E-kadheryna wiąże się z desmogleiną w celu ułatwienia montażu desmosomów
1) Praca dotyczy mechanizmu regulacji montażu desmosomów przez kadheryny. Chociaż recenzenci zgadzają się, że praca jest potencjalnie ekscytująca, podnieśli kilka istotnych kwestii. Po pierwsze, wszyscy zgadzają się, że model musi być przetestowany poprzez zbadanie kolokalizacji w komórkach wyrażających mutanta kadheryny.
Dziękujemy recenzentom za zasugerowanie tych ważnych eksperymentów. Jak opisano w naszej szczegółowej odpowiedzi dla recenzentów, przetestowaliśmy teraz rolę różnych mutacji Ecad w utrudnianiu rekrutacji Dsg2 w keratynocytach. Wyraziliśmy pełną długość Ecad WT, a także mutacje Ecad (L175D, K14E i W2A-K14E) w Ecad-knockout, Pcad-knockdown keratynocytów myszy (EKO/PKD) i analizowaliśmy rekrutację Dsg2 do miejsc kontaktów międzykomórkowych. Wyniki te potwierdzają, że aminokwas L175 w Ecad pośredniczy w interakcjach z Dsg2 i ułatwia wczesne tworzenie kompleksu desmosomowego w komórkach. Nasze eksperymenty ujawniają również, że montaż desmosomów jest inicjowany w miejscach homodimeryzacji trans Ecad.
2) Istnieją również obawy dotyczące wiarygodności danych dotyczących kolokalizacji na rycinie 5; potrzebna jest bardziej rygorystyczna analiza, aby wykazać, że kolokalizacja E-kadheryny i desmoplakiny występuje znacznie częściej niż można by się spodziewać przypadkowo.
W terenie desmosomy są identyfikowane przez rozmiar i wygląd toru kolejowego barwienia DP w obrazach SIM. Jak przedstawiono w naszej odpowiedzi dla recenzentów, użyliśmy tego ustalonego podejścia do lokalizacji desmosomów. Ponadto, podkreślamy teraz, że nie mierzymy kolokalizacji, ale raczej rekrutację różnych kadheryn (Ecad i Dsg) do regionów błony, które wykazują ten wzór.
3) Po drugie, modelowanie zakłada, że L175 tworzy część interfejsu, ale bez oceny stechiometrii nie można wykluczyć, że utrata wiązania jest pośrednim efektem utraty dimeryzacji cis. Modelowanie to jest również słabe, ponieważ nie badano komplementarnych interfejsów na Dsg2. Bez takich danych modelowanie molekularne należy uznać za wysoce spekulatywne.
Jak opisano w naszej szczegółowej odpowiedzi dla recenzentów, poprzednie symulacje obliczeniowe i eksperymenty biofizyczne pokazują, że tworzenie dimerów cis Ecad wymaga wcześniejszej dimeryzacji trans. W konsekwencji, Ecad nie może wiązać się z powierzchnią jako samodzielne, wstępnie uformowane, cis-dimery. To sprawia, że jest niezwykle mało prawdopodobne, że mierzone interakcje wiążące występują pomiędzy cis-dimerami Ecad i Dsg2. Niemniej jednak, zgadzamy się z recenzentami, że wyniki dokowania molekularnego są dość słabe. Dlatego wyeliminowaliśmy te wyniki modelowania z manuskryptu.
4) Wreszcie, jak zauważył recenzent 3, nawet jeśli poparte tymi dodatkami, model i sekcja dyskusji nie wyjaśniają, w jaki sposób E-kadheryna reguluje desmosomy.
Based on our new cellular structure-function data, we now propose a model whereby desmosome assembly is facilitated both by the direct cis interactions of Ecad and Dsg2 and the trans binding of opposing Ecad. W naszym modelu homodimeryzacja trans Ecad z przeciwległych komórek służy jako przestrzenna wskazówka koordynująca tworzenie się desmosomów. Następnie Ecad tworzy kompleksy cis-dimerowe z Dsg2, inicjuj±c w ten sposób montaż desmosomów. Model ten jest przedstawiony i omówiony w nowym manuskrypcie.
Reviewer #1:
1) Eksperymenty AFM z pojedynczą cząsteczką są najbardziej solidną częścią pracy. Jednakże, w moim odczuciu autorzy nie wykluczają możliwości, że obserwowane przez nich wiązania mogą wynikać z interakcji pomiędzy wstępnie uformowanymi cis-dimerami E-kadheryny. Stechiometria tej interakcji jest ważna do ustalenia, ponieważ gdyby wiązanie do Dsg2 wymagało cis-dimerów E-kadheryny, zmieniłoby to interpretację wyniku, że mutacja L175D blokuje interakcję Dsg2/E-cad. Taki scenariusz podważałby również poprawność symulacji dokowania. Moim zdaniem, niskie prawdopodobieństwo wiązania na kontakt końcówki AFM z powierzchnią jest słabym dowodem na to, że wiązanie koniecznie odzwierciedla interakcję dwóch monomerów, podobnie jak niska średnia gęstość cząsteczek kadheryn na powierzchni. Ponadto, kadheryny są unieruchomione za pomocą streptawidyny, która posiada wiele miejsc wiążących biotynę.
Z tych powodów uważam, że udowodnienie, że heterodimeryzacja zachodzi pomiędzy monomerami jest ważne. W tym celu zalecałbym systematyczne mierzenie prawdopodobieństwa interakcji końcówki z powierzchnią jako funkcji powierzchniowej gęstości E-kadheryny na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Jeśli interakcja rzeczywiście wymaga monomerycznej E-kadheryny, to pomiar ten powinien skalować się liniowo z dodaną E-kadheryną, przynajmniej przy niskich gęstościach. Jednakże, ten specyficzny pomiar nie jest wymagany – wystarczy jakikolwiek pomiar, który ustali stechiometrię.
Poprzednie symulacje komputerowe (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) wykazały, że homodimeryzacja cis Ecad wymaga uprzedniego utworzenia trans-dimerów Ecad. Podobnie, wcześniejsze pomiary FRET dla pojedynczych cząsteczek wykazały, że nie jest możliwe utworzenie samodzielnych cis-dimerów Ecad, nawet gdy monomery Ecad są umieszczone w bliskim sąsiedztwie w orientacji cis (Zhang i in., 2009). Łącznie, wyniki te sugerują, że w naszych eksperymentach Ecady nie mogą być unieruchomione na końcówce AFM lub podłożu jako wstępnie uformowane cis-dimery. W konsekwencji, niepowodzenie mutanta Ecad-L175D w interakcji z Dsg2 nie wynika z braku dimeryzacji cis Ecad. Omawiamy to teraz w podrozdziale „Leu 175 pośredniczy w interakcjach Ecad i Dsg2” manuskryptu.
Niestety, ograniczenia techniczne nie pozwalają na eksperyment stechiometrii białka, który sugeruje recenzent. W naszych eksperymentach używamy gęstości powierzchniowych białek, które pozwalają nam jednoznacznie zidentyfikować pojedyncze zdarzenia wiążące na podstawie odpowiedniego rozciągnięcia teterów PEG. Jeśli gęstość powierzchniowa kadheryn jest zwiększona, jak proponuje recenzent, prawdopodobieństwo jednoczesnego wielokrotnego wiązania Ecad wzrasta, co sprawia, że ilościowa analiza prawdopodobieństwa wiązania białek jest niewiarygodna. Z tego powodu (wraz z wewnętrzną słabością naszej analizy dokowania), wyłączyliśmy symulacje dokowania białek z manuskryptu.
Wreszcie, w poprawionym manuskrypcie, używamy teraz analizy skupień do grupowania zdarzeń niewiązania pojedynczych cząsteczek dla dynamicznej spektroskopii sił (DFS). Niedawno wykazaliśmy, że zastosowany przez nas algorytm klasteryzacji K-średnich znacznie poprawia estymację parametrów kinetycznych w DFS (Yen i Sivasankar, 2018). W związku z tym czasy życia, które teraz raportujemy dla oddziaływań Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 i Dsc2/Dsc2 są bardziej wiarygodne.
2) Symulacje dokowania są interesujące, ale moim zdaniem oferują słabe dowody na specyficzną geometrię wiązania, którą proponują autorzy. Zalecam, aby autorzy byli bardziej ostrożni w interpretacji i prezentacji tych wyników, lub alternatywnie przedstawili dodatkowe dane, na przykład obrazy EM, które wspierają lub obalają wynik obliczeń.
Zgadzamy się z recenzentem, że dane dotyczące dokowania białek są słabe. Dlatego wyeliminowaliśmy te wyniki z manuskryptu.
3) Niestety, obrazy SIM nie są przekonujące w obecnej formie. W szczególności nie jest jasne, co liczy się jako „desmosom” w analizie autorów (Figura 5B). Bardziej wyrafinowane traktowanie kolokalizacji byłoby wymagane, aby ustalić punkt, że E-kadheryna i desmoplakina kolokalizują, i że ta kolokalizacja zmniejsza się w miarę dojrzewania połączeń.
W poprzednich badaniach (Stahley i in., 2016a, 2016b) wykorzystaliśmy wygląd „toru kolejowego” DP, jak ujawniono przez obrazowanie superrozdzielcze, aby zdefiniować desmosomy za pomocą immunofluorescencji (jak przedstawiono na Figurze 3A). Inni w tej dziedzinie również wykorzystali morfologię torów „kolejowych” do identyfikacji desmosomów w obrazach SIM (patrz na przykład: Chen i wsp., (2012); Ungewiß i wsp., (2017)). Wielkość i organizacja tych struktur, ujawniona przez SIM, jest w pełni zgodna z klasycznymi definicjami desmosomów w EM. Zmierzyliśmy intensywność pikseli dla dwóch kadheryn (Ecad lub Dsg2) w obrębie tych struktur przy użyciu standardowej analizy obrazu. Co ważne, nie próbujemy twierdzić, że dochodzi do kolokalizacji. Raczej mierzymy rekrutację kadheryny do domen błonowych, które wykazują wzór barwienia DP rail road track. Zdajemy sobie sprawę, że czasami trudno jest dostrzec ślady „rail-road” we wczesnych punktach czasowych. Z tego powodu, najwcześniejszy czas, w którym czuliśmy, że możemy zidentyfikować bona fine rail road staining był w 1 godzinie. Ponadto, dokonujemy pomiarów tylko w miejscach, gdzie możemy zaobserwować wzory szlaków kolejowych, a nie punkciki DP. Wreszcie, nasze odkrycie, że Ecad jest obecny w rodzących się desmosomach jest zgodne z klasycznymi eksperymentami immunoEM pokazującymi, że Ecad może lokalizować się do desmosomów (Jones, 1988). Dlatego czujemy się pewni naszej zdolności do identyfikacji desmosomów i pomiaru względnych poziomów tych dwóch kadheryn w różnym czasie.
4) Pozostawiam ten ostatni punkt do uznania redaktora. Moim zdaniem dane o kolokalizacji, nawet jeśli przyjąć je za prawdziwe, nie ustalają znaczenia funkcjonalnego. Byłoby bardzo miło zobaczyć knockdown/rekonstytucji eksperyment z L175D E-kadheryny. Przewiduje się, że ta cząsteczka nigdy nie będzie kolokalizować z desmoplakiną, niezależnie od wieku połączenia. Naruszenie tego przewidywania poddałoby w wątpliwość preferowany przez autorów model.
W oparciu o sugestię recenzenta, przeprowadziliśmy teraz eksperymenty w celu bezpośredniego przetestowania roli różnych mutacji domeny zewnątrzkomórkowej Ecad w utrudnianiu rekrutacji DP i Dsg2 w keratynocytach. Dane te opisano w podrozdziale „Ecad L175 jest niezbędny do wydajnej międzykomórkowej rekrutacji Dsg2 i składania desmosomów”. Odpowiednie obrazy przedstawiono na Figurze 5 i na Figurze 5-figure supplement 1. Zastosowane metody opisano w podrozdziale „Izolacja, hodowla, transfekcja i obrazowanie konfokalne pierwotnych keratynocytów”. Do tych eksperymentów użyliśmy keratynocytów myszy EKO/PKD, które praktycznie nie wykazują ekspresji klasycznych kadheryn. Wcześniej wykazaliśmy, że keratynocyty EKO/PKD nie są zdolne do składania AJs i desmosomów z powodu utraty wszystkich klasycznych kadheryn (Michels i in., 2009). Komórki te pozwalają nam zatem bezpośrednio ocenić zdolność mutantów Ecad do i) inicjowania tworzenia AJ oraz ii) oceny ich zdolności do rekrutacji składników desmosomalnych do miejsc początkowego formowania kontaktu komórka-komórka.
Ponieważ byliśmy zainteresowani oceną zdolności mutantów Ecad do rekrutacji białek desmosomalnych wcześnie podczas tworzenia połączeń, wyraziliśmy albo pełnometrażowy Ecad WT lub mutanty w keratynocytach EKO/PKD i analizowaliśmy rekrutację DP i Dsg2 do miejsc kontaktów międzykomórkowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby zbadać rekrutację na różnych etapach tworzenia i dojrzewania połączeń, keratynocyty utrwalano i immunostymulowano dla DP, Dsg i Ecad w trzech punktach czasowych po przełączeniu Ca2+ (3 godziny, 6 godzin i 18 godzin).
Nasze dane wykazały, że 3 godziny po przełączeniu Ca2+, 93% WT-Ecad było wzbogacone w zipper-like early AJs w miejscach kontaktów międzykomórkowych. W przeciwieństwie do tego tylko 48% keratynocytów transfekowanych L175D-Ecad tworzyło zamki błyskawiczne AJ, prawdopodobnie z powodu upośledzonego tworzenia cis-dimerów Ecad (Figura 5 A, B). W tych wczesnych punktach czasowych po przełączeniu Ca2+, 66% i 91% kontaktów suwaków WT-Ecad było pozytywnych odpowiednio dla Dsg2 i DP (Figura 5 A, C, D, E). Kiedy komórki mogły zaangażować się w zależną od Ca2+ adhezję międzykomórkową przez 18 godzin, lokalizacje połączeń Ecad-Dsg2 i Ecad-DP wzrosły odpowiednio do 97% i 100% (Figura 5 A, C, D, E). W przeciwieństwie do tego, tylko 39% kontaktów suwakowych indukowanych L175 wykazało rekrutację Dsg2 3 godziny po przełączeniu na wysokie Ca2+, co wzrosło do 65% po 18 godzinach (Figura 5 A, C), potwierdzając, że bezpośrednia interakcja między Ecad i Dsg2 jest wymagana do wydajnej rekrutacji Dsg2 do wczesnych kontaktów międzykomórkowych. Podobnie, po 3 godzinach, tylko 28% ustalonych kontaktów międzykomórkowych mutanta L175D-Ecad było pozytywnych dla DP, co zostało zwiększone do 72% po 18 godzinach, co sugeruje mechanizm kompensacyjny na późniejszych etapach (Figura 5 D, E).
Aby potwierdzić, że obserwowany efekt mutacji L175D nie wynikał z utrudnionego tworzenia AJ, transfekowaliśmy keratynocyty EKO/PKD mutantem Ecad-K14E o pełnej długości, który znosi tworzenie X-dimerów i zatrzymuje Ecad w konformacji dimeru z zamianą pasm. Nasze dane wykazały, że tylko 4% transfekowanych komórek kontaktowych tworzyło zamki błyskawiczne we wczesnych (3 godziny) punktach czasowych po przełączeniu na wysokie Ca2+, a tylko 24% transfekowanych komórek kontaktowych wykazywało zamki błyskawiczne w późnych (18 godzin) punktach czasowych (Figura 5 A, B, Figura 5-figure supplement 1), potwierdzając, że K14 jest niezbędny do skutecznego tworzenia AJ, a tym samym do nawiązania kontaktu międzykomórkowego. Jednak te nieliczne K14E AJ, które zostały utworzone, rekrutowały Dsg2, a zwłaszcza DP, bardziej wydajnie niż L175D (Figura 5 A, C, E, Figura 5-figure supplement 1). Wynik ten potwierdził, że opóźniona rekrutacja Dsg2 do kontaktów międzykomórkowych nie była wynikiem niezdolności Ecad L175D do wydajnego tworzenia AJs, ale raczej z powodu braku bezpośredniej interakcji między Ecad i Dsg2. Ponieważ nigdy nie było żadnej kolokalizacji DP i Ecad w nieobecności zamków błyskawicznych (Figura 5-figure supplement 1), dane sugerują również, że interakcje trans Ecad poprzedzają interakcje Ecad/Dsg2. Wniosek ten jest dodatkowo wzmocniony przez nasze odkrycie, że nie zaobserwowano rekrutacji DP po zniesieniu trans adhezji Ecad, a tym samym zamków błyskawicznych, poprzez transfekcję pełnej długości Ecad-DM (podwójny mutant W2A-K14E, Figura 5-figure supplement 1) w keratynocytach EKO/PKD. Łącznie wyniki te potwierdzają, że aminokwas L175 pośredniczy w interakcjach Dsg2 i ułatwia wczesne tworzenie kompleksu desmosomowego w komórkach.
Recenzent #2:
1) Odkrycie, że reszty E-kadheryny L175 są krytyczne dla interakcji z Dsg2 jest intrygujące. Jednakże, nie zidentyfikowano żadnych pozostałości partnera interakcji. W tej sytuacji, przewidywanie konformacji dla interakcji E-kadheryna/Dsg2 przez dokowanie wydaje się niepewne; wydaje się niepewne, że przewidywana konformacja odnosi się do prawdziwej związanej konformacji.
Zgadzamy się z recenzentem, że dane dotyczące dokowania białek są spekulatywne i dlatego wyeliminowaliśmy te wyniki z manuskryptu.
2) Istnieje tylko luźny związek proponowanej interakcji Dsg2/E-kadheryna z biologią montażu desmosomów. Jednak autorzy wydają się mieć jasną drogę naprzód. Twierdzą oni, że obecność E-kadheryny w powstających desmosomach (oceniana doświadczalnie przez barwienie na desmoplakinę na Figurze 5) jest dowodem na rolę stowarzyszenia Dsg2/E-kadheryny, które zidentyfikowali. Teraz, gdy zidentyfikowali mutanta, który uniemożliwia to stowarzyszenie, eksperymenty z Figury 5 wykonane z mutantem powinny prowadzić do innych wyników. Ten eksperyment znacznie dodałby do rygoru tego papieru.
Jak opisano w odpowiedzi 4 do recenzenta 1, wyraziliśmy pełną długość Ecad WT i mutantów Ecad w keratynocytach EKO/PKD i analizowaliśmy rekrutację Dsg2 i DP do miejsc kontaktów międzykomórkowych. Wyniki te potwierdzają, że aminokwas L175 pośredniczy w interakcjach Dsg2 i ułatwia wczesne tworzenie kompleksu desmosomowego w komórkach. Dane te opisano w podrozdziale „Ecad L175 jest niezbędny do wydajnej międzykomórkowej rekrutacji Dsg2 i składania desmosomów” manuskryptu. Odpowiednie obrazy są przedstawione na Figurze 5 i na Figurze 5-figure supplement 1. Zastosowane metody opisano w podrozdziale „Izolacja, hodowla, transfekcja i obrazowanie konfokalne pierwotnych keratynocytów”.
Reviewer #3:
1) Ten manuskrypt identyfikuje i charakteryzuje molekularną interakcję między E-kadheryną i Desmogleiną 2 przy użyciu wyizolowanych białek i pokazuje zwiększoną kolokalizację między tymi dwiema cząsteczkami w keratynocytach na wczesnym etapie podczas montażu desmosomów. Są to potencjalnie bardzo interesujące obserwacje, które mogą wyjaśnić, w jaki sposób klasyczne kadheryny kontrolują składanie desmosomów. Chociaż jest to dobrze udokumentowane w literaturze przez kilka grup, mechanizmy leż±ce u podstaw tego procesu pozostaj± wci±ż nieznane. Jednakże ich konkluzja „Nasze zintegrowane eksperymenty z pojedynczą cząsteczką, przewidywania dokowania białko-białko i obrazowanie w super rozdzielczości w komórce pokazują, że interakcje Ecad/Dsg2 odgrywają ważną rolę we wczesnym składaniu desmosomów”, stwierdzona na początku sekcji Dyskusja, jest raczej mocnym wyolbrzymieniem, biorąc pod uwagę, że interakcja opiera się na charakterystyce izolowanych domen zewnątrzkomórkowych i statycznej, aczkolwiek wysokiej rozdzielczości mikroskopii. Nie przeprowadzono żadnego eksperymentu, który pokazałby, że kiedy zaburza się tę interakcję, składanie desmosomów jest rzeczywiście zaburzone, co moim zdaniem byłoby minimum, aby uczynić ten zestaw danych naprawdę interesującym i istotnym dla szerokiej publiczności.
Jak opisano w odpowiedzi 4 do recenzenta 1, wyraziliśmy teraz pełną długość Ecad WT i mutantów Ecad w keratynocytach EKO/PKD i wykazaliśmy, że aminokwas L175 pośredniczy w interakcjach Dsg2 i ułatwia wczesne tworzenie desmosomów w komórkach, jak oceniono przez rekrutację DP. Dane te opisano w podrozdziale „Ecad L175 jest niezbędny do wydajnej międzykomórkowej rekrutacji Dsg2 i tworzenia desmosomów” manuskryptu. Odpowiednie obrazy pokazano na Figurze 5 i na Figurze 5-figure supplement 1. Zastosowane metody opisano w podrozdziale „Izolacja, hodowla, transfekcja i obrazowanie konfokalne pierwotnych keratynocytów”.
2) Również w świetle faktu, że interakcja jest niezależna od wapnia, podczas gdy klasyczne zależne od kadheryny wczesne składanie desmosomów wymaga obecności wapnia (co nie jest w ogóle omówione).
Dziękujemy recenzentowi za ten wnikliwy komentarz. Jak opisano w podrozdziale „Ecad L175 jest niezbędny do wydajnej międzykomórkowej rekrutacji Dsg2 i montażu desmosomów”, obrazowanie konfokalne zmutowanego Ecad wyrażonego w keratynocytach myszy ujawnia obecnie, że montaż desmosomów jest inicjowany w miejscach zależnej od Ca2+ homodimeryzacji trans Ecad. W oparciu o nasze dane, proponujemy model, w którym tworzenie desmosomów jest ułatwione zarówno przez bezpośrednie interakcje cis Ecad i Dsg2, jak i trans wiązania przeciwstawnych Ecad. W naszym modelu homodimeryzacja trans Ecad z przeciwległych komórek służy jako przestrzenna wskazówka koordynuj±ca tworzenie się desmosomów. Ecad tworzy następnie kompleksy dimerów cis z Dsg2. Po zlokalizowaniu w obrębie natywnego desmosomu, Dsg2 odłącza się od Ecad i łączy się z Dsc2, tworząc dojrzałe desmosomy. Ponieważ kompleks Dsc2/Dsg2 ma dłuższy czas życia niż zarówno kompleks Ecad/Dsg2, jak i Dsc2/Dsc2, prawdopodobnie umożliwia to silną adhezję komórka-komórka i pozwala dojrzałym desmosomom wytrzymać siłę mechaniczną. Model ten opisano na rycinie 6 i w sekcji Dyskusja.
3) Ponieważ jest to całkowicie nowa interakcja o niskim powinowactwie, prawdopodobnie trudno jest wykonać jakiekolwiek badania interakcji w kontekście komórek, w których jedna komórka wyraża E-kadherynę, a druga Dsg2, aby zbadać, czy istnieje jakakolwiek interakcja. Jednakże, ponieważ ich dane są częściowo oparte na modelowaniu, autorzy powinni również wygenerować mutanta, w którym A125 i A124 są zmutowane, aby zapewnić znacznie lepsze dowody na istnienie proponowanych y-dimerów.
Ponieważ wyniki dokowania białek nie są solidne, teraz wyeliminowaliśmy te dane z manuskryptu. Jednak nasze eksperymenty z keratynocytami EKO/PKD pokazujące, że mutacja aminokwasu L175 w Ecad upośledza rekrutację Dgs2, a zwłaszcza DP do miejsc wczesnego formowania kontaktu, pokazuje, że Ecad-L175 ułatwia tworzenie desmosomów w komórkach, potwierdza nasze wyniki biofizyczne.
Podsumowanie:
Recenzenci uważają, że chociaż dane biofizyczne są przekonujące, potrzebna jest bardziej rygorystyczna analiza ilościowa, aby poprzeć wnioski wyciągnięte z danych na rycinach 3 i 5. W zasadzie te obawy mogą być rozwiązane za pomocą dodatkowej analizy danych, a nie eksperymentów, i w tym przypadku rozważylibyśmy poprawiony manuskrypt.
Dziękujemy redaktorowi za tę zachęcającą recenzję. Jak opisano poniżej, nasz poprawiony manuskrypt odnosi się do wszystkich podkreślonych kwestii.
1) Wniosek, że interakcja E-kadheryna-Dsg jest potrzebna do początkowego tworzenia desmosomów, opiera się na kolokalizacji Dsg i E-kadheryny zmniejszającej się w miarę dojrzewania połączenia. Jednak na rycinie 3 nie jest jasne, czy obserwowana kolokalizacja z DP jest znacząca, wykraczająca poza oczekiwaną przypadkowo, czy też wynika z zależnych od czasu zmian w lokalizacji podkomórkowej E-kadheryny, niezwiązanych z dojrzewaniem złącza. Na Figurze 3C, eksperymenty kontrolne pokazane w prawym panelu podkreślają kolokalizację Dsg2 i DP – znanych składników Desmosomu – i pokazują bliską zgodność sygnałów fluorescencji we wszystkich trzech punktach czasowych. W przeciwieństwie do tego, podczas gdy ekspresja E-kadheryny i DP w lewych panelach wydaje się nakładać do pewnego stopnia, nie wykazują one zgodności w sygnałach obserwowanych dla eksperymentów kontrolnych. Odpowiedź na oryginalne punkty recenzji na ten temat (np. recenzent 1, punkt 3) koncentruje się na definiowaniu desmosomu, ale nie odnosi się do powyższego punktu.
Chcielibyśmy wyjaśnić, że nie mierzymy kolokalizacji, ale zamiast tego rekrutację Ecad lub Dsg2 do regionów błony, które wyświetlają wzór DP „railroad track”. Aby uczynić to jaśniejszym, zmodyfikowaliśmy poprawiony manuskrypt, aby podkreślić, że Ecad jest „wzbogacony w powstające desmosomy”, a nie jest „wykluczony z dojrzałych desmosomów”.
Aby bezpośrednio odnieść się do obaw recenzentów dotyczących naszego pomiaru wzbogacenia Ecad w desmosomy, pokazujemy teraz, że względne poziomy Ecad wzdłuż całej granicy komórki (stosunek Ecad:DP na granicach komórek) pozostają niezmienione w czasie. Dane te potwierdzają, że wzbogacenie Ecad w obrębie szlaków kolejowych DP we wczesnych punktach czasowych jest specyficzne dla desmosomalnych regionów błony i jest znaczące poza tym, czego oczekuje się przez przypadek lub z powodu zmian w lokalizacji E-kadheryny niezwiązanych z dojrzewaniem skrzyżowania. Dane przedstawiono na Figurze 3-figure supplement 1 i opisano w podrozdziale „Ecad jest obecny w nascent desmosomes, ale nie w dojrzałych desmosomach”.
Wreszcie, ponieważ skany linii pokazane na Figurze 3 były mylące, wyeliminowaliśmy skany linii z poprawionego manuskryptu. Zamiast tego, na Rysunku 3B, pokazujemy teraz kilka reprezentatywnych obrazów regionów desmosomalnych w ludzkich keratynocytach hodowanych w mediach o wysokim Ca2+ przez 1, 3 lub 18 godzin. Wyniki te podkreślają główne przesłanie Figury 3C: Poziomy Ecad są wzbogacone w rodzące się desmosomy, z względnymi poziomami zmniejszającymi się w miarę dojrzewania desmosomów.
2) Podobne obawy dotyczyły Figury 5, która ma pokazać, że Ecad L175 jest niezbędny do wydajnej międzykomórkowej rekrutacji Dsg2 i montażu desmosomów. Obrazy w panelu A rzeczywiście pokazują dramatyczną różnicę w lokalizacji Dsg2 i DP w stosunku do WT lub zmutowanej kadheryny. Podczas gdy Dsg2 i DP kolokalizuj± z WT lub K14E Ecad w miejscach poł±czeń, pozostaj± one w oddzielnych punkcikach otaczaj±cych poł±czenie L175D Ecad i nie kolokalizuj± się z nim. Nie jest jednak jasne, co autorzy określili ilościowo, aby sprawdzić znaczenie tego fenotypu. W B, co to jest „% połączeń tworzących kontakty”? Jak definiowany jest kontakt? Jakie połączenia są mierzone? AJ czy desmosomy? W C i E, co oznaczają przez% połączeń Dsg2 lub DP pozytywnych? Jak zostały zdefiniowane połączenia?
Dodaliśmy teraz panel figur (Figura 5-figure supplement 1A), aby zilustrować kryteria kwantyfikacji i kategorie połączeń, które zostały użyte w naszej analizie. Ten panel pokazuje przykłady komórek transfekowanych mutantem Ecad, które nie (lewy panel) lub nie (prawy panel) wykazują międzykomórkowe tworzenie AJ. W przypadku rekrutacji Dsg2 lub DP, ocenialiśmy ilościowo tylko te interfejsy międzykomórkowe, w których zaobserwowano zamki AJ. W wstawkach panelu ryciny pokazujemy przykłady pozytywnych kontaktów AJ, które są albo pozytywne dla DP, albo negatywne dla DP.
W podrozdziale „Ecad L175 jest niezbędny do wydajnej międzykomórkowej rekrutacji Dsg2 i montażu desmosomów” manuskryptu, teraz stwierdzamy, że zdolność transfekowanych keratynocytów do tworzenia AJs została najpierw oceniona przez tworzenie „zipper-like” wzorów Ecad w kontaktach międzykomórkowych. Wcześniej wykazaliśmy, że te zamki błyskawiczne reprezentują wczesne AJs i rekrutują białka markerowe AJ, takie jak winkulina (Rübsam i in., 2017). Zbadaliśmy tylko interfejsy międzykomórkowe z suwakami AJ, pod kątem ich zdolności do rekrutacji Dsg2 i DP do tych kontaktów. Co ważne, nigdy nie zaobserwowaliśmy wzbogacenia komponentów desmosomalnych na kontaktach międzykomórkowych w nieobecności suwaków AJ (Michels i in., 2009).
Jak opisano w odpowiedzi 3a poniżej, teraz omawiamy w sekcji Dyskusja, że chociaż Dsg2 i DP wykazują pewną kolokalizację na suwakach Ecad-pozytywnych w ciągu 3 godzin, istnieje również nienakładające się barwienie połączeń, sugerujące, że AJs i desmosomy zaczynają już segregować w odrębne połączenia międzykomórkowe. Nie określiliśmy ilościowo tej kolokalizacji w naszym manuskrypcie, ponieważ głównym punktem naszych eksperymentów było pokazanie znaczenia L175 dla rekrutacji Dsg2 do interfejsów międzykomórkowych i ułatwiania tworzenia desmosomów (jak zilustrowano przez rekrutację DP do kontaktów międzykomórkowych). Uważamy, że opóźnienie w rekrutacji między WT, mutantem L175 i mutantem K14, które jest określone ilościowo w Figurze 5, ilustruje ten punkt.
3) Istnieją również modyfikacje sekcji Wprowadzenie i Dyskusja potrzebne do zajęcia się powyższymi punktami, jak również dostępnością papieru:
a) Związane z powyższymi punktami, związek między eksperymentami wiązania in vitro i proponowaną rolą biologiczną wydaje się niepewny w oparciu o badania lokalizacyjne, które ujawniają nakładające się, ale nie naprawdę współlokowane wzory barwienia. Autorzy muszą wyjaśnić to odkrycie; być może współlokacja jest dynamiczna i/lub tylko podzbiór cząsteczek E-kadheryny jest związany z Dsg2. Ten punkt przynajmniej musi być przedyskutowany, aby zracjonalizować wyniki eksperymentów lokalizacyjnych z proponowanym modelem.
Dzięki przejściowej naturze interakcji Ecad/Dsg2, oczekuje się, że białka desmosomalne rekrutowane do połączeń szybko oddzielą się od Ecad. W konsekwencji oczekuje się, że obrazy interfejsów międzykomórkowych będą miały zarówno nakładające się, jak i oddzielne wzory barwienia białek Ecad i desmosomalnych. Zgodnie z tym, chociaż Dsg2 i DP wykazują pewną kolokalizację w Ecad-pozytywnych suwakach (Figura 5), obserwuje się znaczące nienakładające się barwienie połączeń, nawet w ciągu pierwszych 3 godzin. Sugeruje to, że AJs i desmosomy szybko segregują się w odrębne połączenia międzykomórkowe. Teraz stwierdzamy to w sekcji Discussion.
b) Na początku sekcji Discussion autorzy twierdzą, że: „zidentyfikować dwa krytyczne zdarzenia, które inicjują i promują wydajne składanie desmosomów: (i) stabilna trans homodimeryzacja Ecad, oraz (ii) bezpośrednie heterofilne wiązanie ektodomeny Ecad i Dsg2. Nasze dane wskazują, że tworzenie desmosomów jest inicjowane w miejscach homodimeryzacji trans Ecad. Następnie Ecad i Dsg2 wiążą się poprzez konserwowany Leu 175 na cis interfejsie wiążącym Ecad i tworzą krótkotrwałe heterofilne kompleksy, które lokalizują się do wczesnych desmosomów i efektywnie rekrutują białka desmosomalne do miejsc powstawania kontaktów międzykomórkowych. Gdy desmosomy dojrzewają, Dsg2 dysocjuje z Ecad i tworzy stabilne wiązania z Dsc2, aby pośredniczyć w silnej adhezji.” – Ten akapit miesza obserwacje, interpretację i hipotetyczne modele i jako taki jest mylący. Powinni oddzielić podsumowanie wyników od interpretacji i ich modelu.
Zgodnie z sugestiami recenzentów, wyeliminowaliśmy interpretacje z pierwszego akapitu sekcji Dyskusja i teraz tylko podsumowujemy wyniki.
c) Autorzy piszą w Abstrakcie i Wprowadzeniu „Ecad oddziałuje z Dsg2 poprzez konserwowany Leu 175 na interfejsie wiązania cis Ecad.” – Autorzy nie powinni zakładać, że czytelnicy są zaznajomieni z homofilnymi interakcjami E-cad i powinni to wyraźnie wyjaśnić.
W Abstrakcie, obecnie stwierdzamy, że 'Poprzednie badania wykazują, że E-kadheryna (Ecad), białko adhezyjne, które oddziałuje zarówno w konformacjach trans, jak i cis, ułatwia montaż desmosomów poprzez nieznany mechanizm’.
Co więcej, we Wprowadzeniu, obecnie stwierdzamy: 'Ponieważ Ecad oddziałuje lateralnie, tworząc dimery cis na tej samej powierzchni komórki (Harrison i in., 2011), podczas gdy cząsteczki Ecad z przeciwległych komórek oddziałują w konformacji dimeru trans z zamianą pasm (Boggon i in., 2002; Parisini i in., 2007; Vendome i in., 2011) oraz w konformacji trans X-dimeru (Ciatto i in., 2010; Harrison i in., 2010), użyliśmy mutantów, które specyficznie znoszą interakcje trans lub cis Ecad i zbadaliśmy ich wiązanie do Dsg2 lub Dsc2′. Wreszcie, we wstępie stwierdzamy, że „Poprzednie badania strukturalne wykazały, że L175 pośredniczy w homofilnej dimeryzacji cis Ecad (Harrison i in., 2011)”.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013