Transmigrált neutrofilek a béllumenben az ICAM-1-et a hámgát és a neutrofil rekrutáció szabályozására

Transmigrált neutrofilek a béllumenben az ICAM-1-et a hámgát és a neutrofil rekrutáció szabályozására

Az ICAM-1 elősegíti a PMN adhézióját és lokomócióját az apikális hámmembránon gyulladásos körülmények között

Kripta tályogokban, ahogyan az aktív IBD-ben megfigyelhető, a bélkriptákba beszivárgó PMN-ek gyakran az apikális (luminális) hámfelülettel bensőséges kontaktusban vannak.14 A PMN-IEC kölcsönhatások vizsgálatához a TEM késői szakaszában a PMN-ek gyulladásos körülmények között történő migrációját modelleztük a bélhámon keresztül, egy korábban leírt transwell elrendezéssel.19 A PMN TEM-et a fiziológiás bazolaterális-apikális irányban a kontroll vagy interferon-γ (IFNγ) kezelt T84 IEC-ken keresztül transzepithelialis N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) gradiens (100 nM) hozzáadásával indukáltuk. A T84 IEC-k IFNγ-nek (100 U ml-1, 24 óra) való kitettsége nem volt jelentős hatással az IEC barrier funkciójára vagy a JAM-A, Occludin és ZO-1 kulcsfontosságú junctional fehérjék expressziójára és szubcelluláris lokalizációjára (S1 kiegészítő ábra online). Az IFNγ-kezelésnek nem volt szignifikáns hatása a TEM-et befejező PMN-ek számára; azonban jelentősen megnövelte az apikálisan asszociált PMN-ek számát (8,7±1,8%-ról (kezeletlen) 19,7±1,9%-ra (IFNγ, apikálisan, 1a. ábra). Ezzel a növekedéssel összhangban a nem migrált PMN-ek száma (PMN a felső kamrában, bazális) jelentősen csökkent (∼1,5-szeresére) az IFNγ-kezelést követően, ami a migráció megnövekedett ütemére utal (1a. ábra). A hámmonorétegen belüli PMN-ek száma (epithel monolayer) nem változott. Reprezentatív konfokális immunfluoreszcencia képek (1b. ábra, felső panelek) és z-projekciók (alsó panelek) mutatják az apikálisan asszociált PMN-t az IFNγ stimulált, de nem kontroll T84 monolayeren keresztüli migrációt követően. Mivel korábban kimutatták, hogy az IFNγ ICAM-1 expressziót indukál a gyulladt epitéliumban,27 feltételeztük, hogy a gyulladás során a hámmonolayeren átvándorló PMN-ek a Mac-1- és ICAM-1-függő kölcsönhatások révén az apikális membránhoz tapadnak, és ezért képesek lesznek ICAM-1-függő lokomócióra, ahogy azt korábban az érendothelben megfigyelték24, 28 A korábbi eredményeket megerősítve, az IFNγ-kezelés (100 U ml-1, 24 óra) az ICAM-1 expresszió erőteljes, időfüggő növekedését idézte elő (csúcspontja 24 órával a kezelés után, 1c,d ábra) a T84 IEC-k apikális membránján (1e ábra). Ez a hatás specifikus volt az IFNγ-re, mivel a T84 és SKCO15 IEC-k tumor nekrózis faktor-α (TNFα; 10 ng ml-1) expozíciója nem indukálta az ICAM-1 expressziót (S2A,B kiegészítő ábra). ICAM-1-felregulációt figyeltünk meg aktív fekélyes vastagbélgyulladásban szenvedő betegekből származó vastagbél-biopsziák kriptahepitéliumában is az egészséges nyálkahártyához képest (1f. ábra). Továbbá, megerősítve az ICAM-1- és Mac-1-függő PMN-adhéziót az apikális IEC-membránokhoz, az anti-ICAM-1 vagy anti-Mac-1 funkcióblokkoló antitestek (Abs; 20 μg ml-1) hozzáadása visszafordította az IFNγ által kiváltott PMN-adhézió növekedését (S3A kiegészítő ábra). Érdekes módon a PMN Mac-1 gátlása az ICAM-1 gátlásához képest erőteljesebb (>3-szoros) csökkenést eredményezett a PMN adhézióban, ami arra utal, hogy a Mac-1 az ICAM-1 mellett más hámfelszíni ligandumokhoz is kötődik.

A következőkben azt vizsgáltuk, hogy az apikálisan tapadó PMN a hámon való áthaladás után mutat-e apikális lokomóciót. Fázis-kontraszt time-lapse mikroszkópiát használtunk az IEC apikális membránjához tapadt egyes PMN-ek viselkedésének követésére és számszerűsítésére. Az exogén stimulus hiányában a PMN-ek kevés mozgást mutattak; azonban az apikálisan kapcsolódó PMN-ek 59,3±7,6%-a az IEC-n keresztüli migrációt követően erősen mozgékony viselkedést mutatott (2a. ábra), 65,6±6,2 μm átlagos kúszó távolsággal (2b. ábra). A TEM a Mac-1 expresszió erőteljes növekedését idézte elő a PMN sejtek felszínén (2c. ábra), ami összhangban van a PMN-IEC apikális interakciókban betöltött szerepével. Fontos, hogy az apikális lokomóciót mutató PMN-ek száma jelentősen megnőtt, amikor az IEC-ket IFNγ-vel stimulálták az ICAM-1 felszabályozása érdekében (88±3,6%, IFNγ, vs. 59,3±7,6%, kezeletlen IEC). Ilyen körülmények között a PMN szignifikánsan nagyobb távolságot tett meg (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, kezeletlen IEC-k, 2b. ábra) az apikális epitélmembrán mentén. Megerősítve az ICAM-1 szerepét a PMN lokomóció közvetítésében, a funkcióblokkoló anti-ICAM-1 antitest (Ab) hozzáadása megfordította az IFNγ hatását, csökkentve mind a PMN-ek számát, mind a megtett távolságokat (61,4±7,8% és 73,6±6,1 μm, 2a,b ábra). A Mac-1 gátlása megszüntette a megmaradt adherens PMN-ek lokomócióját (2a. ábra és az S1 és S2 kiegészítő filmek), megerősítve a Mac-1 kizárólagos szerepét ebben a folyamatban. A Mac-1 gátlásának a PMN lokomócióra gyakorolt hatását a time-lapse képsorozatok (2d. ábra) és hat reprezentatív PMN elmozdulási pályája (2e. ábra) is kiemeli. A PMN kúszási sebessége 3 és 7 μm min-1 között mozgott, és nem különbözött szignifikánsan a stimulálatlan vs. IFNγ-stimulált IEC-ken (S3B kiegészítő ábra).

A PMN-nek az apikális epitélmembránhoz való tapadása veszélyezteti az epiteliális barrier funkciót

A következőkben a PMN-nek az apikálisan expresszált epiteliális ligandumokkal való kölcsönhatásának az epiteliális barrier funkcióra gyakorolt hatását vizsgáltuk. Ezekben a kísérletekben PMN-t adtunk apikálisan a permeábilis hordozókon (0,4 μm pórusméret, túl kicsi a PMN TEM befogadásához) tenyésztett konfluens T84 IEC-khez, és a TER-t, mint az epiteliális barrier indexét, 12 órán keresztül mértük meghatározott körülmények között. A 12 órás időtartamot úgy választottuk ki, hogy elkerüljük az apoptotikus PMN-nek a hámgátra gyakorolt hatását.29 Az fMLF (100 nM) által stimulált PMN adhézió a T84 IEC-khez a TER időfüggő csökkenését váltotta ki 12 óra alatt (∼60%, 3a. ábra). Fontos, hogy az IFNγ-vel előkezelt T84 IEC-k apikális membránjához PMN hozzáadása, amelyről kimutattuk, hogy fokozott ICAM-1-függő PMN-adhézióhoz vezet (1a. ábra), a TER további csökkenését eredményezte (∼40% az első 2 órában és ∼90% 12 óra alatt). Az IFNγ-kezelés önmagában nem volt hatással a TER-re. Annak vizsgálatára, hogy a hámpermeabilitás megfigyelt növekedése a hámsejtek és a PMN közötti közvetlen kapcsolatnak köszönhető-e, anti-Mac-1 gátló Ab-t (CBRM1/29, 20 μg ml-1) használtunk a PMN-ek IFNγ-stimulált IEC-khez való tapadásának gátlására. A Mac-1 gátlása jelentősen mérsékelte a PMN által kiváltott TER-csökkenést az IFNγ-stimulációt követően (3a. ábra). Fontos, hogy külön kísérletekben megerősítettük továbbá, hogy a PMN által kiváltott TER-csökkenés mind a stimulálatlan, mind az IFNγ-vel kezelt epitél monolayerekben a PMN és az apikális epitélmembrán közötti közvetlen kontaktustól függött, és nem parakrin mechanizmusokon keresztül közvetített. Ilyen kísérletek során PMN-eket adtunk a fordított (apikális oldallal lefelé néző) T84 monolayereket tartalmazó transzsejtek alsó kamrájába, és fMLF-fel (100 nM) stimuláltuk. Ilyen körülmények között a PMN-nek nem volt hatása a TER-rel értékelt epiteliális gátra (3b. ábra). Az epitél monolayerek 100 nM fMLF-nek való 12 órás expozíciója nem volt jelentős hatással a TER-re.

A hám ICAM-1 ligációja MLCK-függő növekedést vált ki a bélhám permeabilitásában

Megfigyeltük, hogy az ICAM-1 apikális felszabályozása jelentősen fokozta a Mac-1-függő PMN-adhéziónak a hámgátra gyakorolt hatását (3a. ábra). Ezért feltételeztük, hogy az IFNγ-vel kezelt epitél monolayerek permeabilitásának PMN által indukált növekedése a PMN kontaktus által közvetített ICAM-1 klasztereződésnek és az ICAM-1-függő jelátviteli események indukciójának köszönhető, ahogyan azt korábban az érrendszeri endothelben leírtuk.30, 31 A permeábilis hordozókon lévő T84 IEC monolayereket IFNγ-vel kezeltük az ICAM-1 expresszió indukálása érdekében, majd az ICAM-1-hez keresztkötő Abs-t adtunk. Megerősítettük, hogy az Ab-mediált keresztkötés indukálta az ICAM-1 klaszteresedését (S2C kiegészítő ábra). Amint a 4a. ábra mutatja, az ICAM-1 Ab-mediált keresztkötése a TER időfüggő csökkenését eredményezte, ami korrelált a fluoreszcein-izotiocianát (FITC)-dextrán (3 kDa, 4b. ábra) fokozott paracelluláris fluxusával. Ez a hatás specifikus volt az ICAM-1-re, mivel más hámfelszíni molekulák, a fő hisztokompatibilitási komplex-1 (MHC-1; 4. ábra) és az ismert PMN-ligand, a CD55 (S5. kiegészítő ábra) keresztkötése nem volt jelentős hatással a permeabilitásra. Összhangban az ICAM-1 expresszió hiányával a nem stimulált T84 IEC-ken, a keresztkötő Abs alkalmazása ezen IEC-k apikális felszínére IFNγ-stimuláció hiányában nem volt hatással a TER-re (S4A kiegészítő ábra). Hasonlóképpen, összhangban az IFNγ által indukált ICAM-1 lokalizációval az apikális epitélmembránon, a keresztkötő Abs-ek alkalmazása az epitél monolaterális rétegek bazolaterális oldalára nem volt jelentős hatással a barrier funkcióra (S4B kiegészítő ábra).

Már korábban kimutattuk, hogy a PMN TEM korai eseményei (a basolaterális hámmembrán szintjén) MLCK által közvetített TER-csökkenést váltanak ki.9 Az MLCK-ról kimutatták, hogy kulcsszerepet játszik a hámpermeabilitás szabályozásában azáltal, hogy a perifunkcionális aktomiozingyűrű összehúzódását szabályozza a miozin II szabályozó könnyűlánc foszforilációján keresztül.32 Ezért megkérdeztük, hogy az apikálisan expresszált ICAM-1 ligációját követő fokozott IEC-permeabilitás függ-e az MLCK-tól. Valóban, az ICAM-1 Ab-mediált keresztkötése MLCK foszforilációt eredményezett (Tyr 464), ami összhangban van az MLCK aktiválásával (4c. ábra). Az ilyen aktiválást csökkent apikális kefekötő és a perifériás F-aktin csökkenése kísérte (4d. ábra), ami aktin citoszkeletális átrendeződésre utal. Fontos, hogy az ICAM-1 ligáció által indukált MLCK foszforiláció gátlása T84 sejtekben ML-7-gyel (20 μM,33 S4C kiegészítő ábra) megakadályozta az ICAM-1 által indukált F-aktin reorganizációt (4d. ábra), a TER csökkenését (4a. ábra) és a paracelluláris dextrán fluxus növekedését (4b. ábra). Az ML-7 kezelés (20 μM) önmagában nem volt hatással a TER-re. Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy gyulladásos körülmények között a PMN érintkezése a kripták epitélsejtjeinek apikális felszínével ICAM-1-függő jelátviteli eseményeket vált ki, ami fokozott permeabilitást eredményez.

Az ICAM-1 érintkezése az apikális epitélmembránon elősegíti a fokozott PMN TEM-et

Mivel az apikálisan expresszálódó ICAM-1 ligálása növelte az epitél permeabilitását, kísérleteket végeztünk annak vizsgálatára, hogy az epitél barrier funkciójának ICAM-1-függő változásai eredményeznek-e fokozott PMN TEM-et. Először azt vizsgáltuk, hogy a PMN-ek ICAM-1-hez való kapcsolódása az IEC apikális membránján befolyásolja-e a PMN TEM-et a fiziológiailag releváns bazolaterális-apikális irányban.34 E kísérletek során a PMN-eket arra serkentettük, hogy átvándoroljanak az epitél monorétegen, majd a transzmigrált sejteket összegyűjtöttük és 1 órán keresztül új epitél monorétegek apikális felületére helyeztük (2,5 × 105 PMN monorétegenként) IFNγ előkezeléssel vagy anélkül. Az 1 órás PMN-epiteliális kontaktus után a monorétegeket a megtapadt PMN-ektől mentesen mostuk, és a későbbi PMN TEM-vizsgálatokhoz használtuk a bazolaterális-apikális irányban. A PMN apikális bevezetése az IFNγ-vel kezelt, de nem kezeletlen epitél monolayerekbe a PMN TEM jelentős növekedését váltotta ki (1,7-szeresére, 5a. ábra). Az IFNγ-kezelés önmagában vagy a PMN jelenléte az apikális felszín közelében, de a monorétegekkel való közvetlen érintkezés nélkül nem volt hatással a PMN TEM-re (5a. ábra). Párhuzamos kísérletekben a PMN TEM-et az ICAM-1 specifikus Ab-közvetítésű keresztkötését követően vizsgáltuk. Az ICAM-1 keresztkötésének az IEC barrier funkcióra gyakorolt hatásával összhangban az ICAM-1 Ab-közvetítésű keresztkötése az IFNγ-vel kezelt T84 IEC-ken jelentősen megnövelte a PMN TEM-et (1,9±szeresére, 5b. ábra) egy apikálisan expresszált kontroll molekula, az MHC-1 keresztkötéséhez képest. A várakozásoknak megfelelően az ICAM-1 keresztkötési protokollok alkalmazása kezeletlen IEC monolayereken nem volt jelentős hatással a PMN TEM-re. Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy az apikális (luminális) IEC-membránhoz az ICAM-1 kötődése révén tapadó PMN változásokat idézhet elő az epiteliális barrierfunkcióban, és hozzájárulhat a PMN rekrutáció szabályozásához.

Az ICAM-1 keresztkötés MLCK aktivációt eredményezett, ami aktin-myozin kontrakcióra utal (4. ábra). Ezért a következőkben megvizsgáltuk az MLCK gátlásának és az F-aktin kontraktilis erők gátlásának hatását a PMN TEM-re az ICAM-1 keresztkötést követően. Az ICAM-1 keresztkötés által indukált megnövekedett PMN TEM megfordult, amikor az IEC-ket előkezeltük ML-7 MLCK-gátlóval (20 μM, 1 h33) vagy a miozinmotor II gátló Blebbistatinnal (10 μM, 1 h,35 5c. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az aktomiozin összehúzódása az ICAM-1 után szerepet játszik a PMN TEM szabályozásában. Az ML-7 vagy Blebbistatin kezelés önmagában nem volt hatással a PMN TEM-re (5c. ábra).

Ab-mediált ICAM-1 ligálás egér béllumenben az epithelium permeabilitásának MLCK-függő növekedéséhez és fokozott PMN-rekrécióhoz vezet

A következőkben in vivo kísérleteket végeztünk, hogy megvizsgáljuk az ICAM-1 ligálás hatását a bélhám barrier funkciójára és a PMN-rekrécióra, egér bélhurok modell segítségével (6b. ábra). Ebben a modellben a vékonybél intakt, vérrel perfundált szegmenseinek permeabilitását FITC-dextránnak a béllumenbe történő bevezetése után vizsgáltuk. Amint a 6a. ábrán látható, bár az ICAM-1 nem volt kimutatható a stimulálatlan epitéliumban (felső panel), az IFNγ és TNFα (500 ng, 24 óra) intraperitoneális (i.p.) beadása az ICAM-1 expresszió erőteljes indukcióját eredményezte. Különösen az indukált ICAM-1 lokalizálódott a Claudin-2 feletti egérkripta IEC-k apikális régióiba (6a. ábra, alsó panel). Ezzel párhuzamosan megfigyeltük, hogy a citokin kezelés a 3 kDa FITC-dextrán permeabilitásának ∼2-szeres növekedését eredményezte (6c. ábra).

Fontos, hogy az ICAM keresztkötő Abs, de nem a kontrollfehérje, az MHC-1 Abs bejuttatása a citokin stimulált bélhurkok lumenébe további ∼1,5-szeres növekedést idézett elő a dextrán permeabilitásban a csak citokin kezeléshez képest (6c. ábra). Annak megerősítésére, hogy a bélhám permeabilitásának növekedését specifikusan a hám ICAM-1 által indukált jelátviteli események közvetítik, az ICAM-1 citoplazmatikus doménjéből származó peptideket (ICAM-1 peptid) használtunk az ICAM-1 azon képességének gátlására, hogy downstream jelátviteli eseményeket közvetítsen. Korábban kimutattuk érrendszeri endotéliumban, hogy az ICAM-1, de nem a kontroll peptid gátolta az ICAM-1 és a célfehérjék közötti kölcsönhatásokat, ezáltal megakadályozta az ICAM-1-függő jelátvitelt anélkül, hogy befolyásolta volna az extracelluláris leukocita ligandumokhoz való kötődést.22, 24 Az ICAM-1, de nem a kontroll peptid (100 μg ml-1, 30 perc) hozzáadása gátolta az ICAM-1 ligáció által kiváltott bélpermeabilitás növekedését (6c. ábra). A bélhurkokba intraluminálisan (stimulálatlanul és IFNγ/TNFα aktiválást követően) bejuttatott Abs-ek igazoltan nem jutottak át a hámon, így kizárható a lamina propria sejtek esetleges közvetett hozzájárulása a megfigyelt hatásokhoz (S6. kiegészítő ábra).

Az MLCK ICAM-1 által közvetített jelátvitelben betöltött szerepének további alátámasztására az MLCK aktiváció ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) az ICAM-1 keresztkötés előtt megakadályozta a permeabilitás növekedését (6c. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ICAM-1 ligációt követően in vivo megnövekedett bélhámpermeabilitás MLCK-függő.

Mivel a megnövekedett hámpermeabilitás fokozott PMN-migrációval jár, feltettük a kérdést, hogy az ICAM-1 ligációja in vivo fokozott PMN-rekrécióhoz vezet-e. Egér bélhurok modell segítségével a PMN-ek bélnyálkahártyába való beszivárgását és a lumenbe történő migrációját a kemoattraktáns CXCL1 (1 μM 200 μl Hank kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS)+) luminális adagolásával indukáltuk, és immunfluoreszcens jelöléssel/konfokális mikroszkópiával, valamint a citospineken előkészített és Diff-Quikkal festett lavinált folyadék elemzésével számszerűsítettük. Kemoattraktáns hiányában a PMN-ek nem voltak kimutathatók a bélhámban vagy a béllumenben (nem látható); a CXCL1 luminális adagolása azonban jelentős PMN-migrációt váltott ki a hámrétegbe (7a. ábra) és felhalmozódást a béllumenben (7c. ábra). A citokin által kiváltott permeabilitás-növekedéssel összhangban az IFNγ/TNFα kezelés ∼2,2-szeresére növelte a PMN-ek számát a bélhámban, és ∼1,7-szeresére a lumenben. Fontos, hogy az ICAM-1 keresztkötő Abs hozzáadása a citokinnal kezelt bélhurkok lumenébe tovább növelte (a csak citokin kezeléshez képest) a PMN-ek számát mind a hámban (∼1,6-szoros, 7a,b ábra), mind a lumenben (∼1,4-szeres, 7c,d ábra). A bélhámot (piros) infiltráló PMN (zöld) a citokin aktivált bélhurkokból származó szöveti metszetek reprezentatív képein látható az ICAM-1 ligációt követően (7b. ábra). Hasonlóképpen, az ICAM-1 ligációt követően a lumenbe vándorolt PMN-t mutatják a bélhurkokból származó mosófolyadékok reprezentatív képei (7d. ábra).

Az ICAM-1 ligáció által kiváltott hámpermeabilitás növekedésével összhangban a fokozott PMN migráció a béllumenbe az ICAM-1 által közvetített jelátviteli eseményektől és az MLCK aktivációtól függött. Mind az ICAM-1 peptid intraluminális hozzáadása, de nem a kontroll peptid (nem látható; 100 μg ml-1, 30 perc), mind az MLCK gátlása (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) az ICAM-1 Ab-mediált keresztkötése előtt teljesen gátolta az ICAM-1 ligáció által kiváltott PMN migráció növekedését (7a,c ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy gyulladásos körülmények között az ICAM-1 kötődése az apikális bélhámmembránhoz veszélyezteti a barrier funkciót, így elősegíti a fokozott PMN toborzást in vivo.