Produzione di albumina umana nei maiali tramite CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
L’albumina sierica umana (HSA) è la proteina plasmatica più abbondante che svolge funzioni omeostatiche critiche nella fisiologia umana tra cui il mantenimento della pressione oncotica plasmatica, la regolazione della distribuzione dei fluidi corporei, il trasporto di piccole molecole, ecc1. Viene prescritto per una serie di malattie gravi come l’insufficienza epatica e lo shock traumatico2. A causa della carenza di sangue umano e dei rischi associati al sangue umano, la produzione alternativa di albumina umana è stata a lungo ricercata. Ricombinante produzione HSA è stato tentato in precedenza nei maiali attraverso l’espressione dominante transgene sotto forma di fusione albumina-GFP3. Tuttavia, in approcci transgenici, a causa della presenza di albumina suina endogena, separazione e purificazione del rHSA sono problematici. Approfittando della potenza del sistema CRISPR/Cas9 nella modifica del genoma, abbiamo cercato di produrre rHSA nei maiali attraverso bussare albumina umana cDNA in suino albumina locus. Inserendo il cDNA dell’albumina umana più la sequenza di segnale polyA di SV40 (2368 bp totali) nel locus dell’albumina suina immediatamente a valle del codone di partenza, ci aspettiamo che l’albumina umana venga espressa sotto il controllo trascrizionale dell’albumina endogena suina e allo stesso tempo che blocchi l’espressione dell’albumina endogena suina (Fig. 1a). Abbiamo progettato un sgRNA mirato alla regione del codone di partenza (immediatamente 5′ di e tra cui ATG) e generato un frammento di targeting (donatore per la ricombinazione omologa) con l’inserto fiancheggiato da sequenze di omologia 1 kb su entrambi i lati (Fig. 1a). Poiché la sequenza di omologia 5′ utilizzato nel donatore corre fino al codone di partenza, contiene la sequenza sgRNA e quindi può essere mirato dal sgRNA come donatore o l’allele knockin dopo ricombinazione omologa. Per evitare che questo accada, abbiamo inserito 6 bp (gccacc) nella sequenza sgRNA proprio prima del codone iniziale. L’sgRNA è stato trascritto in vitro, purificato e iniettato negli ovociti fecondati insieme a Cas9 mRNA4 e al vettore circolare contenente il frammento di targeting. La fonte degli ovociti era Bama minipig5. Gli embrioni iniettati sono stati coltivati per 1-2 ore prima di essere impiantati in femmine sincronizzate con l’estro. ~Sono stati impiantati circa 300 embrioni in 10 femmine, 5 delle quali sono rimaste incinte e hanno partorito un totale di 16 cuccioli vivi. I cuccioli sono stati sottoposti a cure standard e non hanno mostrato alcun segno di problemi di salute insoliti.
Knockin di ALB umano nel locus Alb suino.
(a) Schema della strategia knockin. (b) Genotipizzazione dei fondatori. I primer PRC sono illustrati in (a). (c) Risultati del sequenziamento dei prodotti PCR ottenuti con la coppia di primer e/f (a). I prodotti sono stati clonati e fino a 12 cloni (per #9) sono stati sequenziati.
Abbiamo tagliato le punte delle orecchie dei 16 suinetti quando avevano circa 4 settimane e abbiamo ottenuto il DNA genomico per la genotipizzazione. Per determinare se avevamo avuto successo nel knockin, abbiamo valutato entrambe le estremità 5′ e 3′ del sito di inserimento. Abbiamo usato due coppie di primer, a/b e c/d (Fig. 1a). Il primer a è fuori dall’estremità 5′ dell’omologia usata e b è su ALB umano (l’inserto); c è su ALB umano e d fuori dall’estremità 3′ dell’omologia. Come mostrato in Fig. 1b, tutti i 16 suinetti portano l’allele knockin previsto. Abbiamo clonato e sequenziato tutti i frammenti di DNA amplificati. Erano i prodotti di ricombinazione omologhi attesi (Fig. S1). Successivamente, abbiamo determinato lo stato dell’allele wild-type in questi maialini. I primer e e f (contenuti nell’inserto) (Fig. 1a) dovrebbero amplificare un frammento di 705 bp dal locus wildtype e un frammento di 3085 bp dall’allele knockin. Come previsto, tutti hanno generato il frammento di 3085 bp. Tuttavia, inaspettatamente, abbiamo potuto ottenere il frammento apparente di 705 bp wildtype solo da 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 e 15) dei 16 campioni, mentre gli altri hanno generato prodotti deboli intorno ai 700 bp (Fig. 1b). L’apparente mancanza dell’allele wildtype in alcuni suinetti suggerisce che il knockin potrebbe essere avvenuto su entrambi gli alleli. In alternativa, l’allele wildtype potrebbe essere stato modificato in modo tale che il primer a sequenza è stato eliminato, con conseguente fallimento di amplificare l’allele wildtype. In effetti, l’editing sull’allele wildtype è avvenuto perché la dimensione dei frammenti amplificati differiva dai 705 bp previsti in alcuni suinetti (Fig. 1b). Per confermarlo, abbiamo clonato e sequenziato tutti i frammenti amplificati. Come mostrato in Fig. 1c, tutti sono stati modificati, anche se alcuni erano solo pochi cambiamenti di coppia di base (quindi sembravano essere a 705 bp). Tra questi alleli modificati, quelli trovati nel maialino #10 e #12 sono interessanti. Quello in #10 era il prodotto della sostituzione di un tratto di 29 bp (dall’ATG verso l’estremità 3′) della sequenza del maiale con 36 bp (6 bp 5′ dell’ATG e 26 bp dopo) della sequenza del donatore. Non è chiaro come questo sia successo. In #12, ci sono due diversi alleli modificati, che mette il numero totale di alleli a 3, indicando mosaicismo in questo maialino, che non è raro come mosaicismo è stato spesso trovato in animali generati tramite iniezione zigote di Cas9/sgRNA6,7,8,9,10.
Per determinare se off-targeting si era verificato con il sgRNA, abbiamo scelto 4 top potenziali off-target siti basati su suggerimenti da CRISPR design tool (http://tools.genome-engineering.org) e amplificato frammenti contenenti questi siti dal DNA genomico punta dell’orecchio del maialino #14. I frammenti sono stati sottoposti a T4EN I test4. Come mostrato in Fig. S2, nessun editing off-target è stato trovato. Tuttavia, non abbiamo potuto eliminare la possibilità che off-target editing è accaduto in altri loci o in altri 15 maiali transgenici. Tuttavia, anche se c’erano editing off-target, è improbabile che i loci modificati siano problematici per il nostro scopo di produrre rHSA, fino a quando non interferiscono con il benessere di questi maiali transgenici.
Avendo dimostrato successo knockin dell’ALB umana, abbiamo cercato di determinare se l’albumina umana potrebbe essere rilevata nel plasma sanguigno di questi maialini knockin. Come mostrato in Fig. 2a, tutti i suinetti contenevano albumina umana nel loro plasma sanguigno rilevabile con gli anticorpi specifici contro l’albumina umana, anche se a livelli variabili, che è probabilmente il risultato di almeno due fattori, se entrambi gli alleli sono knockin e il grado di mosaicismo (soprattutto nel fegato). Il livello nel #7 è molto basso visibile solo dopo una lunga esposizione del blot, nonostante l’apparente mancanza dell’allele Alb suino wild-type (Fig. 1a). Nel complesso, i livelli sono molto più bassi di quelli nei sieri umani adulti. È noto che la concentrazione di albumina nel sangue nei suini aumenta con l’età, raggiungendo un livello simile a quello degli esseri umani adulti entro i 6 mesi di età11.
Analisi di ALB umana nel sangue.
(a) rilevamento Western blot di albumina umana nel sangue di suinetti fondatori. 0,5 μl di plasma di ogni fondatore sono stati separati su SDS-PAGE e analizzati. Il plasma di sangue umano (0,5 μl dopo essere stato diluito 30 volte) è stato usato come controllo positivo. C, plasma da un maiale wildtype. (b) Illustrazione dei peptidi triptici (verde) rilevati con l’analisi mass spec. (c) Semi-quantitazione di due peptidi triptici da albumina umana e suina attraverso la misurazione delle aree di picco di ciascun peptide. Il rosso indica i residui aminoacidici che sono specifici del maiale.
Per confermare che l’rHSA rilevato nel plasma dei nostri suinetti knockin con anticorpi è veramente albumina umana, abbiamo sottoposto due campioni di plasma (suinetto #2 e #6) all’analisi spettrale di massa. #2 è apparentemente omozigote per l’allele knockin e #6 contiene un allele knockin e uno mutante (frameshift) (Fig. 1). 0,5 μl di plasma è stato separato su SDS-PAGE e proteine intorno 70 KD sono stati in-gel digerito con tripsina. I peptidi triptici sono stati eluiti dal gel, essiccati e ri-dissociati per la separazione mediante cromatografia liquida e l’analisi mass spec. Per il maialino n. 2, abbiamo potuto rilevare 14 peptidi tripticati umani unici ALB e 15 per il n. 6 (Fig. 2b). M / Z spettri per il peptide umano FKDLGEENFK e maiale peptide FKDLGEQYFK (entrambi da maialino # 2) sono stati mostrati in Fig. S3. Due peptidi sono stati scelti per la quantificazione misurando le aree dei picchi. In accordo con i risultati del western blot, questi due peptidi erano molto più (~ 5 volte) abbondanti in #2 che in #6 (Fig. 2c). Questi risultati dimostrano che il rHSA rilevato dagli anticorpi è autentica albumina umana.
Genotipizzazione del DNA isolato dalle punte delle orecchie indica che sia #2 e #6 non contengono alcun allele Alb maiale wildtype, o non presente o modificato (Fig. 1b,c). Tuttavia, potremmo ancora rilevare peptidi triptici da albumina suina in entrambi i campioni, ma in abbondanza molto più bassa (Fig. 2c). È interessante notare che l’abbondanza di peptidi di maiale era circa lo stesso tra i due campioni, nonostante che l’abbondanza di peptidi umani differiva notevolmente. Questi risultati suggeriscono che entrambi i suinetti contengono un numero simile di epatociti wildtype (o eterozigoti) che sono responsabili dell’ALB suino rilevato nel sangue di questi due suinetti. Tuttavia, tali cellule contenenti l’allele wildtype potrebbero non esistere o esistere in una percentuale estremamente bassa nelle punte delle orecchie in modo che l’allele wildtype non possa essere amplificato tramite PCR. Inoltre, l’analisi Southern blot con una sonda interna (3′ metà del CDS ALB umano) ha indicato la presenza di un ulteriore inserimento della sequenza del donatore nei suinetti #1, 4 e 5 (Fig. S4). Tutte queste complicazioni non saranno un problema per lo scopo di produrre albumina umana ricombinante come l’allele knockin può essere purificato attraverso backcrossing.
Per determinare se l’allele knockin può essere trasmesso alla prossima generazione, abbiamo incrociato #2 (maschio, omozigote) con #5 (femmina, eterozigote) quando sono diventati riproduttivamente maturi. Dall’incrocio sono nati 6 cuccioli. 4 di loro (#1, 3, 4 e 6) sono omozigoti per l’allele knockin (AlbH/H, H indica l’uomo) e 2 (#2 e 5) eterozigoti (AlbP/H, P indica il maiale) (Fig. 3a). # 5 e 6 sono morti di diarrea circa 2 settimane dopo la nascita. Abbiamo analizzato l’espressione dell’albumina umana nel sangue dei suinetti rimanenti a 4 settimane di età. Come mostrato in Fig. 3b, tutti loro hanno albumina umana nel sangue. È interessante notare che il livello di albumina umana nell’animale eterozigote (#2) era molto più basso di quello degli omozigoti. Non sappiamo se questo è il risultato di una variazione individuale o se l’allele knockin è in qualche modo soppresso dall’allele wildtype.
Trasmissione in linea diretta dell’allele knockin.
(a) Genotipizzazione PCR della prole F1. I primer utilizzati sono gli stessi della Fig. 1. (b) Rilevamento Western blot di albumina umana nel sangue dei suinetti F1. 0,5 μl di plasma di ogni maialino sono stati separati su SDS-PAGE e analizzati. C, plasma da un maiale wildtype. M, marcatore di peso molecolare.
Mostriamo qui il successo della generazione di maiali portatori di cDNA ALB umano abbattuto nel locus Alb suino. Questo è un passo avanti rispetto al semplice gene editing in zigoti di maiale riportato recentemente da Hai et al.12 e noi13. Grandi animali addomesticati sono stati perseguiti come bioreattori per prodotti proteici biomedici14,15,16,17,18,19,20. Di solito, le sequenze codificanti di queste proteine sono state inserite casualmente insieme ai necessari elementi di controllo della trascrizione nel genoma come transgeni, che è associato a molte complicazioni tra cui la natura a breve termine di espressione del transgene. La nostra dimostrazione che la ricombinazione omologa può avvenire in modo altamente efficiente negli zigoti di maiale apre la porta allo sviluppo di bioreattori sempre migliori e di ceppi di bestiame con tratti sempre più desiderabili.