ヘモグロビンとその測定
正常な細胞機能は、酸素の継続的な供給によって成り立っています。 細胞の代謝で酸素が消費されると、二酸化炭素が発生します。
血液の主な機能は、肺から体内の各細胞に、吸気中に存在する酸素（O2）を送り、細胞から肺に二酸化炭素（CO2）を送り、呼気で体外に排出することである。
これらの重要なガス輸送機能は、赤血球に含まれるヘモグロビンというタンパク質に依存しています。
1.ヘモグロビンの構造と機能
ヘモグロビン（Hb）分子はほぼ球状で、2対の異種サブユニットから構成されています（図1）。
それぞれのサブユニットは折りたたまれたポリペプチド鎖（グロビン部分）で、ヘム基（ポルフィリンに由来）が付着している。
それぞれのヘム基の中心には、第一鉄（Fe2+）の状態の鉄の原子が1つずつある。 このようにヘムは金属ポルフィリンであり、ちなみに血液の赤色はこのためである。
図1：酸素化ヘモグロビン（HbA）構造の概略
Hbの酸素結合部位は、4本のポリペプチド鎖のそれぞれに存在するヘムのポケットであり、酸素1原子がこれらの部位で鉄と可逆結合するので、Hb1分子は酸素分子4つと結合し、生成物として酸素ヘモグロビン（O2Hb）ができる。
Hbの酸素運搬機能、すなわち肺で酸素を「拾い」、組織細胞に「放出」する能力は、ヘモグロビン分子内で起こる四次構造の微細な構造変化によって可能となり、それによってヘムポケットの酸素への親和性が変化する。 ヘモグロビンには、デオキシ状態（酸素親和性が低い）とオキシ状態（酸素親和性が高い）の2つの四次構造状態がある。
さまざまな環境因子がHbの四次構造を決定し、その結果、相対的な酸素親和性が決定される。 肺の微小環境は酸素四元状態を好むため、Hbはここで酸素と高い親和性を持つ。
対照的に、組織の微小環境はHb構造の構造変化を誘導して酸素に対する親和性を低下させ、その結果、組織細胞に酸素を放出させることができるようになる。
1.1. ヘモグロビンと二酸化炭素の除去
少量（最大20％）の二酸化炭素は、ヘモグロビンの4つのグロビンポリペプチド単位のN末端アミノ酸に緩く結合して組織から肺に輸送される；この結合の産物はカルバミノヘモグロビンである。 しかし、ほとんどのCO2は血漿中では重炭酸塩として輸送される。
このCO2輸送の様式に必要な、赤血球によるCO2の重炭酸への変換は、水素イオン（H+）の産生をもたらします。 これらの水素イオンは脱酸素化ヘモグロビンによって緩衝される。
酸素と二酸化炭素の輸送におけるヘモグロビンの役割は、図2aおよび2bに要約されている。
図2a: TISSUES O2は血液から組織へ拡散し、CO2は組織から血液へ拡散する
Figure 2b: 肺 血液から肺へCO2が拡散、肺から血液へO2が拡散
組織を流れる毛細血管では、ヘモグロビンから酸素が放出されて組織細胞内を通過する。 二酸化炭素は組織細胞から赤血球に拡散し、赤血球の酵素である炭酸脱水酵素により水と反応して炭酸が生成される。
炭酸は解離して重炭酸（血漿に移行）と水素イオンになり、脱酸素化したヘモグロビンと結合する。 血液は肺に流れ、肺胞の毛細血管で上記の経路が逆転する。 炭酸水素は赤血球に入り、ここでヘモグロビンから放出された水素イオンと結合し、炭酸を形成する。
これが解離して炭酸ガスと水になる。 炭酸ガスは血液から肺の肺胞に拡散し、呼気中に排出される。 一方、酸素は肺胞から毛細血管に拡散し、ヘモグロビンと結合します
1.2. 酸素と結合できないヘモグロビン
通常、微量にしか存在しませんが、ヘモグロビンには、酸素と結合できないメトヘモグロビン（MetHbまたはHi）、スルフヘモグロビン（SHb）、カルボキシヘモグロビン（COHb）の3種があり、このうちメトヘモグロビンは酸素と結合し、カルボキシヘモグロビンは酸素と結合することができないのです。
ヘモグロビンの構造と機能に関する包括的な説明は、参考文献
ctHb, 総ヘモグロビン濃度は通常、酸素化ヘモグロビン、脱酸素化ヘモグロビン、カルボキシヘモグロビンおよびメトヘモグロビンの合計として定義される。
ctHb測定の臨床的有用性
ctHb測定の主な理由は、貧血の検出とその重症度の評価である。
貧血は、赤血球数の減少および/またはctHbの減少による血液の酸素運搬能力の低下と定義することができ、ctHbが基準（正常）範囲の下限を下回れば貧血となる（TABLE I）。 ctHbが低いほど貧血は重症である。
TABLE I: ctHb reference ranges (Ref 2)
Anemia is not a disease entity, rather a consequence or sign of disease. ctHbがこれほど頻繁に要求される血液検査である理由は、貧血が様々な病態の特徴であり、その多くが比較的一般的であるためである（表II）。
一般的な症状は、そのほとんどが非特異的なもので、蒼白、疲労感や無気力、息切れ-特に労作時、めまいや失神、頭痛、便秘、脈拍増加、動悸、頻脈がある。
TABLE II: Some of the clinical conditions associated with anemia
これらの症状がないからといって貧血を否定できるわけではなく、多くの軽度貧血患者は、特に貧血がゆっくり進行した場合は無症状のままである。
2.2. 多血症
貧血はctHbの減少によって特徴づけられるが、ctHbが上昇すると多血症を示す。 多血症は、血液中の酸素が通常より少ない状態（低酸素血症）に対する反応として生じる。
低酸素血症に対する身体の反応として、酸素供給を増加させるために赤血球の産生が増加し、その結果ctHbが上昇する。 このいわゆる二次性多血症は高地への生理的適応の一部であり、慢性肺疾患の特徴である可能性がある。
一次性多血症は、赤血球を含むすべての血液細胞の無秩序な産生を特徴とする、真性多血症という骨髄の悪性腫瘍の中でもはるかに頻度が低いものである。 多血症は、二次性であれ一次性であれ、一般に貧血よりはるかに頻度が低い。 歴史的背景
1世紀以上前に考案されたHb測定の最初の臨床試験は、人工着色標準液の色と一致するまで、測定した量の血液に蒸留水を滴下するものであった。
後の改良では、まず血液を石炭ガス（一酸化炭素）で飽和させ、ヘモグロビンをより安定なカルボキシヘモグロビンに変化させるという方法がとられました。 分光光度法とヘミグロビンシアン化法（cynamethemoglobin法）が開発された後、1950年代から現代のヘモグロビノメトリーが始まった。
この方法と他の方法を自動血球計数装置で使用するために適応させたものが続いている。 過去20年間は、ヘモグロビンのポイントオブケア検査（POCT）を可能にする方法の開発に重点が置かれてきた。
このセクションでは、まず現在検査室で使用されているいくつかの方法について考察し、次に検査室以外で使用されているPOCTの方法について説明します。
3.2. ヘミグロビンシアン化物-分光光度法
ヘモグロビン測定基準法として国際血液学標準化委員会（ICSH）で最初に採用されてから約40年、ヘミグロビンシアン化物（HiCN）試験はICSHの推奨法で、すべての新しいCTHb法が判定・標準化される対象であることに変わりはない。
以下に述べる詳細な考察は、基準法およびルーチン検査法としてのその継続的な重要性を反映するものである。
3.2.1. 試験原理
フェリシアン化カリウムとシアン化カリウムを含む溶液で血液を希釈する。 フェリシアン化カリウムはヘム中の鉄を第二鉄状態に酸化してメトヘモグロビンを生成し、シアン化カリウムによってヘミグロビンシアニド（HiCN）に変換されます。
HiCNは安定した色の生成物で、溶液中では540nmに吸光度の極大を持ち、Beer-Lambertの法則に厳密に従います。 希釈した試料の540nmにおける吸光度を、ヘモグロビン濃度が既知のHiCN標準溶液の同波長における吸光度と比較する。
ほとんどのヘモグロビン誘導体(オキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、カルボキシヘモグロビン、スルフヘモグロビンは除く)はHiCNに変換されるためこの方法で測定することができる。
3.2.1.1. 試薬希釈液（修正Drabkin溶液）
| フェリシアン化カリウム (K3Fe(CN)6) | 200mg |
| シアン化カリウム（KCN） | 50 mg |
| リン酸二水素カリウム（KH2 PO4） | 140 mg |
| 非-のものイオン性洗浄剤（例．g. Triton X-100) | 1 mL |
| 上記を蒸留水で1000 mLに希釈する |
3.2.1.2.の項参照。 手動法
5.0 mL 試薬に血液 25 µl を加えて混合し、3 分間静置します。 試薬ブランクに対し、540 nmの吸光度を読み取ります。 HiCN標準品の吸光度も同様に測定します。
3.2.1.3. ICSH HiCN標準液
この方法の大きな利点は、国際血液標準会議(ICSH)が定めた非常に精密な基準に従って製造され、定期的に見直されるHiCN標準液が存在し、その濃度値を割り当てることです。
この国際標準液は、世界中の臨床検査室で使用されている市販の標準液の一次校正に使用されています。 したがって、HiCN標準液を使用するすべての人は、実質的に同じ標準液を使用しており、その値は綿密に検証されています。 干渉について
ヘモグロビンを含む血液成分の分光光度計による推定では、タンパク質、脂質、細胞質による濁りが問題となる場合があります。
試料を大きく希釈（1:251）することにより、この問題はほとんど解消されますが、血漿タンパク質濃度が特に高い患者では、ctHbの結果が誤って高くなることがあります。
高脂血症や白血球を多く含む検体も同様のメカニズムでctHbを偽高値にすることがあります。 HiCNの利点
- 国際標準であり、正確
- 自動血球計数装置に容易に適合し、再現性がある（低いSDとCV-バッチ内CVは一般的
- 十分に確立し徹底的に研究し、ICSH推奨
- 試薬が安い
3.2.1.6. HiCNの欠点
- 手動法のため正確なピペッティングと分光光度計が必要
- 試薬（シアン化物）は危険
- 以上のことから実験室外での使用は制限される
- 脂質、血漿蛋白、白血球数の上昇により妨害を受ける
- 酸素運搬能力を持たないヘモグロビン誘導体（MethHb、COHb、SHb）は識別されない
- 試薬（青化物を含む）を使用すると、酸素運搬能力はない。 したがって、これらが異常な量（微量以上）存在する場合、血液の酸素運搬能力を過大評価する可能性があります
3.3. 代替（シアン化物フリー）実験法
Sodium Lauryl Sulphate (SLS) は界面活性剤で、赤血球を溶かし、放出されたヘモグロビンと迅速に複合体を形成する。 SLS-MetHbは数時間安定で、539 nmに最大吸光度を持つ特徴的なスペクトルを有しています。
この複合体はBeer-Lambertの法則に従うので、Hb濃度とSLS-MetHbの吸光度の間には正確な線形相関があります。
方法は、25μLの血液と2.08mmol/LのSLS溶液（pH7.2に緩衝化）5.0mLを混ぜ、539nmにおける吸光度を読みとるだけのものです。 SLS-Hb法によるctHbの測定結果は、参照用のHiCN法と非常に高い相関性（r = 0.998）を示すことが示されています。
この方法は自動血球計数装置にも適応され、精度、正確さともに自動HiCN法と同等の信頼性を持っています . 大きな利点は試薬が無毒であることである。 また、脂肪血症や白血球濃度の上昇による干渉を受けにくい。
SDS-MetHbは長期的に不安定であるため、標準物質として使用することはできません。 アジ化メトヘモグロビン法
この方法はヘモグロビンをHiCNとほぼ同じ吸光スペクトルを持つ安定な着色物アジ化メトヘモグロビンへ変換することに基づいています。
この方法で使用される試薬は、HiCN参照法で使用されるものと非常によく似ていますが、より毒性の高い青酸カリをアジ化ナトリウムに置き換えています。 HiCN法と同様にフェリシアン化カリウムでヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換し、アジドはメトヘモグロビンと錯体を形成する。
この方法によるctHb結果は、参照のHiCN法で得られた結果と同等であり、これは許容できる代替マニュアル法である。 しかし、アジ化ナトリウムは爆発性があるため、自動血球計数装置では使用できない。 アジド-MetHb反応はPOCTヘモグロビノメーターに適応されている
3.4. 研究所の外でctHbを測定する
ここで検討されているPOCTの方法は：
- 携帯型ヘモグロビン計
- CO-oximetry – POCT血液ガス分析器に利用される方法
- WHO color scale
3.4.1. 携帯型ヘモグロビン計
HemoCue-Bのような携帯型ヘモグロビン計は、ベッドサイドでヘモグロビンを正確に測定することができます。 これらは基本的に溶液の色の強さを測定できる光度計である。
これらの測定が行われる使い捨てのマイクロキュベットは、反応容器としての役割も果たしています。 赤血球からのHbの放出と安定な着色生成物へのHbの変換の両方に必要な試薬は、キュベットの壁面に乾燥した形で存在する。
必要なのは、毛細血管、静脈または動脈血の少量のサンプル（通常10μL）をマイクロキュベットに導入し、マイクロキュベットを装置に挿入することだけです。
装置はHiCN標準を使用して工場出荷時に事前校正されており、検査溶液の吸光度は自動的にctHbに変換されます。 結果は1分以内に表示されます。
3.4.1.1. 最新のヘモグロビン計の利点は以下の通りです
- 携帯性
- 電池または主電源で動作。
- 少量のサンプル（10 µL）を指で刺して採取
- 高速（結果は60秒）
- 使いやすさ – ピペッティングなし
- 実験室以外のスタッフによる最小限のトレーニング
- HiCNに対する標準化 – 実験室で得られるものと同等の結果
- 濁りのための補正。 この点で、携帯型ヘモグロビン測定器は、ほとんどのctHb法より優れています。
この技術は様々な環境で広範囲に評価されており、ほとんどの研究では、実験室の方法と比較して、許容できる精度と正確さが確認されています。 欠点
しかし、いくつかの研究では、非実験室スタッフの手にかかると、結果が満足のいくものにならないかもしれないという懸念が提起されている。 操作が簡単であるにもかかわらず、これらの機器は操作ミスから免れることはできず、効果的なトレーニングが不可欠である。
キャピラリー（指刺し）サンプルからの結果は、EDTAボトルに採取されたよく混ざったキャピラリーまたは静脈サンプルからの結果よりも精度が低いことを示唆する証拠があります。 CO-oximetry
CO-oximeterは特殊な分光光度計で、その名前はCOHbとMetHbの測定という本来の用途を反映したものである。
最近の血液ガス分析装置の多くはCO-オキシメーターを内蔵しており、血液ガス分析中にctHbを同時に推定できる。
CO-オキシメトリによるctHbの測定は、ヘモグロビンおよびその誘導体はすべて特定の波長で光を吸収し、したがって特徴ある吸光スペクトル（図3）を有する着色タンパク質である事実に基づくものである。
ビール-ランバートの法則は、単一の化合物の吸光度がその化合物の濃度に比例することを規定している。 溶液中の各吸収物質の分光特性がわかっていれば、複数の波長で溶液の吸光度を読み取ることで、各吸収物質の濃度を算出することができます。
図3.
CO-oximeterでは、ヘモグロビン種が光を吸収する範囲（520～620nm）の複数の波長で溶血した血液サンプルの吸光度測定値が、インストールされたソフトウェアによって、ヘモグロビン誘導体（HHb、O2Hb、MetHb、COHb）のそれぞれの濃度を計算するために使用されています。 ctHbはこれらの誘導体の計算された合計です。
オペレーターに必要なことは、よく混合された動脈血サンプルを血液ガス分析器/CO-oximeterに注入することです。
サンプルまたはその一部は、自動的にCO-オキシメーターの測定キュベットに送られ、そこで化学的または物理的作用により、赤血球が溶解してヘモグロビンを放出し、それを上記のように分光学的にスキャンする。
結果は1～2分以内に血液ガス結果とともに表示される。
いくつかの研究により、CO-オキシメトリによって得られたctHb結果は、参照実験室法から得られた結果と臨床的に大きく異なることはないことが確認されている。 CO-oximetryは、クリティカルケア環境におけるctHbの緊急推定に適した方法である
3.4.2.1. CO-oximetryによるctHbの特に利点としては、
- 分析のスピード
- 分析の容易さ
- 少量のサンプル量
- 血液ガス分析に必要な以上の資本コストや消耗品コストがかからない
- 追加のパラメータ（MetHb, COHb、O2Hb)の測定
- 白血球数が多くても影響を受けない
3.4.3. WHOヘモグロビンカラースケール（HCS）
世界保健機関（WHO）のために開発されたこの低技術の検査は、先進国での適用は限られていますが、貧血が最も多い途上国の経済的に困窮した国々にとっては大きな意義を持っています。
実験施設がなく、より高度なPOCTヘモグロビン計に資金を提供する資源が不十分な地域では、事実上、これがctHbを決定する唯一の手段です。
HCSテストは、血液の色がctHbの関数であるという単純な原理に基づいています。 血液を一滴紙に垂らし、その色を6つの赤の色調の表と比較する。それぞれの色調は、最も明るい40g/Lと最も暗い140g/Lという、同等のctHbを表している。 原理的には非常にシンプルなものだが、開発にあたっては、最大限の正確さと精度を確保するために、多大な研究と技術が投入された。
例えば、テストストリップ・マトリックスに使用する紙の最終的な選択には、さまざまな紙の広範な試験が行われました。また、血液と色素混合物の分光光度分析が、チャートの色と各基準CTHBの血液の色との間の可能な限り近い一致になるように採用されました。 HCSテストの利点
- 使いやすい-30分のトレーニングで可能
- 装置や電源を必要としない
- 速い-1分以内に結果が出る
- 指先（毛細管）採取で可能
非常に安価（1回約US$ 0.12） 3.4.3.2項. HCSテストの欠点
信頼性の高い結果は、テスト指示の厳守に依存する.
- テストストリップ上の血液が不十分または過剰
- 結果を読むのが遅すぎる（2分以上）または早すぎる（30秒未満）
- 照明条件が悪い状態で結果を読む
HSCテストは明らかに固有の限界を持っています. せいぜい、患者サンプルのctHbが6つの濃度範囲のうちの1つにあることを決定できる程度である。 30-50g/L、50-70g/L、70-90g/L、90-110g/L、110-130g/L、130-150g/Lの6つの濃度範囲にあることを決定するのがせいぜいである。
初期の研究では、貧血（ctHb
SUMMARY
ctHbは血液の酸素運搬能力を評価し、それによって貧血と多血症の診断を確立するために日常的に使用される2つのパラメータのうちの1つである）を識別する能力があることが実証された。
もう一つの検査であるヘマトクリット（Hct）またはパックドセルボリューム（PCV）は、以前の関連記事でctHbとHctの関係について述べたとおりです。 今回は、ctHbの測定に焦点をあてています。
多くの方法が考案されていますが、その多くはヘモグロビンまたはヘモグロビンの誘導体の色を測定することに基づいています。 この短いレビューでは、必然的に選択的であることが必要でした。 ここでは、今日最も一般的に使用されている方法を紹介する。
選択にあたっては、現在採用されている技術の範囲と、医療がほとんど普及していない発展途上国の貧困地域から現代の集中治療室のハイテク世界まで、さまざまな環境におけるctHbの臨床需要を満たすためにこれらがどのように適用されているかを伝えるよう努めた
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