E-kadheriini sitoutuu desmogleiniin helpottaakseen desmosomien kokoamista
1) Tässä artikkelissa käsitellään desmosomien kokoamisen kadheriinivälitteisen säätelyn mekanismia. Vaikka arvioijat ovat samaa mieltä siitä, että työ on potentiaalisesti jännittävä, he nostivat esiin useita merkittäviä kysymyksiä. Ensinnäkin kaikki ovat yhtä mieltä siitä, että malli on testattava tutkimalla yhteislokalisaatiota kadheriinimutaatiota ilmentävissä soluissa.
Kiitämme arvioijia näiden tärkeiden kokeiden ehdottamisesta. Kuten kuvattu yksityiskohtaisessa vastauksessamme arvioijille, olemme nyt testanneet eri Ecad-mutaatioiden roolia Dsg2:n rekrytoinnin estämisessä keratinosyyteissä. Ekspressoimme täyspitkän Ecad WT:n ja Ecad-mutantit (L175D, K14E ja W2A-K14E) Ecad-knockout-, Pcad-knockdown-hiirten keratinosyyteissä (EKO/PKD) ja analysoimme Dsg2:n rekrytoitumista solujen välisten kontaktien kohtiin. Nämä tulokset vahvistavat, että Ecadin aminohappo L175 välittää Dsg2-vuorovaikutuksia ja helpottaa varhaisen desmosomikompleksin muodostumista soluissa. Kokeemme paljastavat myös, että desmosomien kokoaminen käynnistyy Ecadin trans-homodimerisaatiokohdissa.
2) Kuvassa 5 esitettyjen yhteislokalisaatiotietojen luotettavuus herättää myös huolta; tarvitaan tarkempi analyysi osoittamaan, että E-kadheriinin ja desmoplakiinin yhteislokalisaatiota esiintyy paljon enemmän kuin sattumalta voisi olettaa.
Kentällä desmosomit tunnistetaan SIM-kuvissa olevan DP- värjäytymisen koon ja ratapölkkyjen ulkonäön perusteella. Kuten vastauksessamme arvioijille esitimme, käytimme tätä vakiintunutta lähestymistapaa desmosomien paikantamiseen. Lisäksi korostamme nyt, että emme mittaa kolokalisaatiota vaan pikemminkin eri kadheriinien (Ecad ja Dsg) rekrytoitumista kalvon alueille, joilla näkyy tämä kuvio.
3) Toiseksi mallinnuksessa oletetaan, että L175 muodostaa osan rajapinnasta, mutta ilman stoikiometrian arviointia ei voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että sitoutumisen häviäminen on epäsuora seuraus cis-dimerisaation häviämisestä. Mallinnusta pidetään myös heikkona, koska Dsg2:n komplementaarisia rajapintoja ei testattu. Ilman tällaisia tietoja molekyylimallinnusta on pidettävä erittäin spekulatiivisena.
Kuten on kuvattu yksityiskohtaisessa vastauksessamme arvioijille, aiemmat laskennalliset simulaatiot ja biofysikaaliset kokeet osoittavat, että Ecadin cis-dimeerin muodostuminen edellyttää edeltävää trans-dimerisaatiota. Näin ollen Ecadit eivät voi sitoutua pintaan itsenäisinä, ennalta muodostettuina cis-dimeereinä. Tämän vuoksi on erittäin epätodennäköistä, että mitatut sitoutumisvuorovaikutukset tapahtuisivat Ecadin cis-dimeerien ja Dsg2:n välillä. Olemme kuitenkin samaa mieltä arvostelijoiden kanssa siitä, että molekyylidockaustulokset ovat melko heikkoja. Siksi olemme poistaneet nämä mallinnustulokset käsikirjoituksesta.
4) Lopuksi, kuten arvostelija 3 huomautti, vaikka nämä lisäykset tukisivat, malli ja Discussion-osa eivät oikeastaan selitä, miten E-kadheriini säätelee desmosomeja.
Uusien solurakenne-toimintatietojemme perusteella ehdotamme nyt mallia, jossa desmosomien kokoamista helpottavat sekä Ecadin ja Dsg2:n suorat cis-vuorovaikutukset että vastakkaisen Ecadin trans-sitoutuminen. Mallissamme vastakkaisten solujen Ecadin trans-homodimerisaatio toimii spatiaalisena vihjeenä desmosomien kokoamisen koordinoinnissa. Tämän jälkeen Ecad muodostaa cis-dimeerikomplekseja Dsg2:n kanssa desmosomin kokoamisen aloittamiseksi. Malli esitellään ja sitä käsitellään uudessa käsikirjoituksessa.
Reviewer #1:
1) Yksimolekyyliset AFM-kokeet ovat paperin vankin osa. Lukemani perusteella kirjoittajat eivät kuitenkaan sulje pois sitä mahdollisuutta, että heidän havaitsemansa sitoutumistapahtumat voivat johtua valmiiksi muodostuneiden E-kadheriinin cis-dimeerien välisistä vuorovaikutuksista. Vuorovaikutuksen stoikiometria on tärkeää selvittää, sillä jos sitoutuminen Dsg2:een edellyttäisi E-kadheriinin cis-dimeeriä, se muuttaisi sen tuloksen tulkintaa, että L175D-mutaatio estää Dsg2/E-cadin vuorovaikutuksen. Tällainen skenaario kyseenalaistaisi myös telakointisimulaatioiden pätevyyden. Lukemani mukaan sitoutumisen alhainen todennäköisyys AFM-kärjen ja pinnan välistä kosketusta kohti on heikko todiste siitä, että sitoutuminen heijastaa välttämättä kahden monomeerin vuorovaikutusta, eikä myöskään kadheriinimolekyylien alhainen keskimääräinen tiheys pinnalla. Lisäksi kadheriinit on immobilisoitu streptavidiinillä, jolla on useita biotiinin sitoutumiskohtia.
Näistä syistä pidän tärkeänä sen osoittamista, että monomeerien välillä tapahtuu heterodimerisaatiota. Tätä varten suosittelisin mittaamaan systemaattisesti kärjen ja pinnan vuorovaikutustodennäköisyyttä peitinliinan pinnalla olevan E-kadheriinin pinta-alatiheyden funktiona. Jos vuorovaikutus todellakin edellyttää monomeerista E-kadheriinia, tämän mittauksen pitäisi skaalautua lineaarisesti lisätyn E-kadheriinin kanssa, ainakin alhaisilla tiheyksillä. Tätä nimenomaista mittausta ei kuitenkaan tarvita – mikä tahansa mittaus, jolla määritetään stoikiometria, riittää.
Edelliset tietokonesimulaatiot (Wu ym., 2010; Wu ym., 2011) ovat osoittaneet, että Ecadin cis-homodimeeristyminen edellyttää edeltävää Ecadin trans-dimeerin muodostumista. Vastaavasti aiemmat yhden molekyylin FRET-mittaukset ovat osoittaneet, että ei ole mahdollista muodostaa itsenäisiä Ecadin cis-dimeerejä edes silloin, kun Ecad-monomeerit on sijoitettu lähelle toisiaan cis-suuntaisesti (Zhang et al., 2009). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kokeissamme Ecadeja ei voida immobilisoida AFM-kärkeen tai substraattiin valmiiksi muodostuneina cis-dimeereinä. Näin ollen Ecad-L175D-mutantin epäonnistuminen vuorovaikutuksessa Dsg2:n kanssa ei johdu Ecadin cis-dimerisaation puuttumisesta. Käsittelemme tätä nyt käsikirjoituksen alaluvussa ”Leu 175 välittää Ecadin ja Dsg2:n vuorovaikutuksia”.
Tekniset rajoitukset eivät valitettavasti mahdollista arvostelijan ehdottamaa proteiinien stoikiometriakokeilua. Kokeissamme käytämme proteiinien pintatiheyksiä, joiden avulla pystymme yksiselitteisesti tunnistamaan yksittäiset sitoutumistapahtumat vastaavista PEG-ketjujen venytyksistä. Jos kadheriinien pintatiheyttä kasvatetaan, kuten arvostelija ehdottaa, samanaikaisten useiden Ecad-sitoutumistapahtumien todennäköisyys kasvaa, mikä tekee proteiinien sitoutumistodennäköisyyden kvantitatiivisen analyysin epäluotettavaksi. Tästä syystä (yhdessä telakointianalyysimme luontaisen heikkouden kanssa) olemme jättäneet proteiinien telakointisimulaatiot pois käsikirjoituksesta.
Viimeiseksi, tarkistetussa käsikirjoituksessa käytämme nyt klusterianalyysiä ryhmitellessämme yksittäisten molekyylien sitoutumisen purkautumistapahtumia dynaamista voimaspektroskopiaa (DFS) varten. Olemme äskettäin osoittaneet, että käyttämämme K-means-klusterointialgoritmi parantaa huomattavasti kineettisten parametrien estimointia DFS:ssä (Yen ja Sivasankar, 2018). Näin ollen elinajat, jotka nyt raportoimme Ecad/Dsg2-, Dsc2/Dsg2- ja Dsc2/Dsc2-vuorovaikutuksille, ovat luotettavampia.
2) Telakoitumissimulaatiot ovat mielenkiintoisia, mutta tarjoavat mielestäni heikkoja todisteita kirjoittajien ehdottamasta erityisestä sitoutumisgeometriasta. Suosittelen painokkaasti, että kirjoittajat olisivat varovaisempia näiden tulosten tulkinnassa ja esittämisessä tai vaihtoehtoisesti esittäisivät lisätietoja, esimerkiksi EM-kuvia, jotka tukevat tai kumoavat laskennallisen tuloksen.
Olemme arvostelijan kanssa samaa mieltä siitä, että proteiinien telakointitiedot ovat heikkoja. Siksi olemme poistaneet nämä tulokset käsikirjoituksesta.
3) Valitettavasti SIM-kuvat eivät ole vakuuttavia nykyisessä muodossaan. Erityisesti ei ole selvää, mikä lasketaan ”desmosomiksi” kirjoittajien analyysissä (kuva 5B). Tarvittaisiin hienostuneempi kolokalisaatiokäsittely sen toteamiseksi, että E-kadheriini ja desmoplakiini kolokalisoituvat ja että tämä kolokalisaatio vähenee liitosten kypsyessä.
Aiemmissa tutkimuksissa (Stahley ym., 2016a, 2016b) olemme hyödyntäneet superresoluutiokuvantamisella havaittua DP:n ”ratapölkkyraiteiden” ulkoasua määritellessämme desmosomeja immunofluoresenssilla (kuten kuvassa 3A on esitetty). Myös muut alan tutkijat ovat käyttäneet ”junaradan” morfologiaa desmosomien tunnistamiseen SIM-kuvissa (ks. esim: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). Näiden rakenteiden koko ja organisoituminen, sellaisena kuin SIM-kuva paljastaa ne, vastaa täysin klassisia EM-määritelmiä desmosomeista. Mittasimme näiden rakenteiden sisällä olevien kahden kadheriinin (Ecad tai Dsg2) pikselin intensiteetin tavanomaisen kuva-analyysin avulla. On tärkeää, ettemme yritä väittää yhteislokalisaatiota. Pikemminkin mittaamme kadheriinien rekrytoitumista kalvodomeeneihin, joissa näkyy DP-rautatien värjäytymismalleja. Ymmärrämme kyllä, että joskus on vaikea havaita raideliikenteen raitoja varhaisissa aikapisteissä. Tästä syystä varhaisin ajankohta, jolloin mielestämme pystyimme tunnistamaan bona fine rail road track -värjäytymisen, oli 1 tunti. Lisäksi teemme mittauksia vain sellaisissa paikoissa, joissa voimme havaita ratakiskokuvioita, emme DP-punktioita. Lopuksi toteamuksemme Ecadin esiintymisestä syntymässä olevissa desmosomeissa on yhdenmukainen klassisten immuno-EM-kokeiden kanssa, jotka osoittavat, että Ecad voi lokalisoitua desmosomeihin (Jones, 1988). Siksi olemme varmoja kyvystämme tunnistaa desmosomeja ja mitata näiden kahden kadheriinin suhteellisia pitoisuuksia eri aikoina.
4) Jätän tämän viimeisen kohdan toimittajan harkintaan. Mielestäni kolokalisaatiotiedot, vaikka niitä pidettäisiinkin totena, eivät todista toiminnallista merkitystä. Olisi erittäin mukavaa nähdä knockdown/rekonstituutiokoe L175D E-kadheriinilla. Ennuste on, että tämä molekyyli ei koskaan kolokaloituisi desmoplakiinin kanssa, riippumatta liitoskohdan iästä. Tämän ennusteen rikkominen asettaisi kirjoittajien suosiman mallin kyseenalaiseksi.
Arvostelijan ehdotuksen perusteella olemme nyt suorittaneet kokeita testataksemme suoraan Ecadin eri solunulkoisen domeenin mutaatioiden roolia DP:n ja Dsg2:n rekrytoinnin estämisessä keratinosyyteissä. Nämä tiedot on kuvattu alaluvussa ”Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly”. Vastaavat kuvat on esitetty kuvassa 5 ja kuvassa 5-figure supplement 1. Käytetyt menetelmät kuvataan alaluvussa ”Isolation, culture, transfection and confocal imaging of primary keratinocytes”. Näissä kokeissa käytimme EKO/PKD-hiirten keratinosyyttejä, jotka eivät käytännössä ilmentäneet klassisia kadheriineja. Olemme aiemmin osoittaneet, että nämä EKO/PKD-keratinosyytit eivät pysty kokoamaan AJ- ja desmosomeja, koska kaikki klassiset kadheriinit ovat kadonneet (Michels et al., 2009). Näiden solujen avulla voimme siis suoraan arvioida Ecad-mutanttien kykyä i) aloittaa AJ:n muodostuminen ja ii) arvioida niiden kykyä rekrytoida desmosomaalisia komponentteja solun ja solun välisen kontaktin muodostumisen alkukohtiin.
Koska olimme kiinnostuneita arvioimaan Ecad-mutanttien kykyä rekrytoida desmosomaalisia proteiineja varhaisessa vaiheessa liitoskohdan muodostumisen aikana, ekspressoimme joko täyspitkän Ecad WT:n tai mutantteja EKO/PKD-keratinosyyteissä ja analysoimme DP:n ja Dsg2:n rekrytoitumista solujen välisten kontaktien paikoille konfokaalimikroskopialla. Tutkiaksemme rekrytoitumista liitoskohdan muodostumisen ja kypsymisen eri vaiheissa keratinosyytit fiksoitiin ja immunovärjättiin DP:n, Dsg:n ja Ecadin osalta kolmessa Ca2+-kytkennän jälkeisessä ajankohdassa (3 tuntia, 6 tuntia ja 18 tuntia).
Tietomme osoittivat, että 3 tuntia Ca2+-kytkennän jälkeen WT-Ecadin määrästä 93 % rikastui vetoketjumaisiin varhaisten AJ:n kaltaisiin varhaisiin AJ:iin solujen välisten kontaktien paikoissa. Sitä vastoin vain 48 % L175D-Ecad-transfektoiduista keratinosyyteistä muodosti AJ-vetoketjuja, mikä johtui todennäköisesti Ecadin heikentyneestä cis-dimeerien muodostumisesta (Kuva 5 A, B). Näissä Ca2+-kytkennän jälkeisissä varhaisissa aikapisteissä 66 % ja 91 % WT-Ecadin vetoketjukontakteista oli positiivisia Dsg2:lle ja DP:lle (Kuva 5 A, C, D, E). Kun solujen annettiin sitoutua Ca2+-riippuvaiseen solujen väliseen adheesioon 18 tunnin ajan, Ecad-Dsg2:n ja Ecad-DP:n liitospaikannukset kasvoivat 97 %:iin ja 100 %:iin (Kuva 5 A, C, D, E). Sitä vastoin vain 39 prosentissa L175:n aiheuttamista vetoketjukontakteista havaittiin Dsg2:n rekrytoitumista 3 tuntia sen jälkeen, kun oli siirrytty korkeaan Ca2+ -pitoisuuteen, mikä nousi 65 prosenttiin 18 tunnin kohdalla (Kuva 5 A, C), mikä vahvistaa, että Dsg2:n tehokas rekrytoituminen varhaisiin solujenvälisiin kontakteihin edellyttää Ecadin ja Dsg2:n välistä suoraa vuorovaikutusta. Vastaavasti 3 tunnin kuluttua vain 28 % L175D-Ecad-mutaation vakiintuneista solujenvälisistä kontakteista oli DP-positiivisia, mikä kasvoi 72 %:iin 18 tunnin kuluttua, mikä viittaa kompensoivaan mekanismiin myöhemmissä vaiheissa (Kuva 5 D, E).
Vahvistaaksemme, että L175D-mutaation havaittu vaikutus ei johtunut AJ:n muodostumisen estymisestä, transfektoimme EKO/PKD-keratinosyytit täyspitkällä Ecad-K14E-mutantilla, joka poistaa X-dimeerin muodostumisen ja vangitsee Ecadin säikeenvaihtodimeerikonformaatioon. Tietomme osoittivat, että vain 4 % transfektoiduista kontaktisoluista muodosti vetoketjuja varhaisissa (3 tuntia) aikapisteissä sen jälkeen, kun oli siirrytty korkeaan Ca2+ -pitoisuuteen, ja vain 24 % transfektoiduista kontaktisoluista osoitti vetoketjuja myöhäisissä (18 tuntia) aikapisteissä (Kuva 5 A, B, Kuva 5-lukulisäke 1), mikä vahvistaa sen, että K14 on olennaisen tärkeä AJ:n tehokkaalle muodostumiselle ja näin ollen myös solujen välisten kontaktien muodostumiselle. Kuitenkin ne harvat K14E:n AJ:t, jotka muodostuivat, rekrytoivat Dsg2:ta ja erityisesti DP:tä tehokkaammin kuin L175D:tä (Kuva 5 A, C, E, Kuva 5-kuvioiden täydennys 1). Tämä tulos vahvisti, että Dsg2:n viivästynyt rekrytointi solujen välisiin kontakteihin ei johtunut Ecad L175D:n kyvyttömyydestä muodostaa tehokkaasti AJ:itä, vaan pikemminkin Ecadin ja Dsg2:n välisen suoran vuorovaikutuksen puuttumisesta. Koska DP:n ja Ecadin yhteislokalisaatiota ei koskaan esiintynyt vetoketjujen puuttuessa (kuva 5-luku täydennys 1), tiedot viittaavat myös siihen, että Ecadin trans-vuorovaikutukset edeltävät Ecad/Dsg2-vuorovaikutuksia. Tätä johtopäätöstä vahvistaa entisestään havaintomme, että DP:n rekrytointia ei havaittu, kun Ecadin trans-adheesio ja siten vetoketjut poistettiin transfektoimalla täyspitkä Ecad-DM (W2A-K14E-kaksoismutantti, kuva 5-kuvan täydennys 1) EKO/PKD-keratinosyyteihin. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset vahvistavat, että aminohappo L175 välittää Dsg2-vuorovaikutuksia ja helpottaa varhaista desmosomikompleksin muodostumista soluissa.
Reviewer #2:
1) Havainto, jonka mukaan E-kadheriinin jäännös L175 on kriittinen vuorovaikutukselle Dsg2:n kanssa, on kiehtova. Vuorovaikutuskumppanijäämiä ei kuitenkaan ole tunnistettu. Tässä tilanteessa E-kadheriini/Dsg2-vuorovaikutuksen konformaation ennustaminen dokaamalla vaikuttaa epävarmalta; vaikuttaa epävarmalta, että ennustettu konformaatio liittyy todelliseen sidottuun konformaatioon.
Olemme samaa mieltä arvostelijan kanssa siitä, että proteiinien telakointitiedot ovat spekulatiivisia, ja olemme siksi poistaneet nämä tulokset käsikirjoituksesta.
2) Ehdotettu Dsg2/E-kadheriini-vuorovaikutus kytkeytyy vain heikosti desmosomin kokoamisen biologiaan. Silti kirjoittajilla näyttää olevan selkeä tie eteenpäin. He väittävät, että E-kadheriinin läsnäolo syntymässä olevissa desmosomeissa (kokeellisesti arvioituna desmoplakiinille tehtävällä rinnakkaisvärjäyksellä kuvassa 5) on todiste tunnistamansa Dsg2/E-kadheriini-assosiaation roolista. Nyt kun he ovat tunnistaneet mutantin, joka estää kyseisen assosiaation, mutantilla suoritettujen kuvan 5 kokeiden pitäisi johtaa erilaisiin tuloksiin. Tämä koe lisäisi huomattavasti tämän artikkelin tarkkuutta.
Kuten on kuvattu vastauksessa 4 arvostelijalle 1, ekspressoimme täyspitkiä Ecad WT:tä ja Ecad-mutantteja EKO/PKD-keratinosyyteissä ja analysoimme Dsg2:n ja DP:n rekrytoitumista solujen välisten kontaktien kohtiin. Nämä tulokset vahvistavat, että aminohappo L175 välittää Dsg2-vuorovaikutuksia ja helpottaa varhaisen desmosomikompleksin muodostumista soluissa. Nämä tiedot kuvataan käsikirjoituksen alaluvussa ”Ecad L175 on välttämätön tehokkaalle solujen väliselle Dsg2-rekrytoinnille ja desmosomien kokoamiselle”. Vastaavat kuvat on esitetty kuvassa 5 ja kuvassa 5-figure supplement 1. Käytetyt menetelmät on kuvattu alaluvussa ”Isolation, culture, transfection and confocal imaging of primary keratinocytes”.
Reviewer #3:
1) Tässä käsikirjoituksessa identifioidaan ja karakterisoidaan molekulaarinen vuorovaikutus E-kadheriinin ja Desmoglein 2:n välillä käyttäen eristettyjä proteiineja ja osoitetaan, että näiden kahden molekyylin välillä on lisääntynyttä kolokalisaatioita keratinosyyteissä varhaisvaiheessa desmosomin kokoamisen aikana. Nämä ovat mahdollisesti erittäin mielenkiintoisia havaintoja, jotka voivat selittää, miten klassiset kaderiinit ohjaavat desmosomien kokoamista. Vaikka tämä on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu useiden ryhmien toimesta, taustalla olevat mekanismit ovat edelleen enimmäkseen tuntemattomia. Heidän Discussion-osion alussa esittämänsä johtopäätös ”Our integrated single molecule experiments, protein-protein docking predictions and cell based super resolution imaging show that Ecad/Dsg2 interactions play an important role in early desmosome assembly” (Integroidut yksimolekyylikokeemme, proteiini-proteiini-docking-ennusteet ja solupohjainen super resolution imaging osoittavat, että Ecad/Dsg2-vuorovaikutuksilla on tärkeä rooli varhaisessa desmosomikokoonpanossa) on kuitenkin melko vahvaa liioittelua, kun otetaan huomioon, että vuorovaikutus perustuu karakterisointiin eristetyillä ekstrasellulaarisilla domeeneilla ja staattiseen, vaikkakin korkearesoluutioiseen mikroskopiaan. Mitään koetta ei ole tehty sen osoittamiseksi, että kun tätä vuorovaikutusta häiritään, desmosomien kokoaminen todellakin häiriintyy, mikä mielestäni olisi minimi, joka tekisi näistä tiedoista todella mielenkiintoisia ja merkityksellisiä laajalle yleisölle.
Kuten on kuvattu vastauksessa 4 arvostelijalle 1, olemme nyt ekspressoineet täyspitkän Ecad WT:n ja Ecad-mutantit EKO/PKD-keratinosyyteissä ja osoittaneet, että aminohappo L175 välittää Dsg2-vuorovaikutusta ja helpottaa varhaista desmosomien muodostumista soluihin DP:n rekrytoinnilla arvioituna. Nämä tiedot on kuvattu käsikirjoituksen alaluvussa ”Ecad L175 on välttämätön tehokkaalle solujen väliselle Dsg2-rekrytoinnille ja desmosomien kokoamiselle”. Vastaavat kuvat on esitetty kuvassa 5 ja kuvassa 5-figure supplement 1. Käytetyt menetelmät on kuvattu alaluvussa ”Isolation, culture, transfection and confocal imaging of primary keratinocytes”.
2) Myös sen tosiasian valossa, että vuorovaikutus on kalsiumista riippumaton, kun taas klassinen kadheriinista riippuvainen varhainen desmosomien kokoaminen edellyttää kalsiumin läsnäoloa (jota ei käsitellä lainkaan).
Kiitämme arvioijaa tästä oivaltavasta kommentista. Kuten alaluvussa ”Ecad L175 on välttämätön tehokkaalle solujen väliselle Dsg2-rekrytoinnille ja desmosomien kokoamiselle” on kuvattu, hiiren keratinosyyteissä ekspressoidun mutanttisen Ecadin konfokaalikuvantaminen paljastaa nyt, että desmosomien kokoaminen käynnistyy Ca2+-riippuvaisen Ecadin trans-homodimerisaation kohdissa. Tietojemme perusteella ehdotamme mallia, jossa desmosomien kokoamista helpottavat sekä Ecadin ja Dsg2:n suorat cis-vuorovaikutukset että vastakkaisen Ecadin trans-sitoutuminen. Mallissamme vastakkaisten solujen Ecadin trans-homodimerisaatio toimii spatiaalisena vihjeenä desmosomien kokoamisen koordinoinnissa. Tämän jälkeen Ecad muodostaa cis-dimeerikomplekseja Dsg2:n kanssa. Kun Dsg2 on lokalisoitunut natiiviin desmosomiin, se dissosioituu Ecadista ja sitoutuu Dsc2:een muodostaen kypsiä desmosomeja. Koska Dsc2/Dsg2-kompleksilla on pidempi elinikä kuin sekä Ecad/Dsg2-kompleksilla että Dsc2/Dsc2-kompleksilla, tämä mahdollistaa todennäköisesti solun ja solun välisen vahvan adheesion ja mahdollistaa sen, että kypsä desmosomi kestää mekaanista voimaa. Tämä malli on kuvattu kuvassa 6 ja kohdassa Keskustelu.
3) Koska kyseessä on täysin uusi vuorovaikutus, jolla on alhainen affiniteetti, on luultavasti vaikea tehdä vuorovaikutusmäärityksiä sellaisten solujen yhteydessä, joissa toinen solu ilmentää E-kadheriinia ja toinen Dsg2:ta, jotta voitaisiin tutkia, onko vuorovaikutusta. Koska heidän tietonsa perustuvat kuitenkin osittain mallinnukseen, kirjoittajien pitäisi myös tuottaa mutantti, jossa A125 ja A124 ovat mutatoituneet, jotta he saisivat paljon parempaa näyttöä ehdotettujen y-dimeerien olemassaolosta.
Koska proteiinien telakointitulokset eivät ole vankkoja, olemme nyt poistaneet nämä tiedot käsikirjoituksesta. EKO/PKD-keratinosyyteillä tekemämme kokeet, jotka osoittavat, että Ecadin aminohapon L175 mutaatio heikentää Dgs2:n ja erityisesti DP:n rekrytoitumista varhaisten kontaktien muodostumispaikkoihin, osoittavat kuitenkin, että Ecad-L175 helpottaa desmosomien muodostumista soluissa, vahvistavat biofysikaaliset tuloksemme.
Yhteenveto:
Katsauksen laatijat katsovat, että vaikka biofysikaaliset aineistot ovatkin vakuuttavia, tarvitaan tiukempi kvantitatiivinen analyysi tukemaan kuvien 3 ja 5 aineistosta esitettävien johtopäätösten tukemista. Periaatteessa nämä huolenaiheet voidaan ratkaista kokeiden sijasta täydentävällä data-analyysillä, ja tässä tapauksessa harkitsisimme tarkistettua käsikirjoitusta.
Kiitämme toimittajaa tästä rohkaisevasta arvostelusta. Kuten alla on kuvattu, tarkistetussa käsikirjoituksessamme käsitellään kaikkia korostettuja asioita.
1) Johtopäätös, jonka mukaan E-kadheriini-Dsg-vuorovaikutus on välttämätön desmosomin alkuvaiheen muodostumiselle, perustuu siihen, että Dsg:n ja E-kadheriinin kolokalisaatio vähenee liitoskohdan kypsyessä. Kuvasta 3 ei kuitenkaan selviä, onko havaittu kolokalisaatio DP:n kanssa merkittävämpi kuin mitä sattumalta odotetaan, vai johtuuko se ajasta riippuvista muutoksista E-kadheriinin solunalaisessa lokalisaatiossa, jotka eivät liity liitoksen kypsymiseen. Kuvassa 3C oikeassa paneelissa esitetyt kontrollikokeet korostavat Dsg2:n ja DP:n – tunnettujen desmosomin komponenttien – yhteislokalisaatiota ja osoittavat fluoresenssisignaalien läheistä vastaavuutta kaikissa kolmessa aikapisteessä. Sitä vastoin, vaikka vasemmanpuoleisissa paneeleissa E-kadheriinin ja DP:n ilmentyminen näyttää olevan jossain määrin päällekkäistä, niissä ei näy samanlaista vastaavuutta signaaleissa kuin kontrollikokeissa. Alkuperäisen katsauksen tätä aihetta koskeviin kohtiin annetussa vastauksessa (esim. arvostelija 1, kohta 3) keskitytään desmosomin määrittelyyn, mutta siinä ei käsitellä edellä mainittua kohtaa.
Haluaisimme selventää, että emme mittaa rinnakkaislokalisaatiota vaan sen sijaan joko Ecadin tai Dsg2:n rekrytoitumista sellaisiin membraanin alueisiin, joissa näkyy DP:n ”ratakuvio”. Tämän selventämiseksi olemme nyt muuttaneet tarkistettua käsikirjoitusta korostaaksemme, että Ecad on ”rikastunut syntymässä oleviin desmosomeihin” sen sijaan, että se olisi ”suljettu pois kypsistä desmosomeista”.
Käsitelläkseni suoraan arvostelijoiden huolenaiheita, jotka koskevat mittaustuloksiamme Ecadin rikastumisesta desmosomeihin, osoitamme nyt, että Ecadin suhteelliset tasot pitkin koko solurajoja (Ecadin ja DP:n välinen suhde solurajoilla) pysyvät muuttumattomina ajan myötä. Nämä tiedot vahvistavat, että Ecad-rikastuminen DP-raiteiden sisällä varhaisissa aikapisteissä on spesifistä kalvon desmosomaalisille alueille ja se on merkittävää enemmän kuin satunnainen sattuma tai E-kadheriinin lokalisaatiossa tapahtuvat muutokset, jotka eivät liity liitoskohdan kypsymiseen, odottaisivat. Tiedot on esitetty kuvassa 3-figure supplement 1 ja kuvattu alaluvussa ”Ecad is present in nascent desmosomes but not in mature desmosomes.”
Loppujen lopuksi, koska kuvassa 3 esitetyt viivakuvaukset olivat hämmentäviä, olemme poistaneet viivakuvaukset tarkistetusta käsikirjoituksesta. Sen sijaan kuvassa 3B näytämme nyt useita edustavia kuvia desmosomien alueista ihmisen keratinosyyteissä, joita on viljelty korkeassa Ca2+ -mediassa 1, 3 tai 18 tuntia. Nämä tulokset korostavat kuvan 3C tärkeintä viestiä: Ecad-tasot rikastuvat syntymässä olevissa desmosomeissa, ja suhteelliset tasot laskevat desmosomien kypsyessä.
2) Samanlaisia huolenaiheita esitettiin kuvasta 5, jonka on tarkoitus osoittaa, että Ecad L175 on välttämätön tehokkaalle solujen väliselle Dsg2:n rekrytoinnille ja desmosomien kokoamiselle. Paneelin A kuvissa näkyy todellakin dramaattinen ero Dsg2:n ja DP:n lokalisaatiossa suhteessa WT- tai mutantti-kadheriiniin. Vaikka Dsg2 ja DP lokalisoituvat yhdessä WT- tai K14E-Ecadin kanssa liitoskohdissa, ne pysyvät erillisinä punktoina, jotka reunustavat L175D-Ecadin liitoskohtaa, eivätkä lokalisoidu sen kanssa. Ei kuitenkaan ole selvää, mitä kirjoittajat kvantifioivat tämän fenotyypin merkityksen testaamiseksi. B-kohdassa, mikä on ”% risteyskohdista, jotka muodostavat kontakteja”? Miten kontakti määritellään? Mitä yhteyksiä he mittaavat? AJ:n vai desmosomien? Mitä he tarkoittavat kohdissa C ja E sanoilla % Dsg2- tai DP-positiivisista liitoskohdista? Miten liitokset määriteltiin?
Olemme nyt lisänneet kuvapaneelin (Figure 5-figure supplement 1A) havainnollistamaan analyysissämme käytettyjä määritysperusteita ja liitoskategorioita. Tässä paneelissa on esimerkkejä Ecad-mutantilla transfektoiduista soluista, joissa ei esiinny (vasen paneeli) tai esiintyy (oikea paneeli) solujen välistä AJ:n muodostumista. Dsg2:n tai DP:n rekrytoinnin osalta kvantifioimme vain ne solujenväliset rajapinnat, joissa havaittiin AJ-vetoketjuja. Kuvapaneelin insertissä näytämme esimerkkejä AJ-positiivisista kontakteista, jotka ovat joko DP-positiivisia tai DP-negatiivisia.
Käsikirjoituksen alaluvussa ”Ecad L175 on välttämätön tehokkaalle solujenväliselle Dsg2-rekrytoinnille ja desmosomien kokoamiselle” ilmoitamme nyt, että transfektoitujen keratinosyyttien kykyä muodostaa AJ:itä arvioitiin aluksi muodostamalla Ecadin ”vetoketjumaisia” kuvioita solujenvälisissä kontakteissa. Olemme aiemmin osoittaneet, että nämä vetoketjut edustavat varhaisia AJ:itä ja rekrytoivat AJ:n merkkiproteiineja, kuten vinculinia (Rübsam ym., 2017). Tutkimme vain solujenvälisiä rajapintoja, joissa on AJ-vetoketjuja, niiden kyvyn rekrytoida Dsg2 ja DP näihin kontakteihin. On tärkeää, ettemme ole koskaan havainneet desmosomaalisten komponenttien rikastumista solujenvälisissä kontakteissa ilman AJ-vetoketjuja (Michels et al., 2009).
Kuten jäljempänä vastauksessa 3a on kuvattu, keskustelemme nyt Keskustelu-osiossa siitä, että vaikka Dsg2:lla ja DP:llä on jonkin verran yhteislokalisoitumista Ecad-positiivisissa vetoketjuissa 3 tunnin kuluessa, on myös päällekkäistä liitoskohdan värjäytymää, mikä viittaa siihen, että AJ:t ja desmosomit alkavat jo erottua toisistaan erillisiksi solujenvälisiksi liitoksiksi. Emme kvantifioineet tätä yhteislokalisaatiota käsikirjoituksessamme, koska kokeidemme pääasia oli osoittaa L175:n merkitys Dsg2:n rekrytoinnissa solujenvälisiin rajapintoihin ja desmosomien muodostumisen helpottamisessa (kuten DP:n rekrytointi solujenvälisiin kontakteihin osoittaa). Uskomme, että rekrytoinnin viive WT:n, L175-mutaation ja K14-mutaation välillä, joka on kvantifioitu kuvassa 5, havainnollistaa tätä seikkaa.
3) Johdanto ja keskustelu -osioon tarvitaan myös muutoksia, jotta voidaan käsitellä edellä mainittuja kohtia sekä paperin saavutettavuutta:
a) Liittyen edellä mainittuihin kohtiin, in vitro -sidontakokeiden ja ehdotetun biologisen roolin välinen yhteys vaikuttaa hataralta perustuen lokalisointitutkimuksiin, jotka paljastavat päällekkäisiä mutta eivät aidosti yhteenkokoavia värjäytymismalleja. Kirjoittajien on selitettävä tämä havainto; ehkä yhteislokalisaatio on dynaamista ja/tai vain osa E-kadheriinimolekyyleistä on sitoutunut Dsg2:een. Ainakin tästä seikasta on keskusteltava, jotta lokalisaatiokokeiden tulokset voidaan järkeistää ehdotetun mallin kanssa.
Ecad/Dsg2-vuorovaikutusten ohimenevän luonteen vuoksi liittymiin rekrytoitujen desmosomaalisten proteiinien odotetaan erottuvan nopeasti Ecadista. Näin ollen kuvissa solujen välisistä rajapinnoista odotetaan olevan sekä päällekkäisiä että erillisiä Ecad- ja desmosomaaliproteiinien värjäytymiskuvioita. Yhteisymmärryksessä, vaikka Dsg2:lla ja DP:llä on jonkin verran yhteislokalisaatiota Ecad-positiivisissa vetoketjuissa (kuva 5), havaitaan merkittävää ei-ylittyvää liitoskohdan värjäytymistä jopa ensimmäisten 3 tunnin aikana. Tämä viittaa siihen, että AJ:t ja desmosomit erottuvat nopeasti erillisiksi solujenvälisiksi liitoksiksi. Toteamme tämän nyt Discussion-osiossa.
b) Discussion-osan alussa kirjoittajat väittävät, että he: ”tunnistavat kaksi kriittistä tapahtumaa, jotka käynnistävät ja edistävät tehokasta desmosomien kokoamista: (i) Ecadin stabiili trans-homodimerisaatio ja (ii) Ecadin ja Dsg2:n ektodomeenien suora heterofiilinen sitoutuminen. Tietomme osoittavat, että desmosomien kokoaminen käynnistyy Ecadin trans-homodimerisaatiokohdista. Tämän jälkeen Ecad ja Dsg2 sitoutuvat Ecadin cis-sitoutumisrajapinnan konservoidun Leu 175:n kautta ja muodostavat lyhytikäisiä heterofiilisiä komplekseja, jotka lokalisoituvat varhaisiin desmosomeihin ja rekrytoivat tehokkaasti desmosomaalisia proteiineja solujen välisten kontaktien muodostumispaikkoihin. Desmosomien kypsyessä Dsg2 dissosioituu Ecadista ja muodostaa vakaita sidoksia Dsc2:n kanssa välittäen vankkaa adheesiota.” – Tässä kohdassa sekoitetaan havaintoja, tulkintoja ja hypoteettisia malleja, ja se on sellaisenaan harhaanjohtava. Heidän tulisi erottaa tulosten yhteenveto tulkinnasta ja omasta mallistaan.
Kuten arvostelijat ehdottivat, olemme poistaneet tulkinnat Discussion-osion ensimmäisestä kappaleesta ja teemme nyt vain yhteenvedon tuloksista.
c) Kirjoittajat kirjoittavat tiivistelmässä ja johdannossa: ”Ecad on vuorovaikutuksessa Dsg2:n kanssa Ecadin cis-sidosrajapinnan konservoidun Leu 175:n kautta”. – Kirjoittajien ei pitäisi olettaa, että lukijat tuntevat E-cadin homofiiliset vuorovaikutukset, ja heidän pitäisi selittää tämä eksplisiittisesti.”
Astractissa todetaan nyt: ”Aiemmat tutkimukset osoittavat, että E-cadherin (Ecad), adheesioproteiini, joka on vuorovaikutuksessa sekä trans- että cis-konformaatiossa, helpottaa desmosomin kokoamista tuntemattomalla mekanismilla.”
Elisäksi Johdannossa todetaan nyt: ”Koska Ecad vuorovaikuttaa lateraalisesti muodostaen cis-dimeerejä samalla solupinnalla (Harrison et al., 2011), kun taas vastakkaisten solujen Ecad-molekyylit ovat vuorovaikutuksessa trans-juosteenvaihdon dimeerikonformaatiossa (Boggon et al., 2002; Parisini et al.., 2007; Vendome et al., 2011) ja trans-X-dimeerikonformaatiossa (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), käytimme mutantteja, jotka poistavat spesifisesti joko Ecadin trans- tai cis-vuorovaikutukset, ja testasimme niiden sitoutumista joko Dsg2:een tai Dsc2′:een. Lopuksi, johdannossa todetaan nyt, että ”Aiemmat rakennetutkimukset ovat osoittaneet, että L175 välittää homofiilistä Ecadin cis-dimerisaatiota (Harrison et al., 2011).”
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013