La cadherina E se une a la desmogleína para facilitar el ensamblaje del desmosoma
1) Este trabajo aborda el mecanismo de regulación del ensamblaje del desmosoma mediado por la cadherina. Aunque los revisores están de acuerdo en que el trabajo es potencialmente emocionante, plantearon varias cuestiones importantes. En primer lugar, todos están de acuerdo en que el modelo debe ser probado mediante el examen de la co-localización en las células que expresan la cadherina mutante.
Agradecemos a los revisores por sugerir estos importantes experimentos. Como se describe en nuestra respuesta detallada a los revisores, ahora hemos comprobado el papel de las diferentes mutaciones de Ecad para impedir el reclutamiento de Dsg2 en los queratinocitos. Expresamos la longitud completa de Ecad WT, y los mutantes de Ecad (L175D, K14E, y W2A-K14E) en queratinocitos de ratón Ecad-knockout, Pcad-knockdown (EKO/PKD) y analizamos el reclutamiento de Dsg2 a los sitios de contactos intercelulares. Estos resultados confirman que el aminoácido L175 de Ecad, media las interacciones de Dsg2 y facilita la formación temprana del complejo desmosómico en las células. Nuestros experimentos también revelan que el ensamblaje del desmosoma se inicia en los sitios de homodimerización trans de Ecad.
2) También hay preocupaciones sobre la fiabilidad de los datos de co-localización en la Figura 5; se necesita un análisis más riguroso para demostrar que la co-localización de E-cadherina y desmoplakina ocurre mucho más de lo que se esperaría por casualidad.
En el campo, los desmosomas se identifican por el tamaño y la apariencia de vía de ferrocarril de la tinción de DP en las imágenes SIM. Como se indica en nuestra respuesta a los revisores, utilizamos este enfoque establecido para localizar los desmosomas. Además, ahora subrayamos que no estamos midiendo la colocalización sino el reclutamiento de diferentes cadherinas (Ecad y Dsg) a regiones de la membrana que muestran este patrón.
3) En segundo lugar, el modelado asume que L175 forma parte de la interfaz, pero sin la evaluación de la estequiometría no se puede descartar que la pérdida de unión sea un efecto indirecto de la pérdida de dimerización cis. El modelado también se considera débil, ya que no se probaron interfaces complementarias en Dsg2. Sin estos datos, la modelización molecular debe considerarse altamente especulativa.
Como se describe en nuestra respuesta detallada a los revisores, las simulaciones computacionales anteriores y los experimentos biofísicos muestran que la formación del dímero cis de Ecad requiere una dimerización trans previa. En consecuencia, las Ecads no pueden unirse a la superficie como dímeros cis independientes y preformados. Esto hace que sea muy poco probable que las interacciones de unión medidas se produzcan entre los dímeros cis de Ecad y Dsg2. No obstante, estamos de acuerdo con los revisores en que los resultados del acoplamiento molecular son bastante débiles. Por lo tanto, hemos eliminado estos resultados de modelado del manuscrito.
4) Por último, como señaló el revisor 3, incluso si se apoya en estas adiciones, el modelo y la sección de Discusión no explican realmente cómo la E-cadherina regula los desmosomas.
Basado en nuestros nuevos datos de estructura-función celular, proponemos ahora un modelo por el que el ensamblaje del desmosoma es facilitado tanto por las interacciones directas cis de Ecad y Dsg2 como por la unión trans de Ecad opuesta. En nuestro modelo, la homodimerización trans de Ecad de células opuestas sirve como señal espacial para coordinar el ensamblaje del desmosoma. Posteriormente, Ecad forma complejos cis-dímeros con Dsg2 para iniciar el ensamblaje del desmosoma. El modelo se presenta y discute en el nuevo manuscrito.
Revisor nº 1:
1) Los experimentos de AFM con una sola molécula son la parte más sólida del artículo. Sin embargo, en mi lectura los autores no excluyen la posibilidad de que los eventos de unión que observan puedan deberse a interacciones entre cis-dímeros de E-cadherina preformados. Es importante establecer la estequiometría de la interacción, ya que si la unión a Dsg2 requiriera un cis-dímero de E-cadherina, cambiaría la interpretación del resultado de que la mutación L175D bloquea la interacción Dsg2/E-cad. Este escenario también cuestionaría la validez de las simulaciones de acoplamiento. En mi opinión, la baja probabilidad de unión por contacto de la punta del AFM con la superficie es una prueba débil de que la unión refleje necesariamente la interacción de dos monómeros, como tampoco lo es la baja densidad media de moléculas de cadherina en la superficie. Además, las cadherinas están inmovilizadas con estreptavidina, que tiene múltiples sitios de unión de biotina.
Por estas razones, creo que es importante probar que la heterodimerización ocurre entre monómeros. Para ello, recomendaría medir sistemáticamente la probabilidad de interacción de la punta con la superficie en función de la densidad superficial de E-cadherina en la superficie del cubreobjetos. Si la interacción requiere efectivamente E-cadherina monomérica, esta medición debería escalar linealmente con la E-cadherina añadida, al menos a bajas densidades. Sin embargo, esta medida específica no es necesaria – cualquier medida que establezca la estequiometría servirá.
Simulaciones informáticas anteriores (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) han demostrado que la homodimerización de Ecad cis requiere la formación previa de Ecad trans-dímero. Del mismo modo, mediciones anteriores de FRET de una sola molécula han demostrado que no es posible formar dímeros cis de Ecad independientes, incluso cuando los monómeros de Ecad se colocan muy cerca en una orientación cis (Zhang et al., 2009). En conjunto, estos resultados sugieren que en nuestros experimentos, las Ecads no pueden ser inmovilizadas en la punta del AFM o en el sustrato como cis-dímeros preformados. En consecuencia, el fracaso del mutante Ecad-L175D para interactuar con Dsg2 no se debe a la ausencia de dimerización cis de Ecad. Ahora discutimos esto en la subsección «Leu 175 media las interacciones de Ecad y Dsg2» del manuscrito.
Desgraciadamente, las limitaciones técnicas no permiten el experimento de estequiometría de proteínas que sugiere el revisor. En nuestros experimentos, utilizamos densidades de superficie de proteínas que nos permiten identificar sin ambigüedad los eventos de unión individuales a partir del correspondiente estiramiento de los tethers de PEG. Si se aumenta la densidad de la superficie de la cadherina, como propone el revisor, aumenta la probabilidad de que se produzcan simultáneamente múltiples eventos de unión de Ecad, lo que hace que un análisis cuantitativo de la probabilidad de unión de la proteína no sea fiable. Por esta razón (junto con la debilidad intrínseca de nuestro análisis de acoplamiento), hemos excluido las simulaciones de acoplamiento de proteínas del manuscrito.
Por último, en el manuscrito revisado, ahora utilizamos el análisis de clústeres para agrupar los eventos de desunión de una sola molécula para la Espectroscopia de Fuerza Dinámica (DFS). Recientemente hemos demostrado que el algoritmo de agrupación de K-means que empleamos, mejora en gran medida la estimación de los parámetros cinéticos en DFS (Yen y Sivasankar, 2018). En consecuencia, los tiempos de vida que ahora reportamos para las interacciones Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 y Dsc2/Dsc2 son más confiables.
2) Las simulaciones de acoplamiento son interesantes, pero en mi opinión ofrecen una evidencia débil para la geometría de unión específica que los autores proponen. Recomiendo encarecidamente que los autores sean más cautelosos en la interpretación y presentación de estos resultados, o que presenten datos adicionales, por ejemplo imágenes EM, que apoyen o refuten el resultado computacional.
Estamos de acuerdo con el revisor en que los datos de acoplamiento de proteínas son débiles. Por lo tanto, hemos eliminado estos resultados del manuscrito.
3) Lamentablemente, las imágenes SIM no son convincentes tal como se presentan actualmente. En particular, no está claro qué cuenta como «desmosoma» en el análisis de los autores (Figura 5B). Se necesitaría un tratamiento más sofisticado de la colocalización para establecer el punto de que la E-cadherina y la desmoplaquina se colocalizan, y que esta colocalización disminuye a medida que las uniones maduran.
En estudios anteriores (Stahley et al., 2016a, 2016b) hemos utilizado la apariencia de «vía férrea» de la AD revelada por las imágenes de superresolución para definir los desmosomas por inmunofluorescencia (como se representa en la Figura 3A). Otros en el campo también han utilizado la morfología de pista de «ferrocarril» para identificar los desmosomas en las imágenes SIM (ver por ejemplo: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). El tamaño y la organización de estas estructuras, tal y como revela la SIM, es totalmente coherente con las definiciones clásicas de EM de los desmosomas. Medimos la intensidad de los píxeles para las dos cadherinas (Ecad o Dsg2) dentro de estas estructuras utilizando un análisis de imagen estándar. Es importante destacar que no pretendemos afirmar que exista una co-localización. Más bien, estamos midiendo el reclutamiento de cadherinas en dominios de membrana que muestran patrones de tinción de vías de ferrocarril DP. Somos conscientes de que a veces es difícil discernir las vías de ferrocarril en los primeros momentos. Por esta razón, el momento más temprano en que consideramos que podíamos identificar la tinción de la vía férrea de buena calidad fue a la hora. Además, sólo realizamos mediciones en lugares en los que podemos observar los patrones de las vías férreas, en lugar de los puntos DP. Por último, nuestro hallazgo de que Ecad está presente en los desmosomas nacientes es coherente con los experimentos clásicos de inmuno-EM que muestran que Ecad puede localizarse en los desmosomas (Jones, 1988). Por lo tanto, nos sentimos seguros de nuestra capacidad para identificar los desmosomas y para medir los niveles relativos de las dos cadherinas en diferentes momentos.
4) Dejo este último punto a la discreción del editor. En mi opinión, los datos de colocalización, aunque se tomen como ciertos, no establecen la relevancia funcional. Estaría muy bien ver un experimento de knockdown/reconstitución con E-cadherina L175D. La predicción es que esta molécula nunca se colocalizará con la desmoplaquina, independientemente de la edad de la unión. La violación de esta predicción pondría en duda el modelo favorecido por los autores.
Basado en la sugerencia del revisor, hemos realizado ahora experimentos para probar directamente el papel de las diferentes mutaciones del dominio extracelular de Ecad en impedir el reclutamiento de DP y Dsg2 en los queratinocitos. Estos datos se describen en la subsección «Ecad L175 es esencial para el reclutamiento intercelular eficiente de Dsg2 y el ensamblaje de desmosomas». Las imágenes correspondientes se muestran en la Figura 5 y en el suplemento gráfico 1 de la Figura 5. Los métodos utilizados se describen en la subsección «Aislamiento, cultivo, transfección e imágenes confocales de queratinocitos primarios». Para estos experimentos, utilizamos queratinocitos de ratón EKO/PKD, que prácticamente no expresan cadherinas clásicas. Hemos demostrado previamente que estos queratinocitos EKO/PKD son incapaces de ensamblar AJs y desmosomas debido a la pérdida de todas las cadherinas clásicas (Michels et al., 2009). Por lo tanto, estas células nos permiten evaluar directamente la capacidad de los mutantes Ecad para i) iniciar la formación de AJ y ii) evaluar su capacidad para reclutar componentes desmosomales a los sitios de formación del contacto inicial célula-célula.
Como estábamos interesados en evaluar la capacidad de los mutantes Ecad para reclutar proteínas desmosomales en las primeras etapas de la formación de la unión, expresamos Ecad WT de longitud completa o los mutantes en queratinocitos EKO/PKD y analizamos el reclutamiento de DP y Dsg2 en los sitios de los contactos intercelulares mediante microscopía confocal. Para examinar el reclutamiento en diferentes etapas de la formación y maduración de la unión, se fijaron los queratinocitos y se realizó una inmunotinción para DP, Dsg y Ecad en tres momentos después del cambio de Ca2+ (3 horas, 6 horas y 18 horas).
Nuestros datos mostraron que 3 horas después del cambio de Ca2+, el 93% de WT-Ecad estaba enriquecido en AJs tempranos tipo cremallera en los sitios de contactos intercelulares. Por el contrario, sólo el 48% de los queratinocitos transfectados con L175D-Ecad formaban cremalleras de AJ, probablemente debido a la alteración de la formación del cis-dímero de Ecad (Figura 5 A, B). En estos primeros momentos tras el cambio de Ca2+, el 66% y el 91% de los contactos de cremallera WT-Ecad eran positivos para Dsg2 y DP respectivamente (Figura 5 A, C, D, E). Cuando se permitió a las células participar en la adhesión intercelular dependiente de Ca2+ durante 18 horas, las localizaciones de unión de Ecad-Dsg2 y Ecad-DP aumentaron al 97% y al 100% respectivamente (Figura 5 A, C, D, E). Por el contrario, sólo el 39% de los contactos cremallera inducidos por L175 mostraron el reclutamiento de Dsg2 3 horas después de cambiar a Ca2+ alto, lo que aumentó al 65% a las 18 horas (Figura 5 A, C), confirmando que se requiere una interacción directa entre Ecad y Dsg2 para el reclutamiento eficiente de Dsg2 a los primeros contactos intercelulares. Del mismo modo, después de 3 horas, sólo el 28% de los contactos intercelulares establecidos por el mutante L175D-Ecad eran positivos para DP, lo que aumentó al 72% después de 18 horas, sugiriendo un mecanismo compensatorio en etapas posteriores (Figura 5 D, E).
Para confirmar que el efecto observado de la mutación L175D no se debía a la formación obstaculizada de AJ, transfectamos los queratinocitos EKO/PKD con el mutante Ecad-K14E de longitud completa que suprime la formación de dímeros X y atrapa a Ecad en una conformación de dímero de intercambio de hebras. Nuestros datos mostraron que sólo el 4% de las células de contacto transfectadas formaron cremalleras en puntos de tiempo tempranos (3 horas) después de cambiar a Ca2+ alto y sólo el 24% de las células de contacto transfectadas mostraron cremalleras en puntos de tiempo tardíos (18 horas) (Figura 5 A, B, Figura 5-suplemento gráfico 1), lo que confirma que K14 es esencial para la formación efectiva de AJ y, por lo tanto, el establecimiento de contacto intercelular. Sin embargo, los pocos AJ de K14E que se formaron, reclutaron a Dsg2, y especialmente a DP, de forma más eficiente que L175D (Figura 5 A, C, E, Figura 5-suplemento gráfico 1). Este resultado confirmó que el retraso en el reclutamiento de Dsg2 a los contactos intercelulares no era el resultado de la incapacidad de Ecad L175D para formar eficientemente AJs, sino que se debía a la ausencia de interacción directa entre Ecad y Dsg2. Como nunca se produjo una co-localización de DP y Ecad en ausencia de cremalleras (Figura 5-suplemento gráfico 1), los datos también sugieren que las interacciones trans de Ecad preceden a las interacciones Ecad/Dsg2. Esta conclusión se ve reforzada por nuestro hallazgo de que no se observó el reclutamiento de DP al abolir la adhesión trans de Ecad, y por lo tanto los zippers, mediante la transfección de Ecad-DM de longitud completa (mutante doble W2A-K14E, Figura 5-suplemento gráfico 1) en queratinocitos EKO/PKD. En conjunto, estos resultados confirman que el aminoácido L175 interviene en las interacciones de Dsg2 y facilita la formación temprana del complejo desmosómico en las células.
Revisor #2:
1) El hallazgo de que el residuo L175 de E-cadherina es crítico para la interacción con Dsg2 es intrigante. Sin embargo, no se ha identificado ningún residuo asociado que interactúe. En esta circunstancia, la predicción de una conformación para la interacción E-cadherina/Dsg2 mediante docking parece precaria; parece incierto que la conformación predicha se relacione con la verdadera conformación unida.
Estamos de acuerdo con el revisor en que los datos de acoplamiento de proteínas son especulativos y, por lo tanto, hemos eliminado estos resultados del manuscrito.
2) Sólo existe una tenue conexión entre la interacción Dsg2/E-cadherina propuesta y la biología del ensamblaje del desmosoma. Sin embargo, los autores parecen tener claro el camino a seguir. Argumentan que la presencia de E-cadherina en los desmosomas nacientes (evaluada experimentalmente mediante la tinción conjunta para desmoplakina en la Figura 5) es una prueba del papel de la asociación Dsg2/E-cadherina que han identificado. Ahora que han identificado un mutante que impide esa asociación, los experimentos de la Figura 5 realizados con el mutante deberían conducir a resultados diferentes. Este experimento añadiría sustancialmente al rigor de este trabajo.
Como se describe en la respuesta 4 al revisor 1, expresamos la longitud completa de Ecad WT, y los mutantes de Ecad en queratinocitos EKO/PKD y analizamos el reclutamiento de Dsg2 y DP a sitios de contactos intercelulares. Estos resultados confirman que el aminoácido L175 media en las interacciones de Dsg2 y facilita la formación temprana del complejo desmosómico en las células. Estos datos se describen en la subsección «Ecad L175 es esencial para el reclutamiento intercelular eficiente de Dsg2 y el ensamblaje de desmosomas» del manuscrito. Las imágenes correspondientes se muestran en la Figura 5 y en el suplemento gráfico 1 de la Figura 5. Los métodos utilizados se describen en la subsección «Aislamiento, cultivo, transfección e imágenes confocales de queratinocitos primarios».
Revisor #3:
1) Este manuscrito identifica y caracteriza una interacción molecular entre la E-cadherina y la Desmogleína 2 utilizando proteínas aisladas y muestra un aumento de la colocalización entre estas dos moléculas en los queratinocitos al principio del ensamblaje del desmosoma. Se trata de observaciones potencialmente muy interesantes que pueden explicar cómo las cadherinas clásicas controlan el ensamblaje de los desmosomas. Aunque esto está bien documentado por varios grupos en la literatura, los mecanismos subyacentes son todavía en su mayoría desconocidos. Sin embargo, su conclusión «Nuestros experimentos integrados de una sola molécula, las predicciones de acoplamiento proteína-proteína y las imágenes de superresolución basadas en la célula muestran que las interacciones Ecad/Dsg2 desempeñan un papel importante en el ensamblaje temprano de los desmosomas», declarada al principio de la sección de Discusión, es una exageración bastante fuerte dado que la interacción se basa en la caracterización de dominios extracelulares aislados y en la microscopía estática, aunque de alta resolución. No se hace ningún experimento que demuestre que cuando se perturba esta interacción el ensamblaje del desmosoma se ve efectivamente perjudicado, lo que en mi opinión sería lo mínimo para que este conjunto de datos fuera realmente interesante y relevante para un público amplio.
Como se describe en la respuesta 4 al revisor 1, ahora hemos expresado la longitud completa de Ecad WT, y los mutantes de Ecad en queratinocitos EKO/PKD y hemos demostrado que el aminoácido L175 media en las interacciones Dsg2 y facilita la formación temprana de desmosomas en las células como se evalúa por el reclutamiento de DP. Estos datos se describen en la subsección «Ecad L175 es esencial para el reclutamiento intercelular eficiente de Dsg2 y el ensamblaje de desmosomas» del manuscrito. Las imágenes correspondientes se muestran en la Figura 5 y en el suplemento gráfico 1 de la Figura 5. Los métodos utilizados se describen en la subsección «Aislamiento, cultivo, transfección e imágenes confocales de queratinocitos primarios».
2) También, a la luz del hecho de que la interacción es independiente del calcio mientras que el ensamblaje de desmosomas tempranos dependientes de cadherinas clásicas sí requiere la presencia de calcio (lo que no se discute en absoluto).
Gracias al revisor por este comentario perspicaz. Como se describe en la subsección «Ecad L175 es esencial para el reclutamiento intercelular eficiente de Dsg2 y el ensamblaje del desmosoma», las imágenes confocales de Ecad mutante expresadas en queratinocitos de ratón revelan ahora que el ensamblaje del desmosoma se inicia en sitios de homodimerización trans de Ecad dependientes de Ca2+. Basándonos en nuestros datos, proponemos un modelo según el cual el ensamblaje del desmosoma se ve facilitado tanto por las interacciones cis directas de Ecad y Dsg2 como por la unión trans de Ecad opuesta. En nuestro modelo, la homodimerización trans de Ecad de células opuestas sirve como señal espacial para coordinar el ensamblaje del desmosoma. Posteriormente, Ecad forma complejos de dímeros cis con Dsg2. Una vez localizado dentro del desmosoma nativo, Dsg2 se disocia de Ecad y se une a Dsc2 para formar desmosomas maduros. Dado que el complejo Dsc2/Dsg2 tiene un tiempo de vida más largo que el complejo Ecad/Dsg2 y el complejo Dsc2/Dsc2, es probable que esto permita una sólida adhesión célula-célula y que el desmosoma maduro pueda soportar la fuerza mecánica. Este modelo se describe en la Figura 6 y en la sección de Discusión.
3) Como se trata de una interacción totalmente nueva y de baja afinidad, probablemente sea difícil realizar ensayos de interacción en el contexto de células en las que una célula exprese E-cadherina y la otra Dsg2 para examinar si existe alguna interacción. Sin embargo, como sus datos se basan parcialmente en el modelado, los autores deberían generar también un mutante en el que los A125 y A124 estén mutados para proporcionar una evidencia mucho mejor de la existencia de la propuesta de y-dímeros.
Dado que los resultados del acoplamiento de proteínas no son robustos, hemos eliminado estos datos del manuscrito. Sin embargo, nuestros experimentos con queratinocitos EKO/PKD que muestran que la mutación del aminoácido L175 en Ecad impide el reclutamiento de Dgs2 y especialmente de DP a los sitios de formación de contactos tempranos, demuestra que Ecad-L175 facilita la formación de desmosomas en las células, confirma nuestros resultados biofísicos.
Resumen:
Los revisores consideran que aunque los datos biofísicos son convincentes, se necesita un análisis cuantitativo más riguroso para apoyar las conclusiones hechas a partir de los datos de las Figuras 3 y 5. En principio, estas preocupaciones pueden abordarse con análisis de datos adicionales en lugar de experimentos, y en este caso, consideraríamos un manuscrito revisado.
Agradecemos al editor esta alentadora revisión. Como se describe a continuación, nuestro manuscrito revisado aborda todas las cuestiones destacadas.
1) La conclusión de que la interacción E-cadherina-Dsg es necesaria para la formación inicial del desmosoma se basa en que la colocalización de Dsg y E-cadherina disminuye a medida que la unión madura. Sin embargo, en la Figura 3 no está claro si la colocalización observada con DP es significativa más allá de lo esperado por azar o surge de cambios dependientes del tiempo en la localización subcelular de E-cadherina no relacionados con la maduración de la unión. En la Figura 3C, los experimentos de control mostrados en el panel de la derecha destacan la co-localización de Dsg2 y DP -componentes conocidos del desmosoma- y muestran una estrecha correspondencia en las señales de fluorescencia en los tres puntos temporales. Por el contrario, aunque la expresión de E-cadherina y DP en los paneles de la izquierda parece solaparse en cierta medida, no muestran la correspondencia en las señales observada en los experimentos de control. La respuesta a los puntos de revisión originales sobre este tema (por ejemplo, revisor 1, punto 3) se centra en la definición de un desmosoma, pero no aborda el punto anterior.
Nos gustaría aclarar que no estamos midiendo la co-localización, sino el reclutamiento de Ecad o Dsg2 a regiones de la membrana que muestran un patrón de «vía de tren» de DP. Para que esto quede más claro, hemos modificado el manuscrito revisado para enfatizar que Ecad está «enriquecido en los desmosomas nacientes» en lugar de estar «excluido de los desmosomas maduros».
Para abordar directamente las preocupaciones de los revisores con respecto a nuestra medición del enriquecimiento de Ecad en los desmosomas, ahora mostramos que los niveles relativos de Ecad a lo largo de todo el borde de la célula (relación Ecad:DP en los bordes de la célula) no cambian con el tiempo. Estos datos confirman que el enriquecimiento de Ecad dentro de las vías de DP en los primeros momentos es específico de las regiones desmosomales de la membrana y es significativo más allá de lo esperado por el azar o por los cambios en la localización de E-cadherina no relacionados con la maduración de la unión. Los datos se muestran en la Figura 3-suplemento gráfico 1 y se describen en la subsección «Ecad está presente en los desmosomas nacientes pero no en los desmosomas maduros».
Por último, dado que los escaneos lineales mostrados en la Figura 3 eran confusos, hemos eliminado los escaneos lineales del manuscrito revisado. En su lugar, en la Figura 3B, mostramos ahora varias imágenes representativas de regiones desmosómicas en queratinocitos humanos cultivados en medios de alto Ca2+ durante 1, 3 o 18 horas. Estos resultados enfatizan el mensaje principal de la Figura 3C: Los niveles de Ecad están enriquecidos en los desmosomas nacientes, y los niveles relativos disminuyen a medida que los desmosomas maduran.
2) Se plantearon preocupaciones similares con respecto a la Figura 5, que se supone que muestra que Ecad L175 es esencial para el reclutamiento intercelular eficiente de Dsg2 y el ensamblaje de desmosomas. Las imágenes del panel A muestran, en efecto, una dramática diferencia en la localización de Dsg2 y DP en relación con la cadherina WT o mutante. Mientras que Dsg2 y DP se co-localizan con WT o K14E Ecad en las uniones, permanecen en puntas separadas flanqueando la unión L175D Ecad y no se co-localizan con ella. Sin embargo, no está claro qué cuantificaron los autores para comprobar la importancia de este fenotipo. En B, ¿qué es el «% de unión que forma contactos»? ¿Cómo se define un contacto? ¿Qué uniones están midiendo? ¿AJ o desmosomas? En C y E, ¿qué quieren decir con % de uniones Dsg2 o DP positivas? ¿Cómo se definieron las uniones?
Ahora hemos añadido un panel de figuras (Figura 5-suplemento de figuras 1A) para ilustrar los criterios de cuantificación y las categorías de unión que se utilizaron en nuestro análisis. Este panel muestra ejemplos de células transfectadas con el mutante Ecad que no (panel de la izquierda) o sí (panel de la derecha) muestran la formación de AJ intercelular. Para el reclutamiento de Dsg2 o DP, sólo cuantificamos aquellas interfaces intercelulares en las que se observaron cremalleras AJ. En los recuadros del panel de la figura, mostramos ejemplos de contactos positivos para AJ que son positivos para DP o negativos para DP.
En la subsección «Ecad L175 es esencial para el reclutamiento intercelular eficiente de Dsg2 y el ensamblaje de desmosomas» del manuscrito, declaramos ahora que la capacidad de los queratinocitos transfectados para formar AJ se evaluó primero mediante la formación de patrones de Ecad tipo cremallera en los contactos intercelulares. Hemos demostrado previamente que estas cremalleras representan AJs tempranas y reclutan proteínas marcadoras de AJ como la vinculina (Rübsam et al., 2017). Solo examinamos las interfaces intercelulares con cremalleras AJ, por su capacidad de reclutar Dsg2 y DP a estos contactos. Es importante destacar que nunca hemos observado ningún enriquecimiento de los componentes desmosomales en los contactos intercelulares en ausencia de cremalleras AJ (Michels et al., 2009).
Como se describe en la respuesta 3a a continuación, ahora discutimos en la sección de Discusión que aunque Dsg2 y DP muestran cierta co-localización en las cremalleras Ecad-positivas dentro de las 3 horas, también hay una tinción de unión no superpuesta que sugiere que los AJ y los desmosomas ya están empezando a segregarse en uniones intercelulares distintas. No cuantificamos esta co-localización en nuestro manuscrito, ya que el punto principal de nuestros experimentos era mostrar la relevancia de L175 para reclutar Dsg2 a las interfaces intercelulares y facilitar la formación de desmosomas (como se ilustra por el reclutamiento de DP a los contactos intercelulares). Creemos que el retraso en el reclutamiento entre el WT, el mutante L175 y el mutante K14, que se cuantifica en la Figura 5, ilustra este punto.
3) También son necesarias modificaciones en la sección de Introducción y Discusión para abordar los puntos anteriores, así como la accesibilidad del artículo:
a) En relación con los puntos anteriores, el vínculo entre los experimentos de unión in vitro y la función biológica propuesta parece tenue en base a los estudios de localización que revelan patrones de tinción superpuestos pero no verdaderamente co-localizados. Los autores deben explicar este hallazgo; quizás la co-localización es dinámica, y/o sólo un subconjunto de moléculas de E-cadherina se une a Dsg2. Este punto al menos necesita ser discutido para racionalizar los resultados de los experimentos de localización con el modelo propuesto.
Debido a la naturaleza transitoria de las interacciones Ecad/Dsg2, se espera que las proteínas desmosomales reclutadas en las uniones se separen rápidamente de Ecad. En consecuencia, se espera que las imágenes de las interfaces intercelulares presenten patrones de tinción de Ecad y de las proteínas desmosomales tanto superpuestos como separados. En concordancia, aunque Dsg2 y DP muestran cierta co-localización en las cremalleras positivas a Ecad (Figura 5), se observa una significativa tinción de unión no solapada, incluso dentro de las primeras 3 horas. Esto sugiere que los AJ y los desmosomas se segregan rápidamente en uniones intercelulares distintas. Ahora declaramos esto en la sección de Discusión.
b) En el comienzo de la sección de Discusión los autores afirman que ellos: «identifican dos eventos críticos que inician y promueven el ensamblaje eficiente del desmosoma: (i) la homodimerización trans estable de Ecad, y (ii) la unión heterofílica directa de los ectodominios Ecad y Dsg2. Nuestros datos demuestran que el ensamblaje del desmosoma se inicia en los sitios de homodimerización trans de Ecad. Posteriormente, Ecad y Dsg2 se unen a través de un Leu 175 conservado en la interfaz de unión cis de Ecad y forman complejos heterófilos de corta duración que se localizan en los desmosomas tempranos y reclutan eficazmente a las proteínas desmosómicas a los sitios de formación de contactos intercelulares. A medida que los desmosomas maduran, Dsg2 se disocia de Ecad y forma enlaces estables con Dsc2 para mediar la adhesión robusta». – Este párrafo mezcla observaciones, interpretación y modelos hipotéticos y como tal es engañoso. Deberían separar el resumen de los resultados de la interpretación y su modelo.
Como sugieren los revisores, hemos eliminado las interpretaciones del primer párrafo de la sección de Discusión y ahora sólo resumimos los resultados.
c) Los autores escriben en el Resumen y la Introducción «Ecad interactúa con Dsg2 a través de un Leu 175 conservado en la interfaz de unión cis de Ecad.» – Los autores no deberían suponer que los lectores están familiarizados con las interacciones homófilas de E-cad y deberían explicar esto explícitamente.
En el Resumen, ahora se indica que «Estudios anteriores demuestran que la E-cadherina (Ecad), una proteína adhesiva que interactúa tanto en conformaciones trans como cis, facilita el ensamblaje del desmosoma a través de un mecanismo desconocido».
Además, en la Introducción, ahora se indica: «Dado que Ecad interactúa lateralmente para formar dímeros cis en la misma superficie celular (Harrison et al., 2011) mientras que las moléculas de Ecad de células opuestas interactúan en una conformación de dímero de intercambio de cadenas trans (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2007; Vendome et al., 2011) y una conformación de dímero X trans (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), utilizamos mutantes que suprimen específicamente las interacciones trans o cis de Ecad y probamos su unión a Dsg2 o Dsc2′. Por último, en la introducción, ahora afirmamos que «Estudios estructurales anteriores han demostrado que L175 media la dimerización homofílica de Ecad cis (Harrison et al., 2011)».
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013