Diagnos och upptäckt av C. diff: Varför testerna fortfarande är tvetydiga
Clostridioides difficile är den vanligaste orsaken till infektiös diarré i sjukvården, och data från CDC:s övervakningssystem för nya infektioner (Emerging Infections Program) från 2011 uppskattar att den orsakade nästan en halv miljon infektioner och 29 000 dödsfall inom 30 dagar efter diagnosen. Det finns en mängd tester tillgängliga för diagnos av Clostridioides difficile-infektion (CDI) – som påvisar C. difficile-specifik nukleinsyra, enzym och/eller toxiner, i olika kombinationer och algoritmer – och detta har lett till betydande förvirring när det gäller klinisk tolkning och distinktionen mellan kolonisering och verklig infektion.
Infectious Diseases Society of America (IDSA) har nyligen publicerat uppdaterade riktlinjer för klinisk praxis för CDI, inklusive rekommendationer för testning. I dessa rekommendationer anges att den föredragna populationen för CDI-testning omfattar patienter med oförklarlig och nytillkommen diarré bestående av ≥3 oformade avföringar på 24 timmar. För institutioner där det inte finns några på förhand överenskomna institutionella kriterier för inlämning av avföring från patienter, var den bästa metoden, fastställd genom positiva och negativa prediktiva värden, ett avföringstoxintest som en del av en två- eller trestegsalgoritm snarare än enbart ett nukleinsyraamplifieringstest (NAAT). De nämner två vanliga metoder: 1) användning av glutamatdehydrogenas plus toxinanalyser arbitrerade av nukleinsyraamplifieringstest (NAAT) eller 2) NAAT plus toxinanalys. Rekommendationen bedöms dock som ”svag” med ”låg kvalitet på bevisen”. Panelen påpekar att den känsligaste diagnosmetoden i själva verket är enbart NAAT eller en flerstegsalgoritm, som bör användas när det finns på förhand överenskomna institutionella kriterier för inlämning av avföring.
Dessa rekommendationer återspeglar den pågående bristen på konsensus när det gäller optimala strategier för diagnostisering av CDI. Rekommendationerna varierar ytterligare när man tar hänsyn till rekommendationer från länder utanför USA: Europeiska riktlinjer prioriterar toxindetektion och lägger mindre vikt vid NAAT eller flerstegsalgoritmer.
Diagnostiska strategier och begränsningar
Toxindetektion och odling: Historiskt sett har laboratoriets guldstandard varit toxigenisk odling där C. difficile odlas från avföring och isolaten testas för deras förmåga att producera toxin; avföringsfiltraten kan också testas direkt för toxin via en cellcytotoxicitetsanalys (CCNA) som en alternativ referensmetod. Dessa metoder tar flera dagar och är därför olämpliga för rutinmässig laboratorietestning. I en stor brittisk studie jämfördes toxigena odlingar med cytotoxicitetstester på mer än 12 000 prover och resultaten korrelerades med kliniska data. De fann att positiva cytotoxicitetstestresultat korrelerade med ökad dödlighet, medan positiva toxigena kulturer med negativa toxicitetstest inte gjorde det, vilket innebär att detektion av toxin var avgörande för den kliniska diagnosen av CDI. Toxindetektion med kvalitativa enzymimmunoassays (EIA) brukade vara en grundpelare för diagnostik, men dessa tester har betydande begränsningar i känslighet jämfört med toxigena odlingar (52-75 %), även om de har högre specificitet (96-98 %) jämfört med odlingar. Det finns en rad olika tillgängliga kommersiella laboratoriealternativ för CDI-testning som är väl beskrivna i nyligen publicerade översikter.
Glutamatdehydrogenasdetektion: Glutamatdehydrogenas (GDH) immunoassays och andra molekylära tester har utvecklats för att åtgärda den dåliga känsligheten hos toxin EIAs. GDH-immunoassays påvisar det mycket konserverade metaboliska enzymet som finns i alla C. difficile-isolat. Detta antigen finns dock i både toxigena och icke-toxigena stammar av C. difficile och därför kan GDH-testning endast vara ett screeningsteg i en två- eller trestegsalgoritm före ett mer specifikt toxintest och/eller ett molekylärt test för påvisande av toxingener.
NAAT: Även om NAAT har använts i forskningssammanhang sedan början av 1990-talet fanns den första plattformen som godkändes av den amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten inte tillgänglig förrän 2009. Det finns för närvarande minst 12 kommersiella plattformar som upptäcker genmål, inklusive tcdA (toxin A-gen), tcdB (toxin B-gen) och 16S ribosomalt RNA (rRNA). Testerna är känsligare än toxin EIA och eventuellt GDH EIA, men mindre känsliga än toxinodling.
Algoritmbaserad flerstegstestning och ultrakänslig detektion av toxiner: Komplexiteten i CDI-testvärlden förvirras ytterligare av motstridiga uppgifter om det bästa algoritmiska tillvägagångssättet för diagnostik. Forskare i en prospektiv kohortstudie på ett enda center jämförde behandlingsbehovet och naturhistorien hos patienter som var toxin-EIA-positiva/PCR-positiva (131 patienter) med toxin-EIA-negativa/PCR-positiva patienter (162) och toxin-EIA-negativa/PCR-negativa patienter (1123). De fann att toxin-positiva/PCR-positiva patienter hade fler diarré- och CDI-relaterade komplikationer, medan de toxin-negativa/PCR-positiva och toxin-negativa/PCR-negativa patientgrupperna hade liknande frekvenser av gastrointestinala komplikationer jämfört med varandra (7,6 % vs. 0 % vs. 0,3 %; p <0,001). Det fanns 11 CDI-relaterade dödsfall i den toxinpositiva/PCR-positiva gruppen, ett dödsfall i den toxinnegativa/PCR-positiva kohorten och inga dödsfall i den toxinnegativa/PCR-negativa gruppen. Forskarna drog därför slutsatsen att enbart toxinprov kan vara tillräckligt för CDI-diagnostik och att användning av enbart NAAT-test kan leda till överdiagnostik och överbehandling. Icke desto mindre är NAAT-testning och identifiering av asymtomatisk bärarskap relevant för infektionskontroll och epidemiologiska syften.
Kontrariskt nog rapporterade en annan forskargrupp att frånvaron av toxin i avföringen kanske inte är förutsägande för CDI-svårighetsgrad och att NAAT-positiva, EIA-negativa resultat således fortfarande är kliniskt betydelsefulla. Forskarna rekommenderade att NAAT bör användas som den primära diagnostiska metoden för CDI, även om de inte specificerade något föredraget diagnostiskt algoritmiskt tillvägagångssätt. I den här studien deltog 296 patienter där 143 klassificerades som äkta CDI baserat på flera olika metoder. De fann ingen skillnad i toxin EIA-positivitet mellan patienter med mild vs. svår sjukdom (49 % vs. 58 %, p = 0,31). Toxin EIA-detektion begränsas dock av en relativt okänslig detektionsgräns. De bästa analytiska detektionsgränserna för EIA ligger mellan 0,8-2,5 ng/ml, medan toxinkoncentrationer för cellbaserade cytotoxicitetsanalyser i vissa scenarier beräknades vara så låga som 30 pg/ml. I nyare studier har man därför ifrågasatt om ultrakänslig toxindetektion i själva verket bättre kan skilja kolonisation från verklig infektion med hypotesen att kolonisation skulle ha lägre toxinhalter.
Denna hypotes testades i en nyligen genomförd prospektiv studie på ett enda center där man undersökte prestandan hos en ultrakänslig analys för detektion och kvantifiering av C. difficile-toxiner med hjälp av Single Molecule Arrays-teknologi (Simoa), som kan ge ett analytiskt gränsvärde på cirka 1 pg/ml och ett kliniskt gränsvärde på cirka 20 pg/ml. Forskarna jämförde toxinkoncentrationer hos CDI NAAT-positiva patienter (n=122) definierade som de som hade ≥3 oformade avföringar under 24 timmar före avföringssamlingen eller ihållande diarré i de kliniska anteckningarna jämfört med asymtomatiska bärare som var NAAT-positiva (n=44) men som inte hade någon rapport om diarré under de 48 timmarna före avföringssamlingen. Forskarna var förvånade över att konstatera att koncentrationen av toxin A och B i avföringen inte kunde skilja en patient med CDI från en asymtomatisk bärare. Mediankoncentrationen av toxin A, toxin B och toxin A+B samt NAAT:s cykeltröskelvärden (Ct) i de två grupperna var i själva verket likartade. Frekvenserna av toxin A+B-koncentrationer ≥ 20pg/ml (klinisk cutoff) var jämförbara mellan CDI-NAAT+ (65 %) och bärare-NAAT+ (77 %) grupper. De noterade dock att om de definierade CDI- och bärargrupperna inte bara genom NAAT-positivitet utan även toxinpositivitet (där toxin A + B ≥ 20 pg/ml) så fanns det signifikanta skillnader i mediankoncentrationer av toxin (mediankoncentrationer av toxin A, B och A+B) och Ct-värden. Följaktligen, medan studien observerade att patienter med mycket låga nivåer av toxin fortfarande kunde ha betydande diarré som överensstämde med CDI och omvänt asymtomatiska patienter kunde få betydande mängder toxin detekterade, över ett tröskelvärde för toxin hade asymtomatiska patienter lägre koncentrationer av toxin som detekterades.
Sammanfattningsvis tycks ultrasensitiv toxindetektion inte vara det heliga svaret på hur man effektivare kan diagnostisera CDI och särskilja sjukdom från kolonisering. De överraskande resultaten från denna studie väcker den centrala frågan varför patienter med höga toxinhalter i avföringen kan vara asymtomatiska och tvärtom patienter med mycket låga toxinhalter kan vara symtomatiska. Vissa experter antar att värdfaktorer, t.ex. antitoxinantikroppar, kan förklara varför patienter kan vara asymtomatiska trots förekomsten av C. difficile-toxiner i avföringen. Det kan vara så att ett test som påvisar sådana antikroppar eller andra värdbiomarkörer, utöver patogenupptäckt, kan behövas för att förbättra diagnosen av CDI. Medan vi ivrigt väntar på ytterligare forskning om CDI-diagnostik, befinner vi oss fortfarande på ett välkänt område inom den kliniska medicinen där tester ger stödjande men inte definitiva bevis för en diagnos, och vi måste vara medvetna om deras inneboende begränsningar.
Ovanstående representerar författarens åsikter och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna hos American Society for Microbiology.