Deutererad kloroform
13.4.4.4 Bedömning och underhåll av instrumentets prestanda
Incorporering av laboratorieinstrument i kvalitetsledningssystem som används för laboratoriecertifieringar (dvs. ISO17025 för analyslaboratorier) kräver att instrumentets prestanda bedöms och underhålls med jämna mellanrum. Dessa certifieringar gör det möjligt för laboratoriets analytiker att skapa tester för driftskvalificering (OQ) och prestandakvalificering (PQ) kring den avsedda användningen av instrumentet. För NMR kan OQ/PQ-testerna således variera beroende på vilka vanliga analytiska tester som ska utföras på instrumentet. Moderna instrument har automatiska förfaranden som kräver att användaren för in lämpligt prov, varefter en serie tester utförs på ett automatiserat sätt. I slutet av dessa tester utfärdas en rapport som gör det möjligt för användaren att bedöma spektrometerns övergripande prestanda.
För testning av proteinterapeutiska läkemedel i vattenlösningar bör dessa OQ-tester innefatta: temperaturkalibrering, linjebildning av acetonsignalen i deutererad kloroform, känslighet av etylbensen-signaler i deutererad kloroform och/eller vattenundertryckning med känslighetsbedömning av de anomeriska protonerna i en 2 mM sackaroslösning. Temperaturkalibrering är viktig eftersom ett proteins dynamik påverkas av de omgivande lösningsförhållandena, vilket kan ha stora effekter på de observerade signalernas linjebredder och frekvenser. Reglering av provtemperaturen i NMR-spektrometrar bygger på noggrann kontroll av sondluftens temperatur och flödeshastighet. Sondluftens inverkan på provets temperatur kan mätas genom att mäta de kemiska skiftningarna i en 100 % metanol- eller 100 % etylenglykol-lösning. Dessa skiftningar har mätts noggrant så att den faktiska provtemperaturen kan bedömas med en given inställning av temperatur och flödeshastighet för sondluften.
Inverkan av en god provskärmning (dvs. ett jämnt magnetfält över den observerade delen av provet) på spektralkvaliteten kan inte överskattas: ju smalare topparna är, desto bättre är upplösningen och känsligheten hos de signaler som kan mätas. Om signalundertryckningstekniker används, är det särskilt så att ju smalare basen för den topp som ska undertryckas är, desto bättre fungerar tekniken för presaturering eller smalbandig selektiv signalundertryckning. Lyckligtvis har tillkomsten av fältkartläggningstekniker och gradientskimning förenklat denna ofta tidskrävande uppgift att justera skimningsinställningarna för varje prov. Det kommer dock att finnas prover för vilka shimmappningarna inte kommer att fungera bra, och tid kommer att behöva läggas på shimjustering för att få optimal instrumentrespons.
Bedömning av spektrometerns känslighet med standardprover är ett idealiskt sätt att spåra systemets prestanda, och de värden som erhålls från standardtesterna måste uppfylla eller överträffa de spektrometerspecifikationer som fastställts av tillverkaren. Spektrometerspecifikationerna fastställs ofta på ett konservativt sätt av tillverkaren för att försäkra sig om att instrumentet klarar dessa tester vid installationen. Genom att utföra OQ/PQ-testerna med jämna mellanrum kan spektrometerägaren dock bekanta sig med det egna instrumentets kapacitet. Avvikelser från de värden som fastställts genom rutintestning bör undersökas noggrant eftersom de kan vara en indikation på att instrumentet fungerar dåligt.
Vid analys av små molekyler i organiska lösningsmedel brukar användningen av acetonsignalen i deuterat kloroform för att uppnå inte bara en lorentzisk linjeform och en smal FWHH utan också en smal bas (t.ex. <20 Hz vid 20 % av 13C-satellitsignalen) vanligtvis leda till den bästa känsligheten för etylbensen-signaler i deuterat kloroform. För spektrometrar som används för att erhålla spektrum i vattenlösningar är ett andra känslighetsmått viktigare: spektrometerns förmåga att erhålla god känslighet och upplösning från signaler nära vattentoppen. Mätning av känsligheten med de anomeriska protonsignalerna från en standard bestående av 2 mM sackaros i 95 % H2O/5 % D2O-lösning med tillämpad vattenundertryckning är således ett mer realistiskt mått på spektrometerns signal-brusprestanda för NMR av proteinterapeutiska prover.
För en PQ på en spektrometer som bedömer kvaliteten på proteinterapeutiska läkemedel är en kritisk kvalitetsegenskap för dessa läkemedel en specifik tertiärstruktur som ges genom veckningen av aminosyrakedjan. Som en PQ på en spektrometer som utför 2D-strukturkartanalys kan därför 2D-HSQC-spektra köras på kort tid på ett 15N- eller 13C-isotopiskt anrikat prov för att fastställa spektrometerns förmåga att utföra pulsprogram med effektiva frikopplingsscheman och val av gradientkoherens. 13C- eller 15N-isotopiskt berikade protein (t.ex. SH3-domänprotein eller ubiquitin) standardlösningar i förseglade rör finns kommersiellt tillgängliga i koncentrationer som gör det möjligt att samla in data på några timmar. Lämpligt kalibrerade spektrometrar på 500 MHz och högre, och utrustade med en kryosond, kan mäta 2D-strukturkartor på proteiner i naturlig mängd (dvs. inte isotopiskt anrikade) vid ∼1,0 mM koncentration på 2-3 dagars spektrometertid.