Transmigrerade neutrofiler i tarmlumen engagerar ICAM-1 för att reglera epitelbarriären och rekrytering av neutrofiler

Transmigrerade neutrofiler i tarmlumen engagerar ICAM-1 för att reglera epitelbarriären och rekrytering av neutrofiler

ICAM-1 främjar PMN-adhesion och lokomotion på det apikala epitelmembranet under inflammationsförhållanden

I kryptoabscesser, som observeras vid aktiv IBD, observeras PMN som infiltrerar tarmkryptorna ofta i intim kontakt med den apikala (luminal) epitelytan.14 För att undersöka PMN-IEC-interaktioner under de sena stadierna av TEM modellerade vi PMN-migration över tarmepitelet under inflammatoriska förhållanden med hjälp av en tidigare beskriven transwelluppställning.19 PMN TEM i den fysiologiska basolaterala-till-apikala riktningen över kontroll- eller interferon-γ (IFNγ)-behandlade T84 IEC:er inducerades genom tillsats av en transepitelial N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)-gradient (100 nM). Exponering av T84 IECs för IFNγ (100 U ml-1, 24 h) hade ingen signifikant effekt på IEC:s barriärfunktion eller på uttryck och subcellulär lokalisering av viktiga junctionalproteiner JAM-A, Occludin och ZO-1 (Supplementary Figure S1 online). IFNγ-behandling hade ingen signifikant effekt på antalet PMN som fullbordade TEM; det ökade dock signifikant antalet apikalt associerade PMN (från 8,7±1,8 %, obehandlad, till 19,7±1,9 %, IFNγ, apikalt, figur 1a). I överensstämmelse med denna ökning minskade antalet icke-migrerade PMN (PMN i den övre kammaren, basalt) signifikant (∼1,5-faldigt) efter IFNγ-behandling, vilket tyder på en ökad migrationshastighet (figur 1a). Antalet PMN inom det epiteliala monolaget (epith) förändrades inte. Representativa konfokala immunofluorescensbilder (figur 1b, övre paneler) och z-projektioner (nedre paneler) visar apikalt associerade PMN efter migration över IFNγ-stimulerade, men inte kontrollerade T84-monolager. Eftersom IFNγ tidigare har visat sig inducera ICAM-1-uttryck i inflammerat epitel,27 antog vi att under inflammation förblev PMN som migrerar över epitelmonolager adherenta till det apikala membranet genom Mac-1- och ICAM-1-beroende interaktioner, och därför skulle ha förmåga till ICAM-1-beroende lokomotion, vilket tidigare har observerats i kärlendotel.24, 28 Tidigare resultat bekräftades genom att IFNγ-behandling (100 U ml-1, 24 timmar) gav upphov till en kraftig, tidsberoende ökning av ICAM-1-uttrycket (med en topp 24 timmar efter behandlingen, figur 1c, d) på det apikala membranet hos T84 IEC:s (figur 1e). Denna effekt var specifik för IFNγ, eftersom exponering av T84 och SKCO15 IECs för tumörnekrosfaktor-α (TNFα; 10 ng ml-1) inte lyckades inducera ICAM-1-uttryck (kompletterande figur S2A,B). ICAM-1-uppreglering observerades också i kryptoepitelet i kolonbiopsier från patienter med aktiv ulcerös kolit jämfört med friska slemhinnor (figur 1f). Vidare bekräftades ICAM-1- och Mac-1-beroende PMN-adhesion till apikala IEC-membran genom att tillsätta antingen anti-ICAM-1- eller anti-Mac-1-funktionsblockerande antikroppar (Abs; 20 μg ml-1) reverserade den IFNγ-inducerade ökningen av PMN-adhesion (kompletterande figur S3A). Intressant nog resulterade inhibering av PMN Mac-1 i en kraftigare minskning (>3 gånger) av PMN-adhesion jämfört med inhibering av ICAM-1, vilket tyder på att Mac-1 binder andra ligander på epitelytan utöver ICAM-1.

Nästan undersökte vi om apikalt vidhängande PMN efter att ha korsat epitelet uppvisade apikal lokomotion. Fas-kontrast-tidsförloppsmikroskopi användes för att spåra och kvantifiera beteendet hos enskilda PMN som fästs vid IEC:s apikala membran. PMN i avsaknad av exogen stimulus uppvisade liten rörelse, men 59,3±7,6 % av apikalt associerade PMN efter migration över IEC uppvisade ett mycket rörligt beteende (figur 2a) med genomsnittliga krypningsavstånd på 65,6±6,2 μm (figur 2b). TEM inducerade en kraftig ökning av Mac-1-uttrycket på PMN-cellytan (figur 2c), vilket stämmer överens med dess roll i PMN-IEC apikala interaktioner. Det är viktigt att antalet PMN som uppvisade apikal lokomotion ökade signifikant när IEC stimulerades med IFNγ för att uppreglera ICAM-1 (88±3,6 %, IFNγ, jämfört med 59,3±7,6 %, obehandlat IEC). Under dessa förhållanden färdades PMN betydligt längre sträckor (101±10,0 μm, IFNγ, jämfört med 65,6±6,2 μm, obehandlade IEC, figur 2b) längs det apikala epitelmembranet. För att bekräfta ICAM-1:s roll i förmedlingen av PMN:s lokomotion, vände tillägget av en funktionsblockerande anti-ICAM-1-antikropp (Ab) IFNγ-effekterna och minskade både antalet och de avstånd som PMN färdades (61,4±7,8 % respektive 73,6±6,1 μm, figur 2a,b). Hämning av Mac-1 upphävde lokomotion av de återstående adherenta PMN (figur 2a och kompletterande filmer S1 och S2), vilket bekräftar en exklusiv roll för Mac-1 i denna process. Effekterna av Mac-1-hämning på PMN:s lokomotion framhävs ytterligare i tidsförloppsbildsekvenser (figur 2d) och genom förflyttningsbanor för sex representativa PMN (figur 2e). PMN:s krypningshastigheter varierade från 3 till 7 μm min-1 och var inte signifikant annorlunda på ostimulerade jämfört med IFNγ-stimulerade IEC:er (kompletterande figur S3B).

PMN-adhesion till det apikala epitelmembranet komprometterar epitelbarriärfunktionen

Nästan undersökte vi effekterna av PMN-interaktioner med apikalt uttryckta epiteliga ligander på epitelbarriärfunktionen. I dessa experiment tillsattes PMN apikalt till konfluenta T84 IECs som odlades på permeabla underlag (0,4 μm porstorlek, för liten för att tillåta PMN TEM), och TER, som ett index för epitelbarriären, mättes under 12 timmar under specificerade förhållanden. Tidsperioden på 12 timmar valdes för att undvika effekterna av apoptotiska PMN på epitelbarriären.29 fMLF (100 nM)-stimulerad PMN-adhesion till T84 IECs utlöste en tidsberoende minskning av TER under en 12-timmarsperiod (∼60 %, figur 3a). Viktigt är att tillsättning av PMN till det apikala membranet hos T84 IECs som förbehandlats med IFNγ, vilket vi har visat leder till ökad ICAM-1-beroende PMN-adhesion (figur 1a), resulterade i en ytterligare minskning av TER (∼40 % första 2 h och ∼90 % under 12 h). Enbart IFNγ-behandling hade ingen effekt på TER. För att testa om den observerade ökningen av epitelpermeabiliteten berodde på en direktkontakt mellan epitelceller och PMN använde vi ett anti-Mac-1-hämmande Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1) för att hämma PMN-adhesion till IFNγ-stimulerade IECs. Hämning av Mac-1 dämpade signifikant den PMN-inducerade minskningen av TER efter IFNγ-stimulering (figur 3a). Viktigt är att vi i separata experiment ytterligare bekräftade att den PMN-inducerade minskningen av TER i både ostimulerade och IFNγ-behandlade epitelmonolager var beroende av direkt kontakt mellan PMN och det apikala epitelmembranet, och inte förmedlades genom parakrina mekanismer. I sådana experiment tillsattes PMN till den nedre kammaren i transwells som innehöll inverterade (apikal sida nedåt) T84-monolager och stimulerades med fMLF (100 nM). Under dessa förhållanden fanns det ingen effekt av PMN på epitelbarriären som bedömdes med TER (figur 3b). Exponering av epitelmonolager för 100 nM fMLF i 12 timmar hade ingen signifikant effekt på TER.

Ligering av epitelial ICAM-1 utlöser en MLCK-beroende ökning av tarmepitelpermeabiliteten

Vi observerade att apikal uppreglering av ICAM-1 signifikant potentierade effekterna av Mac-1-beroende PMN-adhesion på epitelbarriären (figur 3a). Vi antog därför att den PMN-inducerade ökningen av permeabiliteten hos IFNγ-behandlade epitelmonolager berodde på PMN-kontaktmedierad ICAM-1-klustring och en induktion av ICAM-1-beroende signalhändelser, vilket tidigare beskrivits i kärlendotel.30, 31 T84 IEC-monolager på permeabla underlag behandlades med IFNγ för att inducera ICAM-1-uttryck, följt av tillsats av tvärbindningsabs mot ICAM-1. Vi bekräftade att Ab-medierad tvärbindning inducerade ICAM-1-klustring (kompletterande figur S2C). Som framgår av figur 4a resulterade Ab-medierad tvärbindning av ICAM-1 i en tidsberoende minskning av TER, vilket korrelerade med ökat paracellulärt flöde av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-dextran (3 kDa, figur 4b). Denna effekt var specifik för ICAM-1, eftersom tvärbindning av andra molekyler på epitelytan, major histocompatibility complex-1 (MHC-1; figur 4) och den kända PMN-liganden CD55 (kompletterande figur S5) inte hade någon signifikant effekt på permeabiliteten. I överensstämmelse med avsaknaden av ICAM-1-uttryck på ostimulerade T84 IEC:er hade applicering av tvärbindningsabs på den apikala ytan av dessa IEC:er i avsaknad av IFNγ-stimulering ingen effekt på TER (kompletterande figur S4A). På samma sätt, i överensstämmelse med IFNγ-inducerad ICAM-1-lokalisering på det apikala epitelmembranet, hade applicering av tvärbindande Abs på den basolaterala aspekten av epitelmonolager ingen signifikant effekt på barriärfunktionen (kompletterande figur S4B).

Vi har tidigare visat att tidiga händelser i PMN TEM (på nivån för det basolaterala epitelmembranet) utlöser MLCK-medierade minskningar av TER9. MLCK har visat sig ha en nyckelroll i regleringen av epitelpermeabiliteten genom att reglera kontraktionen av den perifunktionella aktomyosinringen genom fosforylering av myosin II:s reglerande ljuskedja.32 Vi frågade oss därför om ökad IEC-permeabilitet efter ligering av apikalt uttryckt ICAM-1 var MLCK-beroende. Faktum är att Ab-medierad tvärbindning av ICAM-1 resulterade i MLCK-fosforylering (Tyr 464), vilket överensstämmer med MLCK-aktivering (figur 4c). En sådan aktivering åtföljdes av minskad apikal brush boarder och det perifunktionella F-actinet (figur 4d), vilket tyder på en omorganisering av aktincytoskeletalen. Viktigt är att inhibering av ICAM-1-ligering-inducerad MLCK-fosforylering i T84-celler med ML-7 (20 μM,33 kompletterande figur S4C) förhindrade ICAM-1-inducerad F-actin-reorganisering (figur 4d), minskningen av TER (figur 4a) och ökningen av paracellulärt dextranflöde (figur 4b). Enbart behandling med ML-7 (20 μM) hade ingen effekt på TER. Tillsammans tyder dessa data på att under inflammatoriska förhållanden utlöser PMN-kontakt med den apikala ytan av kryptoepitelceller ICAM-1-beroende signalhändelser, vilket resulterar i ökad permeabilitet.

Ingenjörisering av ICAM-1 på det apikala epitelmembranet underlättar ökad PMN TEM

Då ligering av apikalt uttryckt ICAM-1 ökade epitelpermeabiliteten utförde vi experiment för att undersöka om ICAM-1-beroende förändringar i epitelbarriärfunktionen skulle resultera i ökad PMN TEM. Vi undersökte först om PMN-engagemang av ICAM-1 på det apikala IEC-membranet påverkade PMN-TEM i den fysiologiskt relevanta riktningen från basolateralt till apikalt.34 I dessa experiment stimulerades PMN att migrera över epitelmonolager och de transmigrerade cellerna samlades in och applicerades på nytt under 1 timme på den apikala ytan av nya epitelmonolager (2,5 × 105 PMN per monolager) med eller utan IFNγ-förbehandling. Efter 1 h av PMN-epitelkontakt tvättades monolagerna fria från vidhäftande PMN och användes för efterföljande PMN-TEM-analyser i riktning från basolateralt till apikalt. Apikalt införande av PMN i IFNγ-behandlade, men inte i obehandlade epitelmonolager utlöste en signifikant ökning av PMN TEM (1,7 gånger, figur 5a). Enbart IFNγ-behandling eller närvaro av PMN nära den apikala ytan, men utan direktkontakt med monolager, hade ingen effekt på PMN TEM (figur 5a). I parallella experiment undersöktes PMN TEM efter specifik Ab-medierad tvärbindning av ICAM-1. I överensstämmelse med effekten av ICAM-1-korsbindning på IEC:s barriärfunktion ökade Ab-medierad korsbindning av ICAM-1 på IFNγ-behandlade T84 IEC:er signifikant PMN TEM (1,9 ± gånger, figur 5b) jämfört med korsbindning av en apikalt uttryckt kontrollmolekyl, MHC-1. Som förväntat hade tillämpningen av ICAM-1-korsbindningsprotokoll på obehandlade IEC-monolager ingen signifikant effekt på PMN TEM. Tillsammans tyder dessa resultat på att PMN som adhererar till det apikala (luminal) IEC-membranet genom engagemang av ICAM-1 kan utlösa förändringar i den epiteliala barriärfunktionen och bidra till regleringen av PMN-rekrytering.

ICAM-1-korslänkning resulterade i MLCK-aktivering, vilket tyder på en aktin-myosin-kontraktion (figur 4). Därför undersökte vi härnäst effekterna av MLCK-hämning och hämning av F-aktin-kontraktila krafter på PMN TEM efter ICAM-1-korsbindning. Ökat PMN TEM inducerat av ICAM-1-korsbindning reverserades när IEC:er förbehandlades med antingen MLCK-hämmaren ML-7 (20 μM, 1 h33) eller myosinmotor II-hämmaren Blebbistatin (10 μM, 1 h,35 figur 5c). Dessa resultat tyder på en roll för actomyosinkontraktion nedströms ICAM-1 i regleringen av PMN TEM. Behandling med enbart ML-7 eller Blebbistatin hade ingen effekt på PMN TEM (Figur 5c).

Ab-medierad ligering av ICAM-1 i murintestinallumen leder till MLCK-beroende ökning av epitelpermeabilitet och ökad PMN-rekrytering

Nästan utförde vi in-vivo-experiment för att undersöka effekten av ICAM-1-ligering på tarmepitelbarriärens barriärfunktion och PMN-rekrytering med hjälp av en modell för tarmslinga hos mus (Figur 6b). I denna modell bedömdes permeabiliteten hos intakta, blodperfunderade segment av tunntarmen efter introduktion av FITC-dextran i tarmlumen. Som visas i figur 6a, även om ICAM-1 inte upptäcktes i ostimulerat epitel (övre panelen), resulterade intraperitoneal (i.p.) administrering av IFNγ och TNFα (500 ng, 24 timmar) i en kraftig induktion av ICAM-1-uttryck. Särskilt inducerat ICAM-1 lokaliserades till apikala regioner av murin krypt IECs ovanför Claudin-2 (figur 6a, nedre panelen). Parallellt observerade vi att cytokinbehandlingen resulterade i ∼2-faldig ökning av permeabiliteten för 3-kDa FITC-dextran (figur 6c).

Viktigt nog inducerade införandet av ICAM-korsbindningsabs, men inte abs mot kontrollproteinet MHC-1, i lumen av cytokinstimulerade tarmslingor en ytterligare ∼1,5-faldig ökning av permeabiliteten för dextran jämfört med enbart cytokinbehandling (figur 6c). För att bekräfta att ökningar av tarmepitelpermeabiliteten medierades specifikt av epiteliala ICAM-1-inducerade signalhändelser använde vi peptider som härrörde från den cytoplasmatiska domänen av ICAM-1 (ICAM-1-peptid) för att hämma ICAM-1:s förmåga att förmedla nedströms signalhändelser. Det har tidigare visats i vaskulärt endotel att ICAM-1, men inte kontrollpeptid, hämmade interaktioner mellan ICAM-1 och målproteiner och därmed förhindrade ICAM-1-beroende signalering utan att det påverkade bindningen till extracellulära leukocytligander.22, 24 Tillsats av ICAM-1, men inte kontrollpeptid (100 μg ml-1, 30 min), hämmade ICAM-1-ligationsinducerade ökningar av tarmens permeabilitet (figur 6c). Abs som introducerades intraluminalt i tarmslingor (ostimulerade och efter IFNγ/TNFα-aktivering) bekräftades inte passera epitelet, vilket utesluter ett eventuellt indirekt bidrag från lamina propria-celler till de observerade effekterna (kompletterande figur S6).

För att ytterligare stödja MLCK:s roll i ICAM-1-medierad signalering, inhiberades MLCK-aktivering med hjälp av ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) före ICAM-1-korsbindning förhindrade ökningen av permeabiliteten (figur 6c). Dessa data visar att ökad tarmepitelpermeabilitet in vivo efter ICAM-1-ligering är MLCK-beroende.

Då ökad epitelpermeabilitet är förknippad med ökad PMN-migration, frågade vi oss om ligering av ICAM-1 skulle leda till ökad PMN-rekrytering in vivo. Med hjälp av den murina tarmslingemodellen inducerades PMN-infiltration i tarmslemhinnan och migration in i lumen genom luminal administrering av kemoattraktanten CXCL1 (1 μM i 200 μl Hank’s balanserad saltlösning (HBSS)+) och kvantifierades med hjälp av immunofluorescensmärkning/konfokal mikroskopi respektive analys av spolad vätska som förberetts på cytospins och färgats med Diff-Quik. I avsaknad av kemoattraktor påvisades inte PMN i tarmepitelet eller i tarmlumen (visas inte), men luminal administrering av CXCL1 utlöste betydande PMN-migration in i epitelskiktet (figur 7a) och ackumulering i tarmlumen (figur 7c). I överensstämmelse med den cytokininducerade ökningen av permeabiliteten ökade IFNγ/TNFα-behandlingen antalet PMN i tarmepitelet med ∼2,2 gånger och ∼1,7 gånger i lumen. Viktigt är att tillsats av ICAM-1-korsbindande Abs i lumen av cytokinbehandlade tarmslingor ytterligare ökade (jämfört med enbart cytokinbehandling) antalet PMN både i epitelet (∼1,6-faldigt, figur 7a,b) och i lumen (∼1,4-faldigt, figur 7c,d). PMN (grönt) som infiltrerar tarmepitelet (rött) visas på representativa bilder av vävnadssektioner från cytokinaktiverade tarmslingor efter ICAM-1-ligering (figur 7b). På samma sätt visas PMN som migrerade in i lumen efter ICAM-1-ligering på representativa bilder av lavagevätskor från tarmslingor (figur 7d).

Sammanhängande med ICAM-1-ligering-inducerade ökningar av epitelpermeabiliteten var ökad PMN-migration in i tarmlumen beroende av ICAM-1-medierade signalhändelser och MLCK-aktivering. Både intraluminell tillsats av ICAM-1-peptid, men inte kontrollpeptiden (visas inte; 100 μg ml-1, 30 min), och hämning av MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) före Ab-medierad tvärbindning av ICAM-1 hämmade helt och hållet den ICAM-1-ligationsinducerade ökningen av PMN-migrationen (figur 7a,c). Dessa resultat tyder på att ICAM-1 på det apikala tarmepitelmembranet under inflammationsförhållanden äventyrar barriärfunktionen, vilket underlättar ökad rekrytering av PMN in vivo.