C. diff 診断と検出。 なぜ検査はあいまいなままなのか
Clostridioides difficileは、医療環境における感染性下痢の最も一般的な原因であり、2011年のCDCのEmerging Infections Programサーベイランスシステムによるデータでは、診断後30日以内に約50万件の感染と29000人の死亡が発生したと推定されています。 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）の診断には、C. difficile 固有の核酸、酵素、毒素をさまざまな組み合わせやアルゴリズムで検出する多数の検査があり、このため、臨床解釈やコロニー形成と真の感染の区別について大きな混乱が生じています
米国感染症学会（IDSA）は最近、検査の推奨を含むCDIに関する最新の臨床実践ガイドラインを発表しました。 これらの推奨事項では、CDI 検査の対象として、24 時間以内に形のない便が 3 回以上ある原因不明の下痢を新たに発症した患者が望ましいとされています。 患者の便の提出について事前に合意された施設基準がない施設では、陽性および陰性予測値によって決定される最も優れた方法は、核酸増幅検査（NAAT）単独ではなく、2段階または3段階のアルゴリズムの一部としての便中毒素検査であった。 彼らは2つの一般的な方法を挙げている：1）核酸増幅検査（NAAT）によって裁定されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼ＋毒素アッセイの使用、2）NAAT＋毒素アッセイである。 しかし、この推奨は、”証拠の質が低い “と “弱い “と評価されている。 委員会は、実際には、最も感度の高い診断方法は、NAAT単独または多段階アルゴリズムであり、便の提出について事前に合意された施設基準がある場合に使用されるべきであると指摘している
これらの勧告は、CDIの診断の最適戦略に関するコンセンサスの欠如が続いていることを反映するものである。 米国以外からの勧告を考慮すると、勧告はさらに異なる。 ヨーロッパのガイドラインでは、毒素の検出を優先し、NAATや多段階のアルゴリズムにはあまり重点を置いていない
診断戦略と限界
毒素検出と培養。 歴史的に、実験室でのゴールドスタンダードは、C. difficileを便から培養し、分離株の毒素産生能力を検査する毒素原性培養でした；便濾液は、代替参照法として細胞細胞毒性試験（CCNA）を介して毒素を直接検査することも可能です。 これらの方法は数日かかるため、ルーチンの実験室検査には不向きである。 英国を拠点とした大規模な研究では、12,000以上の検体について毒素培養と細胞毒性試験を比較し、その結果を臨床データと相関させた。 その結果、細胞毒性試験陽性は死亡率の上昇と相関するが、毒素培養陽性で毒性試験陰性は相関しないことがわかり、毒素の検出がCDIの臨床診断に重要であることが示唆された。 以前は、定性酵素免疫測定法（EIA）による毒素検出が診断の主流であったが、これらの測定法は培養と比較して特異度は高い（96-98％）ものの、毒素原性培養と比較して感度（52-75％）に大きな限界がある。 CDI検査には様々な市販の検査法があり、最近のレビューで十分に説明されている。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの検出。 グルタミン酸脱水素酵素（GDH）イムノアッセイおよびその他の分子検査は、毒素EIAの感度の低さに対処するために発展してきた。 GDHイムノアッセイは、すべてのC. difficile分離株で存在する高度に保存された代謝酵素を検出します。 しかし、この抗原はC. difficileの毒素原性株と非毒素原性株の両方に存在するため、GDH検査は、より特異的な毒素検査や毒素遺伝子検出のための分子検査の前の2～3段階のアルゴリズムのスクリーニングステップにしかなりえません。 現在、tcdA（毒素A遺伝子）、tcdB（毒素B遺伝子）、16SリボソームRNA（rRNA）を含む遺伝子ターゲットを検出する少なくとも12の商業プラットフォームが利用可能である。 このアッセイは、毒素EIAやおそらくGDH EIAよりも感度が高いが、毒素培養よりも感度が低い。
アルゴリズムに基づく多段階検査と超高感度毒素検出。 CDI検査の複雑さは、診断のための最適なアルゴリズムアプローチに関するデータの矛盾によって、さらに混乱させている。 ある単一施設の前向きコホート研究で、toxin-EIA陽性/PCR陽性患者（131人）とtoxin-EIA陰性/PCR陽性患者（162人）およびtoxin-EIA陰性/PCR陰性患者（1123人）の治療の必要性と自然経過を比較したところ、toxin-EIA陰性/PCR陽性患者（131人）の方が、治療が必要であることが分かりました。 その結果、毒素陽性/PCR陽性患者には下痢やCDI関連の合併症が多かったのに対し、毒素陰性/PCR陽性患者と毒素陰性/PCR陰性患者群では、消化管合併症の発生率が互いに同等であった（7.6% vs. 0.3% vs. 0.3%；p <0.001 ）。 毒素陽性/PCR陽性群ではCDI関連の死亡が11例、毒素陰性/PCR陽性群では死亡が1例、毒素陰性/PCR陰性群では死亡が1例であった。 したがって、研究者らは、CDI診断には毒素検査だけで十分であり、NAAT検査だけの使用は過剰診断と過剰治療につながる可能性があると結論づけた。 しかしながら、NAAT検査と無症候性キャリアの同定は、感染管理および疫学上の目的に関連するものである。
反対に、別の研究グループは、便中に毒素がないことはCDIの重症度を予測できない可能性があり、したがってNAAT陽性、EIA陰性の結果は臨床的にまだ意味があると報告した。 研究者らは、望ましい診断アルゴリズムのアプローチについては明記していませんが、NAATをCDIの主要な診断方法として使用すべきであると推奨しています。 この研究では、296名の患者が登録され、143名が複数の異なる方法に基づいて真のCDIと分類された。 彼らは、軽症と重症の患者の間で毒素EIAの陽性率に差はないことを発見した（49％対58％、p＝0.31）。 しかし、Toxin EIAの検出は、比較的非感度の検出限界によって制限される。 EIAの検出限界は0.8-2.5ng/mlであるのに対し、細胞ベースの細胞毒性アッセイでは、毒素濃度は30pg/mlと低く算出されるシナリオもあった。 最近の研究では、超高感度毒素検出により、コロニー形成は毒素濃度が低いという仮説のもと、実際のところ真の感染とコロニー形成をよりよく区別できるかどうかが疑問視されています
この仮説は、分析カットオフ値約1pg/ml、臨床カットオフ値約20pg/mlの1分子配列（Simoa）技術によるC. difficile毒素の検出・定量用超高感度測定法の性能について検討した最近の単一施設前向き研究により検証されています。 研究者たちは、採便前24時間以内に3回以上の未形成便があるか、臨床ノートで下痢が続くと定義されたCDI NAAT陽性患者（n=122）と、NAAT陽性だが採便前48時間以内に下痢の報告がない無症状キャリア（n=44）における毒素濃度を比較しました。 研究者らは、便中のトキシンAおよびB濃度でCDI患者と無症候性キャリアを区別できないことに驚きを隠せなかった。 2つのグループの毒素A、毒素B、毒素A+B濃度、NAATサイクル閾値（Ct）の中央値は実際、ほぼ同じであった。 20pg/ml以上の毒素A+B濃度（臨床的カットオフ値）の頻度は、CDI-NAAT+群（65％）とキャリア-NAAT+群（77％）で同程度であった。 しかし、CDI群とキャリア群をNAAT陽性だけでなく毒素陽性（毒素A＋B≧20pg/ml）でも定義すると、毒素濃度の中央値（毒素A、B、A＋B濃度の中央値）とCt値に有意差があることを指摘している。 したがって、毒素濃度が非常に低い患者でもCDIと一致する重大な下痢を起こす可能性があり、逆に無症状患者でも相当量の毒素が検出されることが観察されたが、毒素のカットオフ閾値を超えると、無症状患者の方がより低い毒素濃度が検出された。
要するに、超高感度の毒素検出が、CDIをより効果的に診断し病気と定着を識別する方法の聖杯の答えとなるわけではないようである。 本研究で得られた驚くべき結果は、便中の毒素濃度が高い患者が無症状であり、逆に毒素濃度が非常に低い患者が有症状であるのはなぜかという中心的な疑問を提起している。 専門家の中には、便中に C. difficile 毒素が存在するにもかかわらず患者が無症状である理由を、抗毒素抗体などの宿主因子が説明しているのではないかという仮説を立てている人もいます。 病原体の検出に加えて、そのような抗体やその他の宿主バイオマーカーを検出する検査が、CDI診断の改善のために必要かもしれません。 CDI診断のさらなる研究が待ち望まれる一方で、検査は診断の裏付けにはなるが決定的な証拠にはならないという臨床医学の身近な領域にとどまっており、その固有の限界を認識する必要がある。