E-caderina si lega alla desmogleina per facilitare l’assemblaggio del desmosoma
1) Questo articolo affronta il meccanismo della regolazione mediata dalla cadherina dell’assemblaggio del desmosoma. Mentre i revisori concordano che il lavoro è potenzialmente eccitante, hanno sollevato diverse questioni significative. In primo luogo, tutti concordano sul fatto che il modello deve essere testato esaminando la co-localizzazione in cellule che esprimono il mutante della cadherina.
Ringraziamo i revisori per aver suggerito questi importanti esperimenti. Come descritto nella nostra risposta dettagliata ai revisori, abbiamo ora testato il ruolo delle diverse mutazioni di Ecad nell’impedire il reclutamento di Dsg2 nei cheratinociti. Abbiamo espresso Ecad WT a lunghezza intera e i mutanti Ecad (L175D, K14E e W2A-K14E) in cheratinociti di topo Ecad-knockout, Pcad-knockdown (EKO/PKD) e abbiamo analizzato il reclutamento di Dsg2 nei siti di contatti intercellulari. Questi risultati confermano che l’aminoacido L175 su Ecad, media le interazioni Dsg2 e facilita la formazione precoce del complesso desmosoma nelle cellule. I nostri esperimenti rivelano anche che l’assemblaggio del desmosoma è iniziato nei siti di omodimerizzazione trans di Ecad.
2) Ci sono anche preoccupazioni circa l’affidabilità dei dati di co-localizzazione in Figura 5; un’analisi più rigorosa è necessaria per dimostrare che la co-localizzazione di E-caderina e desmoplakin si verifica molto più di quanto ci si aspetterebbe dal caso.
In campo, desmosomi sono identificati dalle dimensioni e l’aspetto di binario di colorazione DP in immagini SIM. Come sottolineato nella nostra risposta ai revisori, abbiamo usato questo approccio consolidato per individuare i desmosomi. Inoltre, ora sottolineiamo che non stiamo misurando la colocalizzazione ma piuttosto il reclutamento di diverse cadherine (Ecad e Dsg) in regioni della membrana che mostrano questo modello.
3) In secondo luogo, la modellazione presuppone che L175 faccia parte dell’interfaccia, ma senza valutazione della stechiometria non si può escludere che la perdita di legame sia un effetto indiretto della perdita della dimerizzazione cis. La modellazione è anche considerata debole poiché non sono state testate interfacce complementari su Dsg2. Senza tali dati la modellazione molecolare deve essere considerata altamente speculativa.
Come descritto nella nostra risposta dettagliata ai revisori, le simulazioni computazionali precedenti e gli esperimenti biofisici mostrano che la formazione di Ecad cis-dimero richiede prima trans dimerizzazione. Di conseguenza, Ecad non può legarsi alla superficie come stand-alone, pre-formato, cis-dimeri. Questo rende estremamente improbabile che le interazioni di legame misurate si verifichino tra i cis-dimeri Ecad e Dsg2. Tuttavia, siamo d’accordo con i revisori che i risultati di docking molecolare sono piuttosto deboli. Abbiamo quindi eliminato questi risultati di modellazione dal manoscritto.
4) Infine, come notato dal recensore 3, anche se supportato da queste aggiunte, il modello e la sezione Discussione non spiegano realmente come E-caderina regola i desmosomi.
In base ai nostri nuovi dati di struttura-funzione cellulare, proponiamo ora un modello in cui l’assemblaggio del desmosoma è facilitato sia dalle interazioni cis dirette di Ecad e Dsg2 che dal legame trans di Ecad opposto. Nel nostro modello, l’omodimerizzazione trans di Ecad da cellule opposte serve come spunto spaziale per coordinare l’assemblaggio del desmosoma. Ecad forma successivamente dei complessi cis-dimero con Dsg2 per iniziare l’assemblaggio del desmosoma. Il modello è presentato e discusso nel nuovo manoscritto.
Reviewer #1:
1) Gli esperimenti AFM su singola molecola sono la parte più solida dell’articolo. Tuttavia, nella mia lettura gli autori non escludono la possibilità che gli eventi di legame che osservano possano essere dovuti a interazioni tra cis-dimeri di E-caderina preformati. La stechiometria dell’interazione è importante da stabilire, poiché se il legame a Dsg2 coinvolto richiedeva un cis-dimero di E-caderina, cambierebbe l’interpretazione del risultato che la mutazione L175D blocca l’interazione Dsg2/E-cad. Un tale scenario sfiderebbe anche la validità delle simulazioni di docking. Nella mia lettura, la bassa probabilità di legame per contatto della punta AFM con la superficie è una prova debole che il legame riflette necessariamente l’interazione di due monomeri, né lo è la bassa densità media delle molecole di cadherina sulla superficie. Inoltre, le cadherine sono immobilizzate con streptavidina, che ha più siti di legame di biotina.
Per queste ragioni, penso che provare che l’eterodimerizzazione si verifica tra i monomeri sia importante. Per farlo, consiglierei di misurare sistematicamente la probabilità di interazione della punta con la superficie in funzione della densità superficiale areale di E-caderina sulla superficie del coprioggetto. Se l’interazione richiede davvero monomerico E-caderina questa misura dovrebbe scala linearmente con aggiunto E-caderina, almeno a basse densità. Tuttavia, questa misura specifica non è richiesto – qualsiasi misura che stabilisce la stechiometria farà.
Precedenti simulazioni al computer (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) hanno dimostrato che Ecad cis omodimerizzazione richiede prima Ecad trans-dimero formazione. Allo stesso modo, precedenti misure FRET singola molecola hanno dimostrato che non è possibile formare cis-dimeri Ecad stand-alone, anche quando Ecad monomeri sono posti in stretta vicinanza in un orientamento cis (Zhang et al., 2009). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che nei nostri esperimenti, Ecad non può essere immobilizzato sulla punta AFM o substrato come pre-formato cis-dimers. Di conseguenza, il fallimento del mutante Ecad-L175D di interagire con Dsg2 non è dovuto all’assenza di cis dimerizzazione Ecad. Ora discutiamo questo nella sottosezione “Leu 175 media le interazioni Ecad e Dsg2” del manoscritto.
Purtroppo, i limiti tecnici non permettono l’esperimento di stechiometria della proteina che il revisore suggerisce. Nei nostri esperimenti, usiamo densità di superficie delle proteine che ci permettono di identificare senza ambiguità i singoli eventi di legame dal corrispondente allungamento dei legami PEG. Se la densità di superficie della cadherina viene aumentata, come proposto dal revisore, la probabilità di più eventi simultanei di legame Ecad aumenta, il che rende inaffidabile un’analisi quantitativa della probabilità di legame della proteina. Per questo motivo (insieme alla debolezza intrinseca della nostra analisi di docking), abbiamo escluso le simulazioni di docking della proteina dal manoscritto.
Infine, nel manoscritto rivisto, ora usiamo l’analisi dei cluster per raggruppare gli eventi di disassociazione della singola molecola per la spettroscopia di forza dinamica (DFS). Abbiamo recentemente dimostrato che l’algoritmo di clustering K-means che abbiamo impiegato, migliora notevolmente la stima dei parametri cinetici in DFS (Yen e Sivasankar, 2018). Di conseguenza, i tempi di vita che ora riportiamo per le interazioni Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2, e Dsc2/Dsc2 sono più affidabili.
2) Le simulazioni di docking sono interessanti, ma a mio parere offrono prove deboli per la specifica geometria di legame che gli autori propongono. Raccomanderei vivamente agli autori di essere più cauti nell’interpretazione e nella presentazione di questi risultati, o in alternativa di presentare dati aggiuntivi, per esempio immagini EM, che supportino o confutino il risultato computazionale.
Siamo d’accordo con il recensore che i dati di docking delle proteine sono deboli. Abbiamo quindi eliminato questi risultati dal manoscritto.
3) Purtroppo, le immagini SIM non sono convincenti come attualmente presentate. In particolare, non è chiaro cosa conti come un “desmosoma” nell’analisi degli autori (Figura 5B). Un trattamento più sofisticato di colocalizzazione sarebbe necessario per stabilire il punto che E-caderina e desmoplakin colocalizzano, e che questa colocalizzazione diminuisce come giunzioni matura.
In studi precedenti (Stahley et al., 2016a, 2016b) abbiamo utilizzato l’aspetto “binario ferroviario” di DP come rivelato da imaging super-risoluzione per definire desmosomi da immunofluorescenza (come raffigurato nella Figura 3A). Altri nel campo hanno utilizzato anche morfologia “ferrovia” traccia per identificare desmosomi in immagini SIM (vedi per esempio: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). La dimensione e l’organizzazione di queste strutture, come rivelato da SIM, è pienamente coerente con le definizioni classiche EM di desmosomi. Abbiamo misurato l’intensità dei pixel per le due cadherine (Ecad o Dsg2) all’interno di queste strutture utilizzando l’analisi delle immagini standard. Importante, non stiamo cercando di rivendicare la co-localizzazione. Piuttosto, stiamo misurando il reclutamento della cadherina ai domini di membrana che visualizzano i modelli di colorazione della strada ferrata DP. Ci rendiamo conto che a volte è difficile discernere le tracce della ferrovia ai primi punti del tempo. Per questo motivo, il primo tempo abbiamo ritenuto che potevamo identificare bona fine ferroviario colorazione traccia era a 1 ora. Inoltre, stiamo facendo solo misurazioni in luoghi in cui possiamo osservare modelli di binari, piuttosto che punti di DP. Infine, la nostra scoperta che Ecad è presente nei desmosomi nascenti è coerente con i classici esperimenti immuno-EM che mostrano che Ecad può localizzarsi ai desmosomi (Jones, 1988). Pertanto, ci sentiamo fiduciosi nella nostra capacità di identificare i desmosomi e di misurare i livelli relativi delle due cadherine in tempi diversi.
4) Lascio questo punto finale a discrezione dell’editore. A mio parere, i dati di colocalizzazione, anche se presi per veri, non stabiliscono la rilevanza funzionale. Sarebbe molto bello vedere un esperimento di abbattimento/ricostituzione con E-caderina L175D. La predizione è che questa molecola non colocalizzerebbe mai con la desmoplakin, indipendentemente dall’età della giunzione. La violazione di questa previsione metterebbe in dubbio il modello preferito dagli autori.
Sulla base del suggerimento del revisore, abbiamo ora eseguito esperimenti per testare direttamente il ruolo delle diverse mutazioni del dominio extracellulare Ecad nell’impedire il reclutamento di DP e Dsg2 nei cheratinociti. Questi dati sono descritti nella sottosezione “Ecad L175 è essenziale per il reclutamento intercellulare efficiente di Dsg2 e l’assemblaggio del desmosoma”. Le immagini corrispondenti sono mostrate in Figura 5 e in Figura 5-figura supplemento 1. I metodi utilizzati sono descritti nella sottosezione “Isolamento, cultura, trasfezione e imaging confocale di cheratinociti primari”. Per questi esperimenti, abbiamo usato cheratinociti di topo EKO/PKD, che esprimono praticamente nessuna cadherina classica. Abbiamo precedentemente dimostrato che questi cheratinociti EKO/PKD non sono in grado di assemblare AJ e desmosomi a causa della perdita di tutte le cadherine classiche (Michels et al., 2009). Queste cellule ci permettono quindi di valutare direttamente la capacità dei mutanti Ecad di i) iniziare la formazione di AJ e ii) valutare la loro capacità di reclutare componenti desmosomiali ai siti di formazione iniziale del contatto cellula-cellula.
Siccome eravamo interessati a valutare la capacità dei mutanti Ecad di reclutare proteine desmosomiali all’inizio della formazione della giunzione, abbiamo espresso Ecad WT o mutanti a lunghezza intera nei cheratinociti EKO/PKD e abbiamo analizzato il reclutamento di DP e Dsg2 nei siti di contatti intercellulari usando la microscopia confocale. Per esaminare il reclutamento in diversi stadi di formazione e maturazione della giunzione, i cheratinociti sono stati fissati e immunocolorati per DP, Dsg e Ecad in tre momenti dopo l’interruttore Ca2+ (3 ore, 6 ore e 18 ore).
I nostri dati hanno mostrato che 3 ore dopo l’interruttore Ca2+, il 93% di WT-Ecad era arricchito in zipper-like early AJs in siti di contatti intercellulari. Al contrario, solo il 48% dei cheratinociti L175D-Ecad trasfettati formava cerniere AJ, probabilmente a causa di una ridotta formazione di cis-dimero Ecad (Figura 5 A, B). A questi primi punti di tempo dopo l’interruttore Ca2 +, 66% e 91% dei contatti cerniera WT-Ecad erano positivi per Dsg2 e DP rispettivamente (Figura 5 A, C, D, E). Quando le cellule sono stati autorizzati a impegnarsi in Ca2 +-dipendente adesione intercellulare per 18 ore, le localizzazioni giunzione di Ecad-Dsg2 e Ecad-DP aumentato al 97% e 100% rispettivamente (Figura 5 A, C, D, E). Al contrario, solo il 39% dei contatti cerniera indotta da L175 ha mostrato il reclutamento Dsg2 3 ore dopo il passaggio ad alta Ca2 + che è aumentato al 65% a 18 ore (Figura 5 A, C), confermando che una interazione diretta tra Ecad e Dsg2 è necessario per il reclutamento efficiente di Dsg2 ai primi contatti intercellulari. Allo stesso modo, dopo 3 ore, solo il 28% di L175D-Ecad mutante stabilito contatti intercellulari erano positivi per DP, che è stato aumentato al 72% dopo 18 ore, suggerendo un meccanismo di compensazione in fasi successive (Figura 5 D, E).
Per confermare che l’effetto osservato della mutazione L175D non era dovuto alla formazione ostacolata di AJ, abbiamo trasfettato i cheratinociti EKO/PKD con il mutante Ecad-K14E full-length che abolisce la formazione di X-dimero e intrappola Ecad in una conformazione dimerica strand-swap. I nostri dati hanno mostrato che solo il 4% delle cellule trasfettate contatto formato cerniere all’inizio (3 ore) timepoints dopo il passaggio a Ca2 + alto con solo il 24% delle cellule trasfettate contatto mostrando cerniere in ritardo (18 ore) punti di tempo (Figura 5 A, B, Figura 5-figura supplemento 1), confermando che K14 è essenziale per la formazione efficace AJ, e quindi stabilimento contatto intercellulare. Tuttavia, i pochi K14E AJs che sono stati formati, reclutato Dsg2, e soprattutto DP, in modo più efficiente di L175D (Figura 5 A, C, E, Figura 5-figure supplement 1). Questo risultato ha confermato che il reclutamento ritardato di Dsg2 ai contatti intercellulari non era il risultato dell’incapacità di Ecad L175D di formare efficientemente AJs ma piuttosto dovuto all’assenza di interazione diretta tra Ecad e Dsg2. Come non c’è mai stato alcun co-localizzazione di DP e Ecad in assenza di cerniere (Figura 5-figura supplemento 1), i dati suggeriscono anche che le interazioni trans Ecad precedono le interazioni Ecad/Dsg2. Questa conclusione è ulteriormente rafforzata dalla nostra scoperta che nessun reclutamento DP è stato osservato dopo l’abolizione trans adesione Ecad, e quindi cerniere, trasfettando il full-length Ecad-DM (W2A-K14E doppio mutante, Figura 5-figura supplemento 1) in cheratinociti EKO/PKD. Presi insieme questi risultati confermano che l’aminoacido L175 media le interazioni Dsg2 e facilita la formazione del complesso desmosoma precoce nelle cellule.
Relatore #2:
1) La scoperta che E-caderina residuo L175 è fondamentale per l’interazione con Dsg2 è intrigante. Tuttavia, nessun residuo partner di interazione è stato identificato. In questa circostanza, prevedere una conformazione per l’interazione E-caderina/Dsg2 tramite docking sembra precario; sembra incerto che la conformazione prevista si riferisca alla vera conformazione legata.
Siamo d’accordo con il recensore che i dati di docking della proteina sono speculativi e quindi abbiamo eliminato questi risultati dal manoscritto.
2) C’è solo una tenue connessione tra l’interazione Dsg2/E-caderina proposta e la biologia dell’assemblaggio del desmosoma. Eppure gli autori sembrano avere una chiara strada da seguire. Essi sostengono che la presenza di E-caderina nei desmosomi nascenti (valutata sperimentalmente con la co-colorazione per la desmoplakin nella Figura 5) è la prova del ruolo dell’associazione Dsg2/E-caderina che hanno identificato. Ora che hanno identificato un mutante che impedisce tale associazione, gli esperimenti della Figura 5 eseguiti con il mutante dovrebbero portare a risultati diversi. Questo esperimento aggiungerebbe sostanzialmente al rigore di questo articolo.
Come descritto nella risposta 4 al recensore 1, abbiamo espresso Ecad WT a lunghezza intera e i mutanti Ecad nei cheratinociti EKO/PKD e abbiamo analizzato il reclutamento di Dsg2 e DP ai siti di contatti intercellulari. Questi risultati confermano che l’aminoacido L175 media le interazioni Dsg2 e facilita la formazione precoce del complesso desmosoma nelle cellule. Questi dati sono descritti nella sottosezione “Ecad L175 è essenziale per il reclutamento intercellulare efficiente Dsg2 e l’assemblaggio desmosoma” del manoscritto. Le immagini corrispondenti sono mostrate in Figura 5 e in Figura 5-figura supplemento 1. I metodi utilizzati sono descritti nella sottosezione “Isolamento, cultura, trasfezione e imaging confocale di cheratinociti primari”.
Relatore #3:
1) Questo manoscritto identifica e caratterizza un’interazione molecolare tra E-caderina e Desmoglein 2 utilizzando proteine isolate e mostra una maggiore colocalizzazione tra queste due molecole nei cheratinociti all’inizio durante l’assemblaggio del desmosoma. Queste sono osservazioni potenzialmente molto interessanti che possono spiegare come le cadherine classiche controllano l’assemblaggio dei desmosomi. Anche se questo è ben documentato da diversi gruppi in letteratura, i meccanismi sottostanti sono ancora per lo più sconosciuti. Tuttavia, la loro conclusione “I nostri esperimenti integrati di singola molecola, le previsioni di docking proteico-proteico e l’imaging di super risoluzione basato sulle cellule dimostrano che le interazioni Ecad/Dsg2 giocano un ruolo importante nell’assemblaggio precoce dei desmosomi” dichiarata all’inizio della sezione Discussione è un’esagerazione piuttosto forte, dato che l’interazione è basata sulla caratterizzazione su domini extracellulari isolati e sulla microscopia statica anche se ad alta risoluzione. Nessun esperimento è fatto per dimostrare che quando si perturba questa interazione l’assemblaggio del desmosoma è effettivamente compromesso, che a mio parere sarebbe il minimo per rendere questa serie di dati davvero interessante e rilevante per un vasto pubblico.
Come descritto nella risposta 4 al recensore 1, ora abbiamo espresso Ecad WT a lunghezza intera e i mutanti Ecad nei cheratinociti EKO/PKD e abbiamo dimostrato che l’aminoacido L175 media le interazioni Dsg2 e facilita la formazione precoce del desmosoma nelle cellule come valutato dal reclutamento DP. Questi dati sono descritti nella sottosezione “Ecad L175 è essenziale per il reclutamento intercellulare efficiente di Dsg2 e l’assemblaggio del desmosoma” del manoscritto. Le immagini corrispondenti sono mostrate in Figura 5 e in Figura 5-figura supplemento 1. I metodi utilizzati sono descritti nella sottosezione “Isolamento, cultura, trasfezione e imaging confocale di cheratinociti primari”.
2) Inoltre, alla luce del fatto che l’interazione è indipendente dal calcio mentre classica cadherina dipendente assemblaggio desmosoma presto richiede la presenza di calcio (che non è discusso a tutti).
Ringraziamo il revisore per questo commento perspicace. Come descritto nella sottosezione “Ecad L175 è essenziale per un efficiente reclutamento intercellulare Dsg2 e l’assemblaggio del desmosoma”, l’imaging confocale di Ecad mutante espresso in cheratinociti di topo rivela ora che l’assemblaggio del desmosoma è iniziato nei siti di omodimerizzazione trans Ecad dipendente dal Ca2+. Sulla base dei nostri dati, proponiamo un modello per cui l’assemblaggio del desmosoma è facilitato sia dalle interazioni dirette cis di Ecad e Dsg2 che dal legame trans di Ecad opposto. Nel nostro modello, l’omodimerizzazione trans di Ecad da cellule opposte serve come spunto spaziale per coordinare l’assemblaggio del desmosoma. Ecad forma successivamente complessi dimer cis con Dsg2. Una volta localizzato all’interno del desmosoma nativo, Dsg2 si dissocia da Ecad e si lega a Dsc2 per formare desmosomi maturi. Poiché il complesso Dsc2/Dsg2 ha una vita più lunga sia del complesso Ecad/Dsg2 che del complesso Dsc2/Dsc2, questo probabilmente permette una robusta adesione cellula-cellula e permette al desmosoma maturo di resistere alla forza meccanica. Questo modello è descritto nella Figura 6, e nella sezione Discussione.
3) Poiché questa è un’interazione completamente nuova di bassa affinità, è probabilmente difficile fare dei saggi di interazione nel contesto di cellule in cui una cellula esprime E-caderina e l’altra Dsg2 per esaminare se c’è qualche interazione. Tuttavia, poiché i loro dati sono parzialmente basati sulla modellazione, gli autori dovrebbero anche generare un mutante in cui A125 e A124 sono mutati per fornire prove molto migliori per l’esistenza della proposta di y-dimeri.
Siccome i risultati di docking della proteina non sono robusti, abbiamo eliminato questi dati dal manoscritto. Tuttavia, i nostri esperimenti con i cheratinociti EKO/PKD che mostrano che la mutazione dell’aminoacido L175 su Ecad compromette il reclutamento di Dgs2 e specialmente di DP ai siti di formazione precoce del contatto, dimostra che Ecad-L175 facilita la formazione del desmosoma nelle cellule, conferma i nostri risultati biofisici.
Sommario:
I revisori ritengono che mentre i dati biofisici sono convincenti, un’analisi quantitativa più rigorosa è necessaria per sostenere le conclusioni fatte dai dati nelle figure 3 e 5. In linea di principio queste preoccupazioni possono essere affrontate con ulteriori analisi dei dati piuttosto che con esperimenti, e in questo caso, prenderemmo in considerazione un manoscritto rivisto.
Ringraziamo l’editore per questa recensione incoraggiante. Come descritto di seguito, il nostro manoscritto rivisto affronta tutte le questioni evidenziate.
1) La conclusione che l’interazione E-caderina-Dsg è necessaria per la formazione iniziale del desmosoma si basa sulla colocalizzazione di Dsg e E-caderina che diminuisce con la maturazione della giunzione. Tuttavia, in Figura 3 non è chiaro se la colocalizzazione osservato con DP è significativo al di là di quello previsto dal caso o deriva da cambiamenti dipendenti dal tempo in E-caderina localizzazione subcellulare non correlati alla maturazione giunzione. In Figura 3C, gli esperimenti di controllo mostrati nel pannello di destra evidenziano la co-localizzazione di Dsg2 e DP – noti componenti Desmosome – e mostrano una stretta corrispondenza nei segnali di fluorescenza in tutti e tre i punti temporali. Al contrario, mentre l’espressione di E-caderina e DP nei pannelli di sinistra sembra sovrapporsi in una certa misura, non mostrano la corrispondenza nei segnali osservati per gli esperimenti di controllo. La risposta ai punti di revisione originale su questo argomento (ad esempio il recensore 1, punto 3) si concentra sulla definizione di un desmosoma, ma non affronta il punto di cui sopra.
Vorremmo chiarire che non stiamo misurando co-localizzazione ma invece il reclutamento di Ecad o Dsg2 alle regioni della membrana che mostrano un DP ‘binario ferroviario’ modello. Per rendere questo più chiaro, abbiamo modificato il manoscritto rivisto per sottolineare che Ecad è ‘arricchito nei desmosomi nascenti’ piuttosto che essere ‘escluso dai desmosomi maturi’.
Per affrontare direttamente le preoccupazioni dei revisori per quanto riguarda la nostra misurazione dell’arricchimento di Ecad nei desmosomi, ora mostriamo che i livelli relativi di Ecad lungo l’intero confine cellulare (Ecad: rapporto DP ai confini cellulari) rimangono invariati nel tempo. Questi dati confermano che l’arricchimento Ecad all’interno delle tracce ferroviarie DP ai primi punti di tempo è specifico per le regioni desmosomiali della membrana ed è significativo al di là di quello previsto dal caso casuale o a causa di cambiamenti nella localizzazione di E-caderina non correlati alla maturazione della giunzione. I dati sono mostrati nella Figura 3-figure supplement 1 e sono descritti nella sottosezione “Ecad è presente nei desmosomi nascenti ma non nei desmosomi maturi”.
Infine, poiché le scansioni di linea mostrate nella Figura 3 erano confuse, abbiamo eliminato le scansioni di linea dal manoscritto rivisto. Invece, nella Figura 3B, ora mostriamo diverse immagini rappresentative delle regioni desmosomiali nei cheratinociti umani coltivati in mezzi ad alto Ca2+ per 1, 3 o 18 ore. Questi risultati sottolineano il principale messaggio “take-away” della Figura 3C: I livelli di Ecad sono arricchiti nei desmosomi nascenti, con livelli relativi che diminuiscono man mano che i desmosomi maturano.
2) Preoccupazioni simili sono state sollevate riguardo alla figura 5, che dovrebbe mostrare che Ecad L175 è essenziale per un efficiente reclutamento intercellulare di Dsg2 e per l’assemblaggio del desmosoma. Le immagini nel pannello A mostrano infatti una drammatica differenza nella localizzazione di Dsg2 e DP rispetto alla cadherina WT o mutante. Mentre Dsg2 e DP co-localizzano con WT o K14E Ecad alle giunzioni, rimangono in puncta separati che fiancheggiano la giunzione L175D Ecad e non co-localizzano con esso. Tuttavia, non è chiaro che cosa gli autori hanno quantificato per testare il significato di questo fenotipo. In B, che cosa è “% di giunzione che forma contatti”? Come viene definito un contatto? Quali giunzioni stanno misurando? AJ o desmosomi? In C ed E, cosa intendono per % di giunzioni positive per Dsg2 o DP? Come sono state definite le giunzioni?
Abbiamo aggiunto un pannello di figure (Figura 5-figure supplement 1A) per illustrare i criteri di quantificazione e le categorie di giunzioni che sono stati utilizzati nella nostra analisi. Questo pannello mostra esempi di cellule trasfettate con Ecad mutante che non (pannello sinistro) o fare (pannello destro) mostrano la formazione intercellulare AJ. Per il reclutamento Dsg2 o DP, abbiamo quantificato solo quelle interfacce intercellulari in cui sono state osservate cerniere AJ. Negli inserti del pannello della figura, mostriamo esempi di contatti positivi AJ che sono positivi per DP o negativi per DP.
Nella sottosezione “Ecad L175 è essenziale per un efficiente reclutamento intercellulare Dsg2 e l’assemblaggio desmosoma” del manoscritto, ora affermiamo che la capacità dei cheratinociti trasfettati di formare AJ è stata prima valutata dalla formazione di modelli ‘zipper-like’ di Ecad a contatti intercellulari. Abbiamo precedentemente dimostrato che queste cerniere rappresentano le prime AJ e reclutano proteine marcatrici AJ come la vinculina (Rübsam et al., 2017). Abbiamo esaminato solo interfacce intercellulari con cerniere AJ, per la loro capacità di reclutare Dsg2 e DP a questi contatti. Importante, non abbiamo mai osservato alcun arricchimento di componenti desmosomal a contatti intercellulari in assenza di cerniere AJ (Michels et al., 2009).
Come descritto nella risposta 3a sotto, ora discutiamo nella sezione discussione che anche se Dsg2 e DP mostrano qualche co-localizzazione a Ecad-positivi cerniere entro 3 ore, c’è anche non sovrapposizione colorazione giunzione suggerendo che AJs e desmosomi sono già iniziando a segregare in distinte giunzioni intercellulari. Non abbiamo quantificato questa co-localizzazione nel nostro manoscritto, dal momento che il punto principale dei nostri esperimenti sono stati per mostrare la rilevanza di L175 per il reclutamento Dsg2 alle interfacce intercellulari e facilitare la formazione desmosoma (come illustrato dal reclutamento DP ai contatti intercellulari). Crediamo che il ritardo nel reclutamento tra WT, L175 mutante, e il mutante K14, che è quantificato nella Figura 5, illustra questo punto.
3) Ci sono anche modifiche alla sezione Introduzione e discussione necessarie per affrontare i punti di cui sopra così come l’accessibilità della carta:
a) Relativo ad essere punti di cui sopra, il legame tra gli esperimenti di legame in vitro e il ruolo biologico proposto sembra tenue sulla base di studi di localizzazione che rivelano sovrapposti ma non veramente co-localizzati modelli di colorazione. Gli autori devono spiegare questo risultato; forse la co-localizzazione è dinamica, e/o solo un sottoinsieme di molecole di E-caderina è legato a Dsg2. Questo punto almeno deve essere discusso per razionalizzare i risultati degli esperimenti di localizzazione con il modello proposto.
A causa della natura transitoria delle interazioni Ecad/Dsg2, le proteine desmosomiali reclutate nelle giunzioni dovrebbero rapidamente segregarsi da Ecad. Di conseguenza, le immagini di interfacce intercellulari sono tenuti ad avere sia sovrapposizione e separati Ecad e desmosomal proteina colorazione modelli. In accordo, anche se Dsg2 e DP mostrano qualche co-localizzazione a Ecad-positivi cerniere (Figura 5), significativo non sovrapposizione colorazione giunzione è osservato, anche entro le prime 3 ore. Questo suggerisce che AJs e desmosomi rapidamente segregare in distinte giunzioni intercellulari. Ora dichiariamo questo nella sezione Discussione.
b) All’inizio della sezione Discussione gli autori affermano che: “identificare due eventi critici che iniziano e promuovono un efficiente assemblaggio del desmosoma: (i) l’omodimerizzazione trans stabile di Ecad, e (ii) il legame diretto eterofilo degli ectodomini di Ecad e Dsg2. I nostri dati dimostrano che l’assemblaggio del desmosoma è iniziato nei siti di trans omodimerizzazione di Ecad. Successivamente, Ecad e Dsg2 si legano attraverso un conservato Leu 175 sull’interfaccia di legame cis di Ecad e formano complessi eterofili di breve durata che si localizzano ai primi desmosomi e reclutano efficacemente le proteine desmosomiali ai siti di formazione del contatto intercellulare. Quando i desmosomi maturano, Dsg2 si dissocia da Ecad e forma legami stabili con Dsc2 per mediare una robusta adesione”. – Questo paragrafo mescola osservazioni, interpretazione e modelli ipotetici e come tale è fuorviante. Dovrebbero separare il riassunto dei risultati dall’interpretazione e dal loro modello.
Come suggerito dai revisori, abbiamo eliminato le interpretazioni dal primo paragrafo della sezione Discussione e ora riassumiamo solo i risultati.
c) Gli autori scrivono nell’Abstract e nell’Introduzione “Ecad interagisce con Dsg2 attraverso un Leu 175 conservato sull’interfaccia di legame cis di Ecad”. – Gli autori non dovrebbero dare per scontato che i lettori abbiano familiarità con le interazioni omofile di E-cad e dovrebbero spiegarlo esplicitamente.
Nell’Abstract, ora dichiariamo che ‘Studi precedenti dimostrano che E-caderina (Ecad), una proteina adesiva che interagisce sia in conformazioni trans che cis, facilita l’assemblaggio del desmosoma attraverso un meccanismo sconosciuto’.
Inoltre, nell’Introduzione, ora dichiariamo: ‘Poiché Ecad interagisce lateralmente per formare cis-dimeri sulla stessa superficie cellulare (Harrison et al., 2011) mentre le molecole Ecad da cellule opposte interagiscono in una conformazione dimer trans strand-swap (Boggon et al., 2002; Parisini et al, 2007; Vendome et al., 2011) e una conformazione trans X-dimero (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), abbiamo usato mutanti che specificamente abolire Ecad trans o cis interazioni e testato il loro legame a Dsg2 o Dsc2 ‘. Infine, nell’introduzione, ora affermiamo che ‘Precedenti studi strutturali hanno dimostrato che L175 media la dimerizzazione cis omofila di Ecad (Harrison et al., 2011)’.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013