtak a natív RNS primer és az RNS-primer naszcens DNS szintézisének és eloszlásának vizsgálatára eukarióta sejtmagokban endogén nukleáris mátrixhoz kötött kettős szálú DNS templát felhasználásával . Az RNS-primerek szorosan kapcsolódnak a gyorsan proliferáló emlőssejtek nukleáris mátrixához . Az RNS-primerek kovalensen kapcsolódnak az újonnan replikálódó DNS-hez, hogy RNS-alapozott naszcens DNS-t képezzenek. Az RNS-alapozó DNS a DNáz emésztést követően néhány ~10 nt hosszúságú oligoribonukleotiddá bomlik le , és a natív RNS-alapozók és az RNS-alapozó naszcens DNS legalább 94%-a a sejtmag oldhatatlan mátrixfrakciójában található. A 8-10 nt hosszúságú RNS-primerek, amelyek a sejtmagmátrixhoz kapcsolódva találhatók, a sejtben lévő teljes RNS <1%-át teszik ki ; ami nagyon megnehezíti az RNS-primerek és az RNS-alapozott naszcens DNS vizsgálatát a sejtmagmátrix frakcióban az RNS-primerek nagyon alacsony koncentrációja és az egyéb RNS-ek relatív nagy mennyisége miatt. Ráadásul az RNS-primerek és az RNS-primerizált naszcens DNS izolálása a radio-nukleotiddal jelölt teljes sejtlizátumokból bonyolult és nem triviális tisztítási eljárás, ha a nukleáris mátrix replikációs modell által közvetített RNS-primer szintézis elemzéséhez alkalmazzák. Ezzel szemben a kombinált nukleáris és citoplazmatikus frakciókból tisztított DNS-szintetoszóma rendkívül aktív DNS-primázt és DNS-polimerázt tartalmaz, és teljes mértékben támogatja a natív RNS-primerek in vitro szintézisét kettős szálú SV40 eredetű, DNS-t tartalmazó DNS-templát felhasználásával. A DNS-szintézis által szintetizált RNS-primerek normális hosszúságúak (10-20 nukleotidok), és úgy tűnik, hogy megfelelően működnek a DNS-polimeráz által történő primerhosszabbítás támogatására. Ezek az RNS-primerek könnyen meghosszabbíthatók, hogy 100-200 nt hosszúságú RNS-primert tartalmazó nazcens DNS-t képezzenek. A DNS (Okazaki) fragmentumok diszkontinuus szintézise a replikációs villa lemaradó szálán fontos biokémiai folyamat a DNS-replikációban, és a DNS-szintézis által szintetizált teljes hosszúságú RNS-alapozott DNS (Okazaki) fragmentumok szintén körülbelül 100-200 nukleotid hosszúságúak . Megfigyeltük, hogy a DNS-szintézom képes különböző, 10 és 200 nt közötti méretű RNS-primed termékeket szintetizálni. Ez ésszerűnek tekinthető, mivel a natív RNS-primerek és az RNS-primált naszcens DNS is megközelítőleg ilyen hosszúságúak. A fenti megfigyelés, miszerint a DNS-szintézis által katalizált RNS-primer és RNS-prímert tartalmazó naszcens DNS szintézise lényegében megegyezik a teljes sejtlízisből készült nukleáris mátrix replikációs modellel publikált tanulmányban leírtakkal , arra utal, hogy a DNS-szintézis kiváló modellrendszer, amely képes fiziológiailag értelmezhető DNS-replikációs folyamatot in vitro végrehajtani.
A DNS-szintézis modell tehát egyedülálló és értékes eszköz a DNS-primerek működésének vizsgálatában. A DNS-szintézis által végzett primáz közvetítette RNS-primer szintézis és hosszabbítás, valamint a DNS-szintézis által végrehajtott megnyúlás nagyban hasonlít más sejtmentes replikációs modellek által végrehajtott szintézishez. A szintézismodell támogatja az RNS-primerek in vitro szintézisét és hosszabbítását exogén egyszálú DNS-templátumok, valamint intakt SV40 replikációs origót tartalmazó, szupertekercselt kettős szálú DNS felhasználásával. A DNS-szinteszóma tehát teljes mértékben képes közvetíteni az RNS-primerek in vitro szintézisét és hosszabbítását, és megkönnyítheti a DNS-szintézist eukarióta sejtekben elindító mechanizmusok további vizsgálatát. Eredményeink együttesen azt sugallják, hogy a szintézismodell egyedülálló eszközt biztosít a DNS-primáz és más replikációs fehérjék kölcsönhatásának tanulmányozására a DNS-replikációs folyamat során.