La E-cadhérine se lie à la desmogléine pour faciliter l’assemblage du desmosome
1) Cet article traite du mécanisme de régulation de l’assemblage du desmosome médié par la cadhérine. Bien que les examinateurs conviennent que le travail est potentiellement passionnant, ils ont soulevé plusieurs questions importantes. Tout d’abord, tous conviennent que le modèle doit être testé en examinant la co-localisation dans les cellules exprimant le mutant de la cadhérine.
Nous remercions les examinateurs d’avoir suggéré ces expériences importantes. Comme décrit dans notre réponse détaillée aux examinateurs, nous avons maintenant testé le rôle des différentes mutations Ecad dans l’entrave au recrutement de Dsg2 dans les kératinocytes. Nous avons exprimé l’acide aminé complet Ecad WT, et les mutants Ecad (L175D, K14E, et W2A-K14E) dans des kératinocytes de souris Ecad-knockout, Pcad-knockdown (EKO/PKD) et analysé le recrutement de Dsg2 aux sites de contacts intercellulaires. Ces résultats confirment que l’acide aminé L175 sur Ecad, médiateur des interactions Dsg2, facilite la formation précoce du complexe desmosome dans les cellules. Nos expériences révèlent également que l’assemblage du desmosome est initié aux sites d’homodimérisation trans de l’Ecad.
2) Il y a également des préoccupations concernant la fiabilité des données de co-localisation dans la figure 5 ; une analyse plus rigoureuse est nécessaire pour démontrer que la co-localisation de l’E-cadhérine et de la desmoplakine se produit beaucoup plus que ce à quoi on pourrait s’attendre par hasard.
Sur le terrain, les desmosomes sont identifiés par la taille et l’apparence de voie ferrée de la coloration DP dans les images SIM. Comme indiqué dans notre réponse aux examinateurs, nous avons utilisé cette approche établie pour localiser les desmosomes. En outre, nous soulignons maintenant que nous ne mesurons pas la colocalisation, mais plutôt le recrutement de différentes cadhérines (Ecad et Dsg) dans les régions de la membrane qui présentent ce motif.
3) Deuxièmement, la modélisation suppose que L175 fait partie de l’interface, mais sans évaluation de la stœchiométrie, il ne peut être exclu que la perte de liaison soit un effet indirect de la perte de la dimérisation cis. La modélisation est également considérée comme faible car aucune interface complémentaire sur Dsg2 n’a été testée. Sans ces données, la modélisation moléculaire doit être considérée comme hautement spéculative.
Comme décrit dans notre réponse détaillée aux examinateurs, les simulations computationnelles précédentes et les expériences biophysiques montrent que la formation du dimère cis d’Ecad nécessite une dimérisation trans préalable. Par conséquent, les Ecad ne peuvent pas se lier à la surface en tant que cis-dimères autonomes et préformés. Il est donc très peu probable que les interactions de liaison mesurées se produisent entre les cis-dimères Ecad et Dsg2. Néanmoins, nous sommes d’accord avec les évaluateurs que les résultats de l’amarrage moléculaire sont assez faibles. Nous avons donc éliminé ces résultats de modélisation du manuscrit.
4) Enfin, comme l’a noté le réviseur 3, même s’ils sont soutenus par ces ajouts, le modèle et la section Discussion n’expliquent pas vraiment comment l’E-cadhérine régule les desmosomes.
Sur la base de nos nouvelles données de structure-fonction cellulaire, nous proposons maintenant un modèle selon lequel l’assemblage des desmosomes est facilité à la fois par les interactions cis directes de Ecad et Dsg2 et par la liaison trans de Ecad opposée. Dans notre modèle, l’homodimérisation trans d’Ecad provenant de cellules opposées sert de repère spatial pour coordonner l’assemblage du desmosome. Ecad forme ensuite des complexes cis-dimères avec Dsg2 pour initier l’assemblage du desmosome. Le modèle est présenté et discuté dans le nouveau manuscrit.
Reviewer #1:
1) Les expériences AFM à une seule molécule sont la partie la plus solide de l’article. Cependant, à ma lecture, les auteurs n’excluent pas la possibilité que les événements de liaison qu’ils observent soient dus à des interactions entre des cis-dimères d’E-cadhérine préformés. La stœchiométrie de l’interaction est importante à établir, car si la liaison à Dsg2 impliquait un cis-dimère de E-cadhérine, cela changerait l’interprétation du résultat selon lequel la mutation L175D bloque l’interaction Dsg2/E-cad. Un tel scénario remettrait également en cause la validité des simulations de docking. Selon moi, la faible probabilité de liaison par contact de la pointe AFM avec la surface est une faible preuve que la liaison reflète nécessairement l’interaction de deux monomères, tout comme la faible densité moyenne de molécules de cadhérine sur la surface. De plus, les cadhérines sont immobilisées avec de la streptavidine, qui possède de multiples sites de liaison à la biotine.
Pour ces raisons, je pense que prouver que l’hétérodimérisation se produit entre les monomères est important. Pour ce faire, je recommanderais de mesurer systématiquement la probabilité d’interaction de la pointe avec la surface en fonction de la densité surfacique d’E-cadhérine sur la surface du coverslip. Si l’interaction nécessite effectivement de l’E-cadhérine monomère, cette mesure devrait être linéaire en fonction de l’E-cadhérine ajoutée, du moins à faible densité. Cependant, cette mesure spécifique n’est pas nécessaire – toute mesure qui établit la stœchiométrie fera l’affaire.
Des simulations informatiques antérieures (Wu et al., 2010 ; Wu et al., 2011) ont montré que l’homodimérisation cis d’Ecad nécessite la formation préalable de trans-dimères d’Ecad. De même, de précédentes mesures FRET de molécules uniques ont montré qu’il n’est pas possible de former des dimères Ecad cis autonomes, même lorsque les monomères Ecad sont placés à proximité immédiate dans une orientation cis (Zhang et al., 2009). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que dans nos expériences, les Ecad ne peuvent pas être immobilisés sur la pointe AFM ou le substrat en tant que cis-dimères préformés. Par conséquent, l’incapacité du mutant Ecad-L175D à interagir avec Dsg2 n’est pas due à l’absence de dimérisation cis d’Ecad. Nous discutons maintenant de cela dans la sous-section « Leu 175 médiates Ecad et Dsg2 interactions » du manuscrit.
Malheureusement, les limitations techniques ne permettent pas l’expérience de stœchiométrie de la protéine que le réviseur suggère. Dans nos expériences, nous utilisons les densités de surface des protéines qui nous permettent d’identifier sans ambiguïté les événements de liaison uniques à partir de l’étirement correspondant des tethers PEG. Si la densité de surface des cadhérines est augmentée, comme le propose l’auteur de la critique, la probabilité d’événements de liaison multiples et simultanés de l’Ecad augmente, ce qui rend peu fiable une analyse quantitative de la probabilité de liaison des protéines. Pour cette raison (ainsi que la faiblesse intrinsèque de notre analyse d’arrimage), nous avons exclu les simulations d’arrimage de protéines du manuscrit.
Enfin, dans le manuscrit révisé, nous utilisons maintenant l’analyse en grappes pour regrouper les événements de déliaison de molécules uniques pour la spectroscopie de force dynamique (DFS). Nous avons récemment montré que l’algorithme de clustering K-means que nous avons employé, améliore grandement l’estimation des paramètres cinétiques en DFS (Yen et Sivasankar, 2018). Par conséquent, les durées de vie que nous rapportons maintenant pour les interactions Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 et Dsc2/Dsc2 sont plus fiables.
2) Les simulations de docking sont intéressantes, mais à mon avis, elles offrent de faibles preuves pour la géométrie de liaison spécifique que les auteurs proposent. Je recommanderais fortement aux auteurs d’être plus prudents dans l’interprétation et la présentation de ces résultats, ou alternativement de présenter des données supplémentaires, par exemple des images EM, qui soutiennent ou réfutent le résultat de calcul.
Nous sommes d’accord avec l’examinateur que les données de docking des protéines sont faibles. Nous avons donc éliminé ces résultats du manuscrit.
3) Malheureusement, les images SIM ne sont pas convaincantes telles que présentées actuellement. En particulier, il n’est pas clair ce qui compte comme un « desmosome » dans l’analyse des auteurs (figure 5B). Un traitement plus sophistiqué de la colocalisation serait nécessaire pour établir le point que l’E-cadhérine et la desmoplakine se colocalisent, et que cette colocalisation diminue au fur et à mesure que les jonctions mûrissent.
Dans des études précédentes (Stahley et al., 2016a, 2016b), nous avons utilisé l’aspect » rail road track » du DP tel que révélé par l’imagerie à super-résolution pour définir les desmosomes par immunofluorescence (comme indiqué sur la figure 3A). D’autres dans le domaine ont également utilisé la morphologie de la voie ferrée pour identifier les desmosomes dans les images SIM (voir par exemple : Chen et al. (2012) ; Ungewiß et al. (2017)). La taille et l’organisation de ces structures, telles qu’elles sont révélées par la SIM, sont tout à fait cohérentes avec les définitions classiques des desmosomes en EM. Nous avons mesuré l’intensité des pixels pour les deux cadhérines (Ecad ou Dsg2) au sein de ces structures en utilisant une analyse d’image standard. Il est important de noter que nous ne cherchons pas à affirmer la co-localisation. Nous mesurons plutôt le recrutement de la cadhérine dans les domaines membranaires qui présentent des motifs de coloration DP rail road track. Nous sommes conscients qu’il est parfois difficile de discerner les traces de chemin de fer à des moments précoces. Pour cette raison, nous avons estimé que le moment le plus précoce où nous pouvions identifier une bonne coloration de chemin de fer était à 1 heure. En outre, nous n’effectuons des mesures qu’aux endroits où nous pouvons observer des traces de rails, plutôt que des punctas DP. Enfin, notre découverte de la présence d’Ecad dans les desmosomes naissants est cohérente avec les expériences classiques d’immuno-EM montrant que Ecad peut se localiser dans les desmosomes (Jones, 1988). Par conséquent, nous sommes confiants dans notre capacité à identifier les desmosomes et à mesurer les niveaux relatifs des deux cadhérines à différents moments.
4) Je laisse ce dernier point à la discrétion de l’éditeur. À mon avis, les données de colocalisation, même si elles sont considérées comme vraies, n’établissent pas la pertinence fonctionnelle. Il serait très agréable de voir une expérience de knockdown/reconstitution avec l’E-cadhérine L175D. La prédiction est que cette molécule ne se colocaliserait jamais avec la desmoplakine, quel que soit l’âge de la jonction. La violation de cette prédiction mettrait en doute le modèle privilégié par les auteurs.
Sur la base de la suggestion de l’examinateur, nous avons maintenant réalisé des expériences pour tester directement le rôle des différentes mutations du domaine extracellulaire de l’Ecad dans l’entrave au recrutement de DP et de Dsg2 dans les kératinocytes. Ces données sont décrites dans la sous-section « Ecad L175 est essentiel pour le recrutement intercellulaire efficace de Dsg2 et l’assemblage du desmosome ». Les images correspondantes sont présentées dans la figure 5 et dans le supplément 1 de la figure 5-figure. Les méthodes utilisées sont décrites dans la sous-section « Isolation, culture, transfection et imagerie confocale des kératinocytes primaires ». Pour ces expériences, nous avons utilisé des kératinocytes de souris EKO/PKD, qui n’expriment pratiquement pas les cadhérines classiques. Nous avons précédemment montré que ces kératinocytes EKO/PKD sont incapables d’assembler les AJs et les desmosomes en raison de la perte de toutes les cadhérines classiques (Michels et al., 2009). Ces cellules nous permettent donc d’évaluer directement la capacité des mutants Ecad à i) initier la formation d’AJ et ii) évaluer leur capacité à recruter les composants desmosomaux sur les sites de formation initiale du contact cellule-cellule.
Puisque nous étions intéressés par l’évaluation de la capacité des mutants Ecad à recruter des protéines desmosomales tôt au cours de la formation de la jonction, nous avons exprimé soit l’Ecad WT complet, soit les mutants dans les kératinocytes EKO/PKD et analysé le recrutement de DP et de Dsg2 aux sites de contacts intercellulaires en utilisant la microscopie confocale. Pour examiner le recrutement à différents stades de la formation et de la maturation des jonctions, les kératinocytes ont été fixés et immunocolorés pour DP, Dsg et Ecad à trois moments après le commutateur de Ca2+ (3 heures, 6 heures et 18 heures).
Nos données ont montré que 3 heures après le commutateur de Ca2+, 93% de WT-Ecad était enrichi en AJ précoces de type fermeture éclair aux sites de contacts intercellulaires. En revanche, seulement 48 % des kératinocytes transfectés par L175D-Ecad ont formé des fermetures éclair d’AJ, probablement en raison de la formation altérée du cis-dimère Ecad (Figure 5 A, B). À ces moments précoces suivant le transfert de Ca2+, 66 % et 91 % des contacts de la fermeture éclair WT-Ecad étaient positifs pour Dsg2 et DP respectivement (Figure 5 A, C, D, E). Lorsque les cellules ont été autorisées à s’engager dans l’adhésion intercellulaire dépendante du Ca2+ pendant 18 heures, les localisations jonctionnelles de Ecad-Dsg2 et Ecad-DP ont augmenté à 97 % et 100 % respectivement (Figure 5 A, C, D, E). En revanche, seulement 39% des contacts de fermeture éclair induits par L175 ont montré un recrutement de Dsg2 3 heures après le passage à un Ca2+ élevé, ce qui a augmenté à 65% à 18 heures (Figure 5 A, C), confirmant qu’une interaction directe entre Ecad et Dsg2 est nécessaire pour un recrutement efficace de Dsg2 aux premiers contacts intercellulaires. De même, après 3 heures, seulement 28% des contacts intercellulaires établis du mutant L175D-Ecad étaient positifs pour DP, ce qui a été augmenté à 72% après 18 heures, suggérant un mécanisme compensatoire à des étapes ultérieures (Figure 5 D, E).
Pour confirmer que l’effet observé de la mutation L175D n’était pas dû à une entrave à la formation de l’AJ, nous avons transfecté les kératinocytes EKO/PKD avec le mutant Ecad-K14E complet qui abolit la formation de X-dimères et piège Ecad dans une conformation de dimère à échange de brin. Nos données ont montré que seulement 4 % des cellules de contact transfectées ont formé des fermetures à glissière aux points de temps précoces (3 heures) après le passage à un niveau élevé de Ca2+, et que seulement 24 % des cellules de contact transfectées ont montré des fermetures à glissière aux points de temps tardifs (18 heures) (Figure 5 A, B, Figure 5-figure supplément 1), confirmant que K14 est essentiel pour la formation efficace d’AJ, et donc l’établissement du contact intercellulaire. Cependant, les quelques AJ K14E qui ont été formés ont recruté Dsg2, et surtout DP, plus efficacement que L175D (Figure 5 A, C, E, Figure 5-figure supplément 1). Ce résultat a confirmé que le recrutement tardif de Dsg2 aux contacts intercellulaires n’était pas le résultat de l’incapacité de la protéine Ecad L175D à former efficacement des AJs mais plutôt dû à l’absence d’interaction directe entre Ecad et Dsg2. Comme il n’y a jamais eu de co-localisation de DP et d’Ecad en l’absence de fermeture éclair (Figure 5-figure supplément 1), les données suggèrent également que les interactions trans d’Ecad précèdent les interactions Ecad/Dsg2. Cette conclusion est renforcée par le fait qu’aucun recrutement de DP n’a été observé lors de l’abolition de l’adhésion trans d’Ecad, et donc des zippers, en transfectant l’Ecad-DM complet (double mutant W2A-K14E, Figure 5-figure supplément 1) dans les kératinocytes EKO/PKD. Dans l’ensemble, ces résultats confirment que l’acide aminé L175 sert de médiateur aux interactions avec Dsg2 et facilite la formation précoce du complexe desmosome dans les cellules.
Reviewer #2:
1) La découverte que le résidu L175 de l’E-cadhérine est critique pour l’interaction avec Dsg2 est intrigante. Cependant, aucun résidu de partenaire d’interaction n’est identifié. Dans cette circonstance, la prédiction d’une conformation pour l’interaction E-cadhérine/Dsg2 par docking semble précaire ; il semble incertain que la conformation prédite se rapporte à la véritable conformation liée.
Nous sommes d’accord avec l’examinateur que les données de docking des protéines sont spéculatives et nous avons donc éliminé ces résultats du manuscrit.
2) Il n’y a qu’un lien ténu l’interaction Dsg2/E-cadhérine proposée à la biologie de l’assemblage du desmosome. Pourtant, les auteurs semblent avoir une voie claire à suivre. Ils soutiennent que la présence de l’E-cadhérine dans les desmosomes naissants (évaluée expérimentalement par coloration de la desmoplakine dans la figure 5) est une preuve du rôle de l’association Dsg2/E-cadhérine qu’ils ont identifiée. Maintenant qu’ils ont identifié un mutant qui empêche cette association, les expériences de la figure 5 réalisées avec ce mutant devraient donner des résultats différents. Cette expérience ajouterait substantiellement à la rigueur de cet article.
Comme décrit dans la réponse 4 au reviewer 1, nous avons exprimé l’Ecad WT pleine longueur, et les mutants de l’Ecad dans les kératinocytes EKO/PKD et analysé le recrutement de Dsg2 et DP aux sites de contacts intercellulaires. Ces résultats confirment que l’acide aminé L175 sert de médiateur aux interactions avec Dsg2 et facilite la formation précoce du complexe desmosome dans les cellules. Ces données sont décrites dans la sous-section « L’acide aminé L175 est essentiel pour le recrutement intercellulaire efficace de Dsg2 et l’assemblage des desmosomes » du manuscrit. Les images correspondantes sont présentées dans la figure 5 et dans le supplément 1 de la figure 5-figure. Les méthodes utilisées sont décrites dans la sous-section « Isolation, culture, transfection et imagerie confocale de kératinocytes primaires ».
Reviewer #3:
1) Ce manuscrit identifie et caractérise une interaction moléculaire entre l’E-cadhérine et la Desmoglein 2 en utilisant des protéines isolées et montre une colocalisation accrue entre ces deux molécules dans les kératinocytes au début de l’assemblage des desmosomes. Il s’agit d’observations potentiellement très intéressantes qui pourraient expliquer comment les cadhérines classiques contrôlent l’assemblage des desmosomes. Bien que ce phénomène soit bien documenté par plusieurs groupes dans la littérature, les mécanismes sous-jacents sont encore largement inconnus. Cependant, leur conclusion « Nos expériences intégrées sur une seule molécule, les prédictions d’arrimage protéine-protéine et l’imagerie cellulaire à super résolution montrent que les interactions Ecad/Dsg2 jouent un rôle important dans l’assemblage précoce des desmosomes », énoncée au début de la section Discussion, est une surestimation assez forte étant donné que l’interaction est basée sur la caractérisation de domaines extracellulaires isolés et la microscopie statique, bien qu’à haute résolution. Aucune expérience n’est faite pour montrer que lorsqu’on perturbe cette interaction l’assemblage du desmosome est effectivement altéré, ce qui à mon avis serait le minimum pour rendre cet ensemble de données vraiment intéressant et pertinent pour un large public.
Comme décrit dans la réponse 4 au réviseur 1, nous avons maintenant exprimé l’Ecad WT complet, et les mutants d’Ecad dans les kératinocytes EKO/PKD et montré que l’acide aminé L175 médiatise les interactions Dsg2 et facilite la formation précoce du desmosome dans les cellules, comme évalué par le recrutement des DP. Ces données sont décrites dans la sous-section « L’acide aminé L175 est essentiel pour le recrutement intercellulaire efficace de Dsg2 et l’assemblage des desmosomes » du manuscrit. Les images correspondantes sont présentées dans la figure 5 et dans le supplément 1 de la figure 5-figure. Les méthodes utilisées sont décrites dans la sous-section « Isolation, culture, transfection et imagerie confocale des kératinocytes primaires ».
2) Aussi, à la lumière du fait que l’interaction est indépendante du calcium alors que l’assemblage précoce des desmosomes dépendant de la cadhérine classique nécessite la présence de calcium (qui n’est pas du tout discuté).
Nous remercions le critique pour ce commentaire perspicace. Comme décrit dans la sous-section « Ecad L175 est essentiel pour le recrutement intercellulaire efficace de Dsg2 et l’assemblage du desmosome », l’imagerie confocale de l’Ecad mutant exprimé dans les kératinocytes de souris révèle maintenant que l’assemblage du desmosome est initié aux sites d’homodimérisation trans de l’Ecad dépendant du Ca2+. Sur la base de nos données, nous proposons un modèle dans lequel l’assemblage du desmosome est facilité à la fois par les interactions cis directes de Ecad et de Dsg2 et par la liaison trans de Ecad opposé. Dans notre modèle, l’homodimérisation trans d’Ecad provenant de cellules opposées sert de repère spatial pour coordonner l’assemblage du desmosome. Ecad forme ensuite des complexes dimères cis avec Dsg2. Une fois localisé dans le desmosome natif, Dsg2 se dissocie de Ecad et se lie à Dsc2 pour former des desmosomes matures. Comme le complexe Dsc2/Dsg2 a une durée de vie plus longue que le complexe Ecad/Dsg2 et le complexe Dsc2/Dsc2, cela permet probablement une adhésion cellulaire robuste et permet au desmosome mature de résister à la force mécanique. Ce modèle est décrit dans la figure 6, et dans la section Discussion.
3) Comme il s’agit d’une interaction entièrement nouvelle et de faible affinité, il est probablement difficile de faire des essais d’interaction dans le contexte de cellules dans lesquelles une cellule exprime l’E-cadhérine et l’autre Dsg2 pour examiner s’il y a une interaction. Cependant, comme leurs données sont partiellement basées sur la modélisation, les auteurs devraient également générer un mutant dans lequel les A125 et A124 sont mutés pour fournir une bien meilleure preuve de l’existence de la proposition de y-dimères.
Puisque les résultats de docking de protéines ne sont pas robustes, nous avons maintenant éliminé ces données du manuscrit. Cependant, nos expériences avec des kératinocytes EKO/PKD montrant que la mutation de l’acide aminé L175 sur l’Ecad entrave le recrutement de Dgs2 et surtout de DP aux sites de formation de contact précoce, démontre que l’Ecad-L175 facilite la formation de desmosomes dans les cellules, confirme nos résultats biophysiques.
Résumé:
Les examinateurs estiment que, bien que les données biophysiques soient convaincantes, une analyse quantitative plus rigoureuse est nécessaire pour soutenir les conclusions tirées des données des figures 3 et 5. En principe, ces préoccupations peuvent être abordées avec des analyses de données supplémentaires plutôt que des expériences, et dans ce cas, nous envisagerions un manuscrit révisé.
Nous remercions l’éditeur pour cette revue encourageante. Comme décrit ci-dessous, notre manuscrit révisé aborde tous les problèmes soulignés.
1) La conclusion que l’interaction E-cadhérine-Dsg est nécessaire pour la formation initiale du desmosome est basée sur la colocalisation de la Dsg et de la E-cadhérine qui diminue à mesure que la jonction mûrit. Cependant, dans la figure 3, il n’est pas clair si la colocalisation observée avec DP est significative au-delà de ce qui est attendu par hasard ou si elle résulte de changements temporels dans la localisation subcellulaire de l’E-cadhérine sans rapport avec la maturation de la jonction. Dans la figure 3C, les expériences de contrôle présentées dans le panneau de droite mettent en évidence la colocalisation de Dsg2 et DP – des composants connus du Desmosome – et montrent une correspondance étroite des signaux de fluorescence aux trois points de temps. En revanche, alors que l’expression de l’E-cadhérine et du DP dans les panneaux de gauche semble se chevaucher dans une certaine mesure, ils ne montrent pas la correspondance des signaux observés pour les expériences de contrôle. La réponse aux points de révision originaux sur ce sujet (par exemple, le réviseur 1, point 3) se concentre sur la définition d’un desmosome, mais n’aborde pas le point ci-dessus.
Nous aimerions préciser que nous ne mesurons pas la co-localisation, mais plutôt le recrutement soit d’Ecad, soit de Dsg2 dans les régions de la membrane qui présentent un motif de » chemin de fer » DP. Pour rendre cela plus clair, nous avons maintenant modifié le manuscrit révisé pour souligner que Ecad est » enrichi dans les desmosomes naissants » plutôt que d’être » exclu des desmosomes matures « .
Pour répondre directement aux préoccupations des examinateurs concernant notre mesure de l’enrichissement d’Ecad dans les desmosomes, nous montrons maintenant que les niveaux relatifs d’Ecad le long de toute la frontière cellulaire (ratio Ecad:DP aux frontières cellulaires) restent inchangés au fil du temps. Ces données confirment que l’enrichissement en Ecad au sein des voies ferrées DP aux premiers moments est spécifique aux régions desmosomales de la membrane et est significatif au-delà de ce qui est attendu par hasard ou en raison de changements dans la localisation de l’E-cadhérine non liés à la maturation de la jonction. Les données sont présentées dans le supplément 1 de la figure 3-figure et sont décrites dans la sous-section « Ecad est présent dans les desmosomes naissants mais pas dans les desmosomes matures ».
Enfin, étant donné que les balayages linéaires présentés dans la figure 3 prêtaient à confusion, nous avons éliminé les balayages linéaires du manuscrit révisé. Au lieu de cela, dans la figure 3B, nous montrons maintenant plusieurs images représentatives des régions desmosomales dans les kératinocytes humains cultivés dans des milieux à haute teneur en Ca2+ pendant 1, 3 ou 18 heures. Ces résultats soulignent le message principal de la figure 3C : Les niveaux d’Ecad sont enrichis dans les desmosomes naissants, les niveaux relatifs diminuant à mesure que les desmosomes mûrissent.
2) Des préoccupations similaires ont été soulevées concernant la figure 5, qui est censée montrer que Ecad L175 est essentiel pour le recrutement intercellulaire efficace de Dsg2 et l’assemblage desmosome. Les images du panneau A montrent en effet une différence spectaculaire dans la localisation de Dsg2 et DP par rapport à la cadhérine WT ou mutante. Alors que Dsg2 et DP sont co-localisés avec l’Ecad WT ou K14E au niveau des jonctions, ils restent dans des ponctuations séparées entourant la jonction de l’Ecad L175D et ne sont pas co-localisés avec elle. Cependant, il n’est pas clair ce que les auteurs ont quantifié pour tester la signification de ce phénotype. En B, qu’est-ce que le » % de jonction formant des contacts » ? Comment un contact est-il défini ? Quelles jonctions mesurent-ils ? AJ ou desmosomes ? En C et E, qu’entendent-ils par « % de jonctions positives Dsg2 ou DP » ? Comment les jonctions ont-elles été définies ?
Nous avons maintenant ajouté un panneau de figure (figure 5-figure supplément 1A) pour illustrer les critères de quantification et les catégories de jonction qui ont été utilisés dans notre analyse. Ce panneau montre des exemples de cellules transfectées avec le mutant Ecad qui ne présentent pas (panneau de gauche) ou présentent (panneau de droite) la formation d’AJ intercellulaires. Pour le recrutement de Dsg2 ou DP, nous n’avons quantifié que les interfaces intercellulaires dans lesquelles des fermetures éclair d’AJ ont été observées. Dans les encarts du panneau de la figure, nous montrons des exemples de contacts positifs d’AJ qui sont soit positifs pour DP, soit négatifs pour DP.
Dans la sous-section « Ecad L175 est essentiel pour le recrutement intercellulaire efficace de Dsg2 et l’assemblage des desmosomes » du manuscrit, nous indiquons maintenant que la capacité des kératinocytes transfectés à former des AJ a d’abord été évaluée par la formation de motifs « zippés » d’Ecad aux contacts intercellulaires. Nous avons précédemment montré que ces fermetures éclair représentent des AJs précoces et recrutent des protéines marqueurs d’AJs comme la vinculine (Rübsam et al., 2017). Nous avons uniquement examiné les interfaces intercellulaires avec les zippers AJ, pour leur capacité à recruter Dsg2 et DP à ces contacts. Il est important de noter que nous n’avons jamais observé d’enrichissement des composants desmosomaux aux contacts intercellulaires en l’absence de fermetures éclair d’AJ (Michels et al., 2009).
Comme décrit dans la réponse 3a ci-dessous, nous discutons maintenant dans la section Discussion que bien que Dsg2 et DP montrent une certaine colocalisation aux fermetures éclair positives à Ecad dans les 3 heures, il y a aussi une coloration jonctionnelle non chevauchante suggérant que les AJ et les desmosomes commencent déjà à se séparer en jonctions intercellulaires distinctes. Nous n’avons pas quantifié cette co-localisation dans notre manuscrit, puisque le point principal de nos expériences était de montrer la pertinence de L175 pour recruter Dsg2 aux interfaces intercellulaires et faciliter la formation des desmosomes (comme illustré par le recrutement de DP aux contacts intercellulaires). Nous pensons que le retard dans le recrutement entre WT, le mutant L175 et le mutant K14, qui est quantifié dans la figure 5, illustre ce point.
3) Il y a également des modifications à apporter à la section Introduction et Discussion pour répondre aux points ci-dessus ainsi qu’à l’accessibilité du document :
a) En rapport avec les points ci-dessus, le lien entre les expériences de liaison in vitro et le rôle biologique proposé semble ténu sur la base des études de localisation qui révèlent des schémas de coloration superposés mais pas vraiment co-localisés. Les auteurs doivent expliquer ce résultat ; peut-être que la co-localisation est dynamique, et/ou que seul un sous-ensemble de molécules d’E-cadhérine est lié à Dsg2. Ce point doit au moins être discuté pour rationaliser les résultats des expériences de localisation avec le modèle proposé.
En raison de la nature transitoire des interactions Ecad/Dsg2, on s’attend à ce que les protéines desmosomales recrutées aux jonctions se séparent rapidement d’Ecad. Par conséquent, on s’attend à ce que les images des interfaces intercellulaires présentent des motifs de coloration des protéines Ecad et desmosomales à la fois superposés et séparés. En accord, bien que Dsg2 et DP montrent une certaine co-localisation aux fermetures éclair positives pour Ecad (Figure 5), une coloration significative des jonctions sans chevauchement est observée, même dans les 3 premières heures. Cela suggère que les AJ et les desmosomes se séparent rapidement en jonctions intercellulaires distinctes. Nous l’indiquons maintenant dans la section Discussion.
b) Au début de la section Discussion, les auteurs affirment qu’ils : « identifient deux événements critiques qui initient et favorisent l’assemblage efficace du desmosome : (i) l’homodimérisation trans stable de Ecad, et (ii) la liaison hétérophile directe des ectodomaines de Ecad et de Dsg2. Nos données démontrent que l’assemblage du desmosome est initié aux sites d’homodimérisation trans de Ecad. Par la suite, Ecad et Dsg2 se lient via un Leu 175 conservé sur l’interface de liaison cis de Ecad et forment des complexes hétérophiles de courte durée qui se localisent aux premiers desmosomes et recrutent efficacement les protéines desmosomales aux sites de formation de contacts intercellulaires. Au fur et à mesure de la maturation des desmosomes, Dsg2 se dissocie de Ecad et forme des liaisons stables avec Dsc2 pour médier une adhésion robuste. » – Ce paragraphe mélange les observations, l’interprétation et les modèles hypothétiques et, en tant que tel, est trompeur. Ils devraient séparer le résumé des résultats de l’interprétation et de leur modèle.
Comme suggéré par les examinateurs, nous avons éliminé les interprétations du premier paragraphe de la section Discussion et ne résumons plus que les résultats.
c) Les auteurs écrivent dans le résumé et l’introduction « Ecad interagit avec Dsg2 via un Leu 175 conservé sur l’interface de liaison cis de Ecad. » – Les auteurs ne devraient pas supposer que les lecteurs sont familiers avec les interactions homophiles E-cad et devraient l’expliquer explicitement.
Dans le résumé, nous indiquons maintenant que « Des études antérieures démontrent que l’E-cadhérine (Ecad), une protéine adhésive qui interagit dans les deux conformations trans et cis, facilite l’assemblage du desmosome via un mécanisme inconnu ».
De plus, dans l’introduction, nous indiquons maintenant : ‘Puisque Ecad interagit latéralement pour former des dimères cis sur la même surface cellulaire (Harrison et al., 2011) tandis que les molécules Ecad des cellules opposées interagissent dans une conformation de dimère trans strand-swap (Boggon et al., 2002 ; Parisini et al, 2007 ; Vendome et al., 2011) et une conformation X-dimère trans (Ciatto et al., 2010 ; Harrison et al., 2010), nous avons utilisé des mutants qui abolissent spécifiquement les interactions trans ou cis de Ecad et avons testé leur liaison à Dsg2 ou Dsc2’. Enfin, dans l’introduction, nous indiquons maintenant que ‘Des études structurales précédentes ont montré que L175 médiait la dimérisation cis homophile de Ecad (Harrison et al., 2011)’.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013.