Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-, and the neutrophil recruitment|Mucosal Immunology|The Mucosal Immunology1が上皮バリアと好中球の動員を制御していることを明らかにした
ICAM-1は炎症下でPMNの上皮膜への接着と移動を促進する
クリプト膿瘍では、PMNの接着と移動の制御が重要である。 活動性のIBDで観察されるように、クリプトに浸潤したPMNはしばしばアピカル(内腔)上皮表面と密接に接触していることが観察される。14 TEMの後期におけるPMN-IEC相互作用を検討するため、既報のトランスウェルセットアップを用いて、炎症条件下での腸管上皮を横切るPMNの移動をモデル化した19。コントロールまたはインターフェロン-γ(IFNγ)処理したT84 IECを横切る生理的基底側面-頂部方向へのPMN TEMは、transepithelial N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) gradient(100 nM)を添加して誘発させた。 T84 IECをIFNγ(100 U ml-1、24時間)に曝露しても、IECバリア機能、主要接合タンパク質JAM-A、Occludin、ZO-1の発現および細胞内局在に大きな影響はなかった(補足図S1 オンライン)。 IFNγ処理は、TEMを完了したPMNの数に有意な影響を与えなかったが、頂膜に関連するPMNの数は有意に増加した(8.7±1.8%、未処理から19.7±1.9%、IFNγ、頂膜、図1a)。 この増加と一致して、非移動PMNの数(上室PMN、基底部)は、IFNγ処理後に有意に減少し(約1.5倍)、移動率の増加が示唆された(図1a)。 上皮単層(epith)内のPMNの数は変化しなかった。 代表的な共焦点免疫蛍光画像(図1b、上段)およびz-投影(下段)は、コントロールT84単層ではなく、IFNγ刺激した単層を横切る移動後の頂膜関連PMNを示す。 IFNγが炎症を起こした上皮でICAM-1の発現を誘導することが以前に示されているので27、炎症中に上皮単層上を移動するPMNは、Mac-1とICAM-1に依存した相互作用を通して頂膜に付着したままであり、したがって、以前に血管内皮で観察されたようにICAM-1に依存した運動ができるだろうと仮定している24)。 28 これまでの知見を確認するために、IFNγ処理(100 U ml-1、24時間)は、T84 IECの頂膜上で強固な、時間依存性のICAM-1発現増加(処理後24時間がピーク、図1c、d)を誘導した(図1e)。 T84およびSKCO15 IECを腫瘍壊死因子-α(TNFα;10 ng ml-1)に曝露してもICAM-1の発現を誘導できなかったことから、この効果はIFNγに特異的であった(補足図S2A,B)。 ICAM-1の発現増加は、健常粘膜と比較して活動性潰瘍性大腸炎患者の大腸生検の陰窩上皮でも観察された(図1f)。 さらに、ICAM-1およびMac-1依存性のPMNのIEC膜への接着を確認すると、抗ICAM-1または抗Mac-1機能阻害抗体(Abs;20μg ml-1)の添加により、IFNγによるPMN接着の増大が逆転した(補足図S3A)。 興味深いことに、PMN Mac-1を阻害すると、ICAM-1を阻害した場合と比較して、PMNの接着がより強力に減少した(>3倍)ことから、Mac-1はICAM-1に加えて、他の上皮表面リガンドと結合することが示唆された。
次に上皮を通過した後に、頂部に接着したPMNが頂部運動をするかどうかを検証した。 位相差タイムラプス顕微鏡を用いて、IECアピカル膜に付着した個々のPMNの挙動を追跡し、定量化した。 外来刺激がない場合のPMNはほとんど運動を示さなかったが、IECを横切って移動した後の頂膜に付着したPMNの59.3±7.6%が、平均這う距離65.6±6.2μm(図2b)の高い運動性を示す(図2a)。 TEMは、PMN細胞表面上のMac-1の発現を強力に増加させ(図2c)、PMN-IECアピカル相互作用におけるその役割と一致した。 重要なことは、IECをIFNγで刺激してICAM-1をアップレギュレートすると、アピカルロコモーションを示すPMNの数が著しく増加した(88±3.6%, IFNγ, vs. 59.3±7.6%, 未処理IEC)ことであった。 これらの条件下で、PMNは、頂部上皮膜に沿って有意に長い距離(101±10.0μm、IFNγ、対65.6±6.2μm、未処理IEC、図2b)移動した。 ICAM-1がPMNの移動に関与していることを確認するために、機能ブロック抗ICAM-1抗体(Ab)を添加すると、IFNγ効果が反転し、PMNの数と移動距離が減少した(それぞれ61.4±7.8%および73.6±6.1μm、図2a、図2b)。 Mac-1を阻害すると、残りの接着したPMNの運動が停止した(図2a、補足動画S1,S2)ので、このプロセスにおけるMac-1の独占的役割が確認された。 PMN運動に対するMac-1阻害の効果は、タイムラプス画像(図2d)および6つの代表的なPMNの変位軌跡(図2e)によりさらに強調されている。 PMNの這う速度は3〜7μm min-1の範囲であり、非刺激IECs対IFNγ刺激IECsで有意差はなかった(補足図S3B)。
PMN adhesion to the apical epithelial membrane compromises epithelial barrier function
我々は次にPMNと頂部に発現する上皮リガンドの相互作用が、上皮の障壁機能に対してどのような影響があるかを検証した。 この実験では、透過性支持体(0.4μmの孔径、PMN TEMが入るには小さすぎる)上で培養したコンフルエントT84 IECにPMNを先端から加え、所定の条件で12時間にわたって上皮バリアの指標であるTERを測定した。 29 fMLF (100 nM) 刺激による PMN の T84 IECs への接着は、12 時間にわたる時間依存的な TER の減少を引き起こした(約 60%, 図 3a)。 重要なことは、IFNγで前処理したT84 IECの頂膜にPMNを添加すると、ICAM-1依存性のPMN接着が促進され(図1a)、TERがさらに低下したことである(最初の2時間は約40%、12時間は約90%)。 IFNγ単独処理では、TERに影響を与えなかった。 観察された上皮透過性の上昇が、上皮細胞とPMNの直接接触によるものかどうかを調べるために、抗Mac-1阻害Ab(CBRM1/29、20μg ml-1)を用いて、IFNγ刺激IECへのPMNの接着を阻害することを試みた。 Mac-1の阻害は、IFNγ刺激後のPMNによるTERの減少を有意に減弱させた(図3a)。 重要なことは、別の実験で、未刺激およびIFNγ処理した上皮単層でのPMNによるTERの減少は、PMNと頂膜の直接接触に依存し、パラクリン機構を介さないことがさらに確認されたことである。 このような実験では、T84単層を倒立させた(アピカル側を下に向けた)トランスウェルの下部チャンバーにPMNを加え、fMLF(100 nM)で刺激した。 この条件下では、TERで評価したように、PMNによる上皮バリアーへの影響は見られなかった(図3b)。 上皮単層膜を100nMのfMLFに12時間暴露しても、TERに有意な影響はなかった。
Ligation of epithelial ICAM-1 triggers a MLCK-dependent increase in intestinal epithelial permeability
ICAM-1のアピカルアップレギュレーションはMac-1に依存したPMN adhesion on the epithelial barrierの効果を著しく増強したことが認められた(図3a). そこで、IFNγ処理した上皮単層膜のPMNによる透過性の上昇は、血管内皮で以前に報告されたように、PMNの接触によるICAM-1のクラスタリングとICAM-1依存性のシグナル伝達事象の誘導によるものと仮定した30、31。透過性の支持体に設置したT84 IEC単層膜をIFNγで処理してICAM-1の発現を誘導し、続いてICAM-1のクロスリンキングアブの添加を行った。 Abを介した架橋によりICAM-1のクラスタリングが誘導されることを確認した(補足図S2C)。 図4aに示すように、ICAM-1のAb介在型架橋は、時間依存的にTERの減少をもたらし、これはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン(3kDa、図4b)の傍細胞フラックスの増加と相関していた。 この効果はICAM-1に特異的であり、他の上皮表面分子、主要組織適合性複合体-1(MHC-1;図4)、および既知のPMNリガンドであるCD55(補足図S5)の架橋は透過性に有意な影響を与えなかったからである。 未刺激のT84 IECにICAM-1が発現していないことと一致して、IFNγ刺激のない状態でこれらのIECの頂膜表面に架橋Absを適用しても、TERに影響を及ぼさなかった(補足図S4A)。 同様に、IFNγ誘導によるICAM-1のアピカル上皮膜への局在と一致して、上皮単層の基底側面への架橋Absの適用は、バリア機能に対して有意な影響を与えなかった(補足図S4B)。
我々は以前、PMN TEMの初期イベント(基底側上皮膜のレベル)が、MLCKを介したTERの減少を引き起こすことを示した9。 MLCKはミオシンII調節軽鎖のリン酸化を通じて機能周囲のアクトミオシンリングの収縮を調節することにより上皮透過性の調節に重要な役割を持つことが示されている32。そこで、頂部に発現するICAM-1のライゲーション後のIEC透過性の増強がMLCK依存的かどうかを検討した。 実際、ICAM-1のAbによる架橋は、MLCKのリン酸化(Tyr 464)をもたらし、MLCKの活性化と一致した(図4c)。 このような活性化は、アピカルブラシボーダーと機能周囲のF-アクチンの減少を伴っており(図4d)、アクチン細胞骨格の再編成を示唆している。 重要なことは、T84細胞のICAM-1ライゲーション誘発MLCKリン酸化をML-7で阻害すると(20 μM、33 補足図S4C)、ICAM-1誘発F-アクチン再編成(図4d)、TERの減少(図4a)および傍細胞デキストランフラックスの増加(図4b)が阻止されたことである。 ML-7処理(20μM)単独では、TERに影響を与えなかった。 これらのデータは、炎症状態において、PMNがクリプト上皮細胞の頂膜表面に接触すると、ICAM-1依存性のシグナル伝達イベントが引き起こされ、その結果、透過性が亢進することを示唆している。
Engagement of ICAM-1 on the apical epithelial membrane is facilitates enhanced PMN TEM
As ligation of apically expressed ICAM-1 increased epithelial permeability, we performed experiments to examine whether ICAM-1-dependent changes in epithelial barrier function will be enhanced PMN TEM.上皮細胞膜のICAM-1の結合により、上皮細胞の透過性が増加した。 34 これらの実験では、PMNを刺激して上皮単層膜を移動させ、移動した細胞を回収して新しい上皮単層膜の頂膜表面に1時間再接着した(単層膜あたり2.5×105 PMN)ところ、IFNγ前処理をしたものとしないものがあった。 1時間のPMN-上皮接触後、単層を洗浄し、付着したPMNを取り除き、その後の底側-頂膜方向でのPMN TEMアッセイに使用した。 IFNγ処理した上皮単層ではなく、頂膜にPMNsを導入すると、PMNs TEMが有意に増加した(1.7倍、図5a)。 IFNγ処理のみ、あるいは単層と直接接触せず頂膜表面付近にPMNが存在する場合は、PMN TEMに影響を及ぼさなかった(図5a)。 並行して、ICAM-1の特異的Abによる架橋後に、PMN TEMを調べた。 IECのバリア機能に対するICAM-1架橋の効果と一致して、IFNγ処理したT84 IECのICAM-1のAbによる架橋は、頂膜に発現するコントロール分子であるMHC-1の架橋と比較してPMN TEMを著しく増加した(1.9±倍、図5b)。 予想通り、ICAM-1架橋プロトコルを未処理のIECモノレイヤーに適用しても、PMN TEMに大きな影響はなかった。 これらの知見は、ICAM-1との結合によりアピカル(内腔側)IEC膜に接着したPMNが、上皮バリア機能の変化を引き起こし、PMNの動員制御に寄与している可能性を示唆している。
ICAM-1 架橋はMLCK活性化、アクチンミオシン収縮(図4)をもたらした。 そこで、次にICAM-1架橋後のPMN TEMに対するMLCK阻害とF-アクチン収縮力阻害の効果を検討した。 IECをMLCK阻害剤ML-7(20μM、1時間33)またはミオシンモーターII阻害剤Blebbistatin(10μM、1時間35)で前処理すると、ICAM-1クロスリンキングによって誘導されたPMN TEMの増加は回復した。 これらの知見は、PMN TEMの制御においてICAM-1の下流のアクトミオシン収縮の役割を示唆している。 ML-7またはBlebbistatin単独での処理は、PMN TEMに影響を与えなかった(図5c)。
Ab-mediated ligation of ICAM-1 in murine intestinal lumen leads MLCK-dependent increase in epithelial permeability and enhanced PMN recruitment
次に、マウス腸管ループモデル(図6b)を使用して、ICAM-1のライゲーションの腸管上皮障壁機能とPMN recruitmentへの影響を調べるためにインビボ実験を実施した。 このモデルでは、FITC-デキストランを腸管内腔に導入した後、小腸の無傷の血液灌流セグメントの透過性を評価した。 図6aに示すように、ICAM-1は刺激されていない上皮では検出されなかったが(上図)、IFNγおよびTNFα(500 ng、24時間)の腹腔内投与により、ICAM-1の発現が強力に誘導された。 特に、誘導されたICAM-1は、マウス陰窩IECのアピカル領域でClaudin-2の上に局在していた(図6a、下段)。 また、サイトカイン処理により、3kDa FITC-dextranの透過性が約2倍上昇することも確認された(図6c)。
重要なことは、サイトカイン刺激腸ループの内腔に、対照タンパク質、MHC-1のAbsではなくICAMクロスリンクAbsを導入すると、サイトカイン単独処理と比較してデキストランに対する透過性がさらに約 1.5 倍増加した(図 6c)ことであった。 腸管上皮の透過性上昇が上皮のICAM-1誘導シグナル伝達事象によって特異的に媒介されていることを確認するために、ICAM-1の細胞質ドメイン由来のペプチド(ICAM-1ペプチド)を用いて、下流のシグナル伝達事象を媒介するICAM-1の能力を阻害することに成功した。 ICAM-1が、対照ペプチドではなく、ICAM-1と標的タンパク質との相互作用を阻害し、それによって細胞外の白血球リガンドとの結合に影響を与えずにICAM-1依存性のシグナル伝達を阻害することが以前に血管内皮で示された。22, 24 対照ペプチドではなく、ICAM-1を添加(100 μg ml-1, 30分)すると、ICAM-1の結紮によって引き起こされる腸の浸透性の増大が阻害された(図6c)。 腸管ループ内に導入されたAbs(非刺激およびIFNγ/TNFα活性化後)は、上皮を通過しないことが確認され、観察された効果に対する層状固有細胞の間接的寄与の可能性を排除した(補足図S6)。)を用いてMLCKの活性化を阻害すると、透過性の増加が抑制された(図6c)。 これらのデータは、ICAM-1ライゲーション後のin vivoでの腸管上皮透過性の増加は、MLCK依存性であることを示している。
上皮透過性の増加は、PMN移動の亢進と関連しているので、ICAM-1のライゲーションは、in vivoでのPMNの動員を亢進することになるかと検討した。 マウス腸管ループモデルを用い、化学誘引物質CXCL1(200μl Hank’s balanced salt solution(HBSS)+中1μM)の管腔投与により腸粘膜へのPMN浸潤と内腔への移動を誘導し、それぞれ免疫蛍光ラベル/共焦点顕微鏡、サイトスピン上に調製した洗浄液の分析、Diff-Quikによる染色により定量化した。 化学誘引物質がない場合、PMNは腸管上皮にも腸管内腔にも検出されなかった(図示せず)。しかし、CXCL1の内腔投与は、上皮層への著しいPMN移動(図7a)および腸管内腔への蓄積(図7c)を引き起こした。 サイトカインによる透過性の上昇と同様に、IFNγ/TNFα投与により、腸管上皮のPMN数は約2.2倍、内腔のPMN数は約1.7倍増加した。 重要なことは、サイトカイン処理した腸管ループの内腔にICAM-1架橋Absを添加すると、上皮(約1.6倍、図7a、b)および内腔(約1.4倍、図7c、d)の両方でPMN数が(サイトカイン処理のみより)さらに増加することである。 腸管上皮(赤)に浸潤したPMN(緑)は、ICAM-1ライゲーション後のサイトカイン活性化腸管ループからの組織切片の代表画像に示されている(図7b)。 同様に、ICAM-1ライゲーション後に内腔に移動したPMNは、腸管ループからの洗浄液の代表的な画像に示されている(図7d)。
ICAM-1ライゲーションによる上皮透過性の上昇と一致して、腸内腔へのPMN移動の増加は、ICAM-1を媒介するシグナル事象およびMLCK活性化に依存していた。 ICAM-1のAbによる架橋の前に、対照ペプチドではなくICAM-1ペプチドの内腔内添加(図示せず;100μg ml-1、30分)およびMLCKの阻害(ML-7、1mg kg-1、i.p.)の両方により、ICAM-1ライゲーションによるPMN移動の増加を完全に阻害した(図7a,c)。 これらの知見は、炎症が起きている状態でICAM-1が腸管上皮膜の先端部に結合するとバリア機能が低下し、その結果、生体内でPMNsの捕捉が促進されることを示唆している
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