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DISCUSSION
DNA合成酵素モデル系にはDNA複製過程の各相を支えるために必要なタンパク質がすべて含まれており、これらのタンパク質は現在の測定条件では20～240kDaの大きさで、DNA複製過程のすべての相をin vitroで実施できる … 続きを読む 本研究では、DNAシンセソームが触媒するRNAプライマーの合成と伸長をin vitroで調べることにより、シンセソーム関連DNAプライマー活性の特徴を明らかにした。 機能解析の結果、乳がん細胞由来のP4画分に含まれるシンセソーム関連DNAプライマーゼ活性は、乳がん細胞粗抽出液の30倍であることがわかった。 MCF7細胞から調製した核および細胞質可溶性タンパク質画分を合わせて、DNA合成酵素を含むP4画分を調製し、SV40 in vitro DNA複製アッセイに使用した 。 P4画分中のDNAポリメラーゼα、δおよびDNAプライマーゼの活性は粗細胞抽出物の20-40倍である ; DNA複製プロセスのすべての段階をサポートすることが示されているin vitroモデル系でRNAプライマーの合成と伸長を完全にサポートする能力を持つのでこれらの研究に有用なツールとなっている
DNA primaseはRNAプライマーの合成と伸長に独特のプロセス性を示している． この処理能力は、次の正しいヌクレオチドの付加とプライマー-テンプレート複合体の解離の間の競争によって定義される。 DNAプライマーゼは、DNA合成の開始時にRNAプライマーを合成することができる唯一の酵素である。 プライマーゼのサブユニットのいずれも、単独でRNAプライマーを合成したり伸長したりすることはできない。 シンセソームは、両方のプライマーゼサブユニット（すなわちp49とp58）を含み、外因性のポリ（dT）鋳型を用いてin vitroでRNAプライマーの合成を触媒することができる。 この合成酵素は、ユニット長（7-10 nt）の機能的なRNAプライマーを合成する。 このRNAプライマーはRNaseによって完全に加水分解され、1-4 bpの短い断片になるが、DNaseによって加水分解されることはない。 シンセソーム関連プライマーゼの特徴は、単離されたDNAプライマーゼと異なり、RNAプライマーを延長してDNAプライマー鎖を形成する特異的な能力を持っていることである。 また、DNAプライマー鎖の合成には、DNAプライマーゼ活性に加え、DNAポリメラーゼ活性も必要である。 DNAポリメラーゼ活性は、通常、RNAプライマーの合成後に伸長を開始するように切り替わる。 ポリメラーゼが利用するのは、dNTP濃度に関係なく、7塩基以上の長さのRNAプライマーだけである 。 このように、単位長さのRNAプライマーの合成と伸長には、プライマーゼだけでなく、DNAポリメラーゼαサブユニットp180が関与し、シンセソームには高活性DNAポリメラーゼが存在し、デオキシリボヌクレオチドの組み込みを触媒してRNAプライマーを伸長させるのである。 RNAプライマーは、長さ20-40 ntのDNA-RNAオリゴプライマー（DNAプライマー）から、シンセソームに付随するポリメラーゼによって伸長される。 DNAプライマー鎖は2つの成分を含んでいる。 (1) 10 ntのリボヌクレオチド、(2) 20-40 ntのデオキシリボヌクレオチド。 RNaseとDNaseは別々にDNAプライマー鎖の適切な成分を加水分解し、DNAプライマー鎖を短くするが、加水分解は不完全である。
合成酵素のもう一つの特徴は、RNAプライマーとDNAプライマー鎖の合成が速く、サイズが異なることである。 この合成酵素はRNAプライマーとDNAプライマー鎖の両方の合成を速やかに触媒し、定常レベルは（5-15分）以内に蓄積されるようである。 DNA合成酵素が触媒する単位長のRNAプライマー（7-10 nt）とDNAプライマー鎖（20-40 nt）のサイズは、合成酵素の濃度や反応時間に関係なく、常に一定であることがわかった。 このDNAプライマーゼの活性メカニズムの研究は、シンセソームと関連したプライマーゼによって触媒されるRNAプライマーの合成が、プライマーの遅い開始、速い重合、「インテリジェント」な終結を経て起こることを示唆している 。 DNAプライマーゼは、DNA鋳型に結合し、ゆっくりとジヌクレオチドの合成を開始する。 ジヌクレオチド合成後、DNAプライマーゼによって重合されたジヌクレオチドに、さらにNTPが迅速に付加される。 DNAプライマーゼの活性は、分配合成ではなく、それぞれのRNAプライマーを1回の「バースト」活性で合成することが特徴である 。 7-10ntの単位長のプライマーが生成されると、プライマーゼテンプレートは終結シグナルとして働き、それ以上のRNA合成を阻害する。 この阻害は、安定なプライマーテンプレートの生成によるものであり、このプライマーテンプレートは、おそらくpol α-プライマーゼ複合体と結合したままであると考えられる。 興味深いことに、in vitroでDNAシンセソームによって合成されたDNA-プライマー鎖は、シンセソーム触媒によって合成されたRNAプライマーと類似している。 DNA-プライマー鎖の合成は速やかに定常レベルに達し、そのサイズは反応時間や合成反応中に使用するシンセソームの濃度に関わらず比較的一定（20〜40 nt）である。 DNA-プライマー鎖の合成には、DNAプライマーゼの他に、DNAポリメラーゼαの活性が必要である。 その結果、シンセソームが関与するポリメラーゼα活性は、DNA-プライマー鎖の合成においても、迅速な重合と「インテリジェント」な終結という特徴を持つことが示唆された。 迅速な重合とインテリジェントなDNAプライマー鎖の終結という特徴を持つシンセソームは、大腸菌のDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントがRNAプライマーの伸長時に介在する合成とは異なる。 シンセソームとは対照的に、ポリメラーゼIによって触媒されるRNAプライマーの伸長は、反応時間の長さに強く依存する。 反応時間を長くすると、伸長したRNAプライマーの量とサイズが著しく増加する。
DNA複製過程でプライマー合成からプライマー伸長に切り替わるメカニズムとして、2つの可能性が提案されている。 一つは、プライマーゼ-ポリメラーゼ複合体がプライマー-テンプレートから解離し、ポリメラーゼ活性部位と再合体することを提案する。 もう一つは、プライマーゼ活性部位からポリメラーゼαの活性部位へ、pol α-プライマーゼ複合体が移動することで、DNAテンプレートからの解離を伴わずにスイッチが入るというものである。 我々の実験は、ポリメラーゼIが触媒するRNAプライマー伸長が、高濃度のDNA合成酵素によって阻害されることを示している。 KlenowフラグメントがRNAプライマーを伸長する能力は、シンテソームが触媒するRNAプライマーの合成に依存し、シンテソームもRNAプライマーの末端に利用可能な結合部位を必要とする。 したがって、大腸菌ポリメラーゼIのKlenowフラグメントは、プライマー-ポリメラーゼ複合体がプライマー-テンプレートから解離することが必要である。 しかし、高濃度の合成酵素は、プライマーテンプレート上の結合部位を巡ってポリメラーゼIと競合し、RNAプライマーの伸長を阻害する。 その結果、KlenowフラグメントはRNAプライマーの伸長過程に参加することができなくなり、RNAプライマー末端でデッドエンド複合体を形成した。 この結果は、DNA合成酵素のポリメラーゼ-プライマーゼ複合体は、RNAプライマーの合成後、プライマーテンプレートから解離する必要があることを示唆している。 この結果から、合成酵素は反応温度を下げると単位長さのRNAプライマーのサイズを大きくすることがわかった。 反応温度を下げると、ポリメラーゼ-プライマー複合体の切り替え効率が上がり、プライマー-テンプレートの変性が減少する . また、DNAプライマーゼp49サブユニットには、単位長RNAプライマーのサイズを大きくするために必要なRNAポリメラーゼの触媒活性が含まれている。 したがって、我々の結果は、DNA合成体がRNAプライムDNA断片の形成に必要な適切なRNAポリメラーゼ活性を有することを示唆している。
RNAプライマーの開始と伸長の動力学的解析は、合成体に関連するDNAプライマーゼがテンプレート結合に関して遅く、比較的弱い酵素であることを示している。 また、DNAプライマーゼは、ヌクレオチドの識別能力が非常に低いため、ヌクレオチドの取り違えを起こしやすい核酸ポリメラーゼであることもわかった。 したがって、シンセソームと結合するDNAプライマーゼ活性の酵素学的動態の解析は、RNAプライマー合成時の合成速度とエラー頻度の関係を明らかにするために利用できると思われる。 複製フォークの遅行鎖上のDNA（岡崎）断片の不連続合成は、DNA複製の重要な生化学的プロセスである。 先行鎖上のDNAの連続合成と遅行鎖上のDNAの不連続合成を効果的に協調させるために、DNAプライマーゼは、RNAプライマーの合成を制御する一連の酵素的ステップを正確にタイミングよく行うことが必要である。 バクテリオファージT7の多タンパク質複製複合体の速度論的研究から、プライマーゼが分子ブレーキとして働き、複製フォークの進行を一時的に停止させることが示された。 DNAポリメラーゼδとpolαの物理的相互作用から、Leeらによって示された結果は、DNAプライマーゼが遅発鎖の遅い酵素的ステップの間に、先行鎖合成が遅発鎖合成を上回ることを防ぐことができるかもしれないことを示唆している
DNAプライマーの機能研究において、様々な真核生物のDNA複製モデルが使用されてきた。 全細胞溶解液の核マトリックス複製システムを用いて、内在性の核マトリックス結合二本鎖DNA鋳型を用いた真核細胞核におけるネイティブRNAプライマーとRNAプライミングされた新生DNAの合成と分布が調べられてきた。 RNAプライマーは、急速に増殖する哺乳類細胞の核マトリックスに強固に結合している。 RNAプライマーは、新しく複製されたDNAに共有結合して、RNAプライムド新生DNAを形成する。 RNA-primedはDNase消化により10 nt程度のオリゴヌクレオチドに分解され、少なくとも94%のネイティブRNAプライマーとRNA-primed nascent DNAは核の不溶性マトリックス画分に存在する。 核マトリックスに存在する長さ8-10 ntのRNAプライマーは、細胞内の全RNAの666分の1以下であり、RNAプライマーの濃度が低く、他のRNAが比較的多いため、核マトリックス画分中のRNAプライマーおよびRNAプライミングした新生DNAを調べることは非常に困難である。 さらに、核マトリックス複製モデルを介したRNAプライマー合成の解析に適用する場合、放射性ヌクレオチド標識全細胞溶解液からのRNAプライマーとRNAプライマー新生DNAの分離は、複雑で自明ではない精製方法である。 一方、核と細胞質を合わせた画分から精製したDNA合成酵素は、高活性のDNAプライマーゼとDNAポリメラーゼを含み、二本鎖のSV40オリジン含有DNAを鋳型としてin vitroでネイティブRNAプライマーの合成を完全にサポートする。 DNA合成酵素によって合成されたRNAプライマーは通常の長さ（10-20ヌクレオチド）であり、DNAポリメラーゼによるプライマー伸長をサポートするために適切に機能していると思われる。 これらのRNAプライマーは容易に伸長し、100-200 ntのRNAプライマー付き新生DNAを形成することができる。 複製フォークの遅行鎖上のDNA（岡崎）断片の不連続合成は、DNA複製に関わる重要な生化学的プロセスであり、DNA合成酵素によって合成される完全長のRNAプライムドDNA（岡崎）断片も、約100〜200 ntの長さである 。 私たちは、DNA合成酵素が、10〜200 ntの長さの異なるRNAプライムドを合成することを確認した。 これは、ネイティブなRNAプライマーやRNAプライミングされた新生DNAもこの程度の長さであることから、合理的であると考えられる。 このように、DNA合成酵素が触媒するRNAプライマーとRNAプライミングした新生DNAの合成は、全細胞溶解液の核マトリックス複製モデルを用いて発表された研究と本質的に同等であるという観察結果は、DNA合成酵素がin vitroで生理的に意味のあるDNA複製プロセスを実行できる優れたモデル系であることを示唆しています。 DNAシンテソームによって行われるプライマーゼを介したRNAプライマーの合成と伸長は、他の無細胞複製モデルによって行われるものと酷似している。 シンセソームモデルは、外因性の一本鎖DNAテンプレートや、無傷のSV40複製起点を含むスーパーコイル状の二本鎖DNAを用いて、in vitroでのRNAプライマーの合成と伸長をサポートする。 したがって、DNA合成酵素は、in vitroでのRNAプライマーの合成と伸長を完全に仲介することができ、真核細胞におけるDNA合成の開始機構のさらなる解明を促進することが期待される。 これらの結果は、シンセソームモデルがDNA複製過程におけるDNAプライマーゼと他の複製タンパク質の相互作用を研究するためのユニークなツールになることを示唆している
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