E-カドヘリンはデスモグレインに結合してデスモソームの集合を促進する
1) この論文はカドヘリンを介したデスモソーム集合の制御機構について述べたものである． 査読者は、この研究が潜在的にエキサイティングであることに同意しているが、いくつかの重要な問題を提起している。 まず、カドヘリン変異体を発現する細胞での共局在化を調べることによって、このモデルを検証しなければならないことに全員が同意した。
これらの重要な実験を提案してくださった査読者の方々に感謝する。 査読者への詳細な回答に記載したように、我々は現在、ケラチノサイトにおける Dsg2 のリクルートメントを妨げる上での異なる Ecad 変異の役割をテストしている。 我々は、Ecadノックアウト、Pcadノックダウンマウスケラチノサイト（EKO/PKD）において、完全長Ecad WT、およびEcad変異体（L175D、K14E、W2A-K14E）を発現し、細胞間接触部位へのDsg2動員を分析した。 これらの結果から、Ecad上のアミノ酸L175がDsg2との相互作用を仲介し、細胞内の初期デスモソーム複合体形成を促進することが確認された。 また、我々の実験は、デスモソームの形成がEcad trans homodimerizationの部位で開始されることを明らかにした。
2) 図5の共局在データの信頼性に対する懸念もある。E-cadherinとdesmoplakinの共局在が偶然に予想されるよりはるかに多く起こることを証明するにはより厳格な解析が必要である。
現場では、DP染色のサイズとレールロードトラック外観によりSIM画像上でデスモソームを識別することが行われた。 査読者への回答で概説したように、我々はデスモソームの位置を特定するためにこの確立されたアプローチを使用した。 さらに、我々は共局在化を測定しているのではなく、このパターンを示す膜の領域への異なるカドヘリン（EcadとDsg）の動員を測定していることを強調した
3) 次に、モデル化はL175が界面の一部を形成すると仮定しているが、化学量論の評価なしでは、結合力の喪失がcis二量化の喪失による間接効果であるとは否定し得ない。 また、Dsg2上の相補的な界面がテストされていないため、このモデリングは弱いと考えられる。 3380>
査読者への詳細な回答で述べたように、以前の計算機シミュレーションと生物物理学的実験では、Ecad の cis 二量体形成には事前に trans 二量体形成が必要であることが示されています。 その結果、Ecad は単独で、事前に形成された cis 二量体として表面に結合することはできません。 このことから、測定された結合相互作用がEcadのシス2量体とDsg2の間で起こる可能性は極めて低いと考えられる。 それにもかかわらず、私たちは分子ドッキングの結果が非常に弱いという査読者の意見に同意します。 3380>
4) 最後に、査読者3が指摘したように、これらの追加によって支持されたとしても、モデルおよび考察のセクションは、E-カドヘリンがデスモソームを制御する方法を実際に説明するものではない。
私たちの新しい細胞構造-機能データに基づき、現在私たちは、EcadとDsg2の直接的なシス相互作用と対立するEcadのトランス結合の両方によってデスモソームの組み立てが促進されるモデルを提案しています。 このモデルでは、対向する細胞からのEcadのトランス型ホモ二量化が、デスモソームの形成を調整する空間的な手がかりとなる。 Ecadはその後Dsg2とcis二量体複合体を形成し、デスモソームの形成を開始する。
Reviewer #1:
1) 1分子AFM実験は、この論文の中で最も堅実な部分である。 しかし、私の読みでは、著者らは、観察された結合事象が、あらかじめ形成されたE-カドヘリンcis-ダイマー間の相互作用による可能性を排除していない。 なぜなら、もしDsg2への結合にE-カドヘリンのシスダイマーが必要であれば、L175D変異がDsg2/E-cad相互作用を阻害するという結果の解釈は変わってくるからである。 このようなシナリオは、ドッキングシミュレーションの妥当性にも疑問を投げかけることになります。 私の読みでは、AFM探針が表面に接触するごとに結合する確率が低いことは、結合が必ずしも2つのモノマーの相互作用を反映しているという証拠としては弱いですし、表面上のカドヘリン分子の平均密度が低いというわけでもありません。 さらに、カドヘリンは複数のビオチン結合部位を持つストレプトアビジンで固定化されている
これらの理由から、モノマー間でヘテロ二量化が起こることを証明することが重要であると考える。 そのためには、カバースリップ表面のE-カドヘリンの面密度の関数として、表面とチップの相互作用確率を系統的に測定することをお勧めする。 もし相互作用に単量体のE-カドヘリンが本当に必要なら、この測定値は少なくとも低密度では、添加したE-カドヘリンに対して直線的に変化するはずである。 しかし、この特定の測定は必要ではなく、化学量論を確立する任意の測定が行われる。
以前のコンピューター シミュレーション（Wu et al.、2010；Wu et al.、2011）は、Ecad cis ホモ二量化が、事前の Ecad trans 二量化形成を必要とすることを示している。 同様に、以前の1分子FRET測定では、Ecadモノマーがシス配向で近接して配置されている場合でも、単独でEcadシス二量体を形成することは不可能であることが示されています（Zhang et al.） これらの結果を総合すると、我々の実験ではEcadはあらかじめ形成されたシス二量体としてAFMチップや基板に固定化することができないことが示唆される。 したがって、Ecad-L175D 変異体が Dsg2 と相互作用しないのは、Ecad の cis 二量体形成がないためではないことがわかった。 このことについては、原稿のサブセクション「Leu 175 mediates Ecad and Dsg2 interactions」で説明します。
残念ながら、技術的な制約から、査読者が提案するようなタンパク質化学量論的な実験を行うことができない。 私たちの実験では、PEGテザーの対応する伸張から単一の結合イベントを明確に識別できるように、タンパク質表面密度を使用しています。 査読者が提案したようにカドヘリン表面密度が増加した場合、同時に複数のEcad結合事象が起こる確率が増加し、タンパク質結合確率の定量分析が信頼できなくなる。 この理由（および私たちのドッキング解析の本質的な弱点）により、私たちは原稿からタンパク質ドッキングシミュレーションを除外しました。
最後に、改訂原稿では、動的力顕微鏡（DFS）用に1分子の結合解除事象をグループ化するために、クラスター分析を使用するようになりました。 我々は最近、我々が採用したK-meansクラスタリングアルゴリズムが、DFSにおける動力学パラメータの推定を大幅に改善することを示しました（Yen and Sivasankar, 2018）。 その結果、Ecad/Dsg2、Dsc2/Dsg2、Dsc2/Dsc2相互作用について現在報告している寿命は、より信頼できるものとなっています。
2) ドッキングシミュレーションは興味深いですが、私の考えでは、著者が提案する特定の結合形状に対する弱い証拠となるものです。 このような結果の解釈や提示には、より慎重になることを強く勧めます。あるいは、計算結果を支持または反証する追加データ、例えばEM画像などを提示することをお勧めします。
我々は、タンパク質ドッキングデータが弱いというレビューワーに同意します。
3) 残念ながら、SIM画像は現状では説得力がない。 特に、著者らの解析では、何をもって「デスモソーム」とカウントしているのかが不明である（図5B）。 E-カドヘリンとデスモプラキンが共局在化し、この共局在化が接合部の成熟に伴って減少するという点を立証するためには、共局在化をより高度に扱う必要があるだろう。
以前の研究（Stahley et al., 2016a, 2016b）において、超解像イメージングによって明らかになったDPの「レールロードトラック」外観を用いて、免疫蛍光法によるデスモソームの定義（図3Aに描かれたように）を行っている。 この分野の他の研究者も、SIM画像でデスモソームを同定するために「鉄道」軌道の形態を利用している（例えば、以下を参照。 Chenら、（2012）；Ungewißら、（2017））。 SIMによって明らかにされたこれらの構造のサイズと組織は、デスモソームの古典的なEMの定義と完全に一致する。 標準的な画像解析を用いて、これらの構造体内の2つのカドヘリン（EcadまたはDsg2）の画素強度を測定した。 重要なことは、我々は共局在化を主張しようとはしていないことである。 むしろ、DPレールロード染色パターンを示す膜ドメインへのカドヘリンのリクルートメントを測定しているのである。 我々は、初期の時点ではレールロードトラックを識別することが困難な場合があることを理解している。 このような理由から、私たちはレールロードの染色を確認できると感じた最も早い時間は1時間であった。 さらに、DPパンクタではなく、レールロードパターンが観察できる場所でのみ測定を行っている。 最後に、Ecadが新生デスモソームに存在するという我々の発見は、Ecadがデスモソームに局在できることを示す古典的な免疫電子顕微鏡実験と一致する（Jones、1988）。 したがって、我々はデスモソームを同定し、異なる時期に2つのカドヘリンの相対的レベルを測定する能力に自信を持っている
4) この最後の点は編集者の裁量に任せる。 私の考えでは、共焦点化データは、たとえ真実と見なされたとしても、機能的な関連性を立証するものではない。 L175D E-cadherinのノックダウン／再置換実験が見られると非常に良い。 この分子は接合年齢に関係なく、決してデスモプラキンと共局在化しないという予測である。 3380>
査読者の提案に基づき、我々は現在、ケラチノサイトにおける DP および Dsg2 の動員を妨げる上での異なる Ecad 細胞外ドメイン変異の役割を直接検証する実験を実施している。 このデータはサブセクション「Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly」に記載されている。 対応する画像を図5および図5-図1中に示す。 使用した方法は、サブセクション「初代ケラチノサイトの単離、培養、トランスフェクションおよび共焦点イメージング」に記載されている。 これらの実験では、古典的なカドヘリンを実質的に発現していないEKO/PKDマウスケラチノサイトを使用した。 我々は以前に、これらのEKO/PKDケラチノサイトは、すべての古典的カドヘリンの消失により、AJとデスモソームの集合が不可能であることを示した（Michels et al.） したがって、これらの細胞によって、Ecad変異体がi）AJ形成を開始する能力、およびii）最初の細胞間接触形成部位にデスモソーム構成要素を動員する能力を直接評価することができるようになった。
接合形成の初期に Ecad 変異体がデスモソームタンパク質を動員する能力を評価することに関心があったので、EKO/PKD ケラチノサイトで完全長 Ecad WT または変異体を発現させ、共焦点顕微鏡を用いて細胞間接触部位への DP および Dsg2 の動員を分析した。 接合形成と成熟の異なる段階での動員を調べるため、ケラチノサイトを固定し、Ca2+ スイッチ後の 3 つの時点 (3 時間、6 時間、18 時間) で DP、Dsg および Ecad を免疫染色した。
データでは、Ca2+ スイッチ後 3 時間、WT-Ecad の 93% は細胞間接触部の zipper-like early AJs で豊富になったことが明らかにされた。 対照的に、L175D-Ecadをトランスフェクトしたケラチノサイトの48%のみがAJジッパーを形成したが、これはおそらくEcadシスダイマー形成の障害に起因する (図5 A, B)。 Ca2+スイッチ後のこれらの早い時点で、WT-Ecadジッパーコンタクトの66%と91%がそれぞれDsg2とDPに対して陽性であった（図5 A、C、D、E）。 18時間Ca2+依存性の細胞間接着をさせると、Ecad-Dsg2とEcad-DPの接合部局在はそれぞれ97％と100％に増加した（図5 A、C、D、E）。 一方、L175によって誘導されたジッパーコンタクトのうち、高Ca2+に切り替えてから3時間後にDsg2のリクルートが見られたのは39%のみで、18時間後には65%に増加した（図5 A, C）。このことから、初期の細胞間コンタクトにDsg2を効率的にリクルートするには、EcadとDsg2の直接的相互作用が必要であると確認された。 同様に、3時間後、L175D-Ecad変異体が樹立した細胞間コンタクトの28%のみがDPに対して陽性であったが、18時間後には72%に増加し、後期における代償機構が示唆された（図5 D, E）。
L175D 変異の観察された効果が AJ 形成の妨げによるものではないことを確認するために、EKO/PKD ケラチノサイトに、X 二量体形成を消失させ Ecad を鎖交換二量体構造に捕らえる完全長 Ecad-K14E 変異体をトランスフェクションした。 我々のデータは、高Ca2+に切り替えてから初期（3時間）の時点では、トランスフェクトした接触細胞のわずか4%がジッパーを形成し、後期（18時間）の時点では24%だけがジッパーを示した（図5 A, B, 図5-図1）。このことから、K14が有効なAJ形成、ひいては細胞間の接触形成に必須であることが確認された。 しかし、形成された少数のK14E AJは、L175Dよりも効率的にDsg2、特にDPを勧誘した（図5 A, C, E, 図5-補遺1）。 この結果から、Dsg2の細胞間結合への動員遅延は、Ecad L175Dが効率的にAJを形成できない結果ではなく、むしろEcadとDsg2が直接相互作用しないことに起因していることが確認された。 ジッパーがない状態ではDPとEcadの共局在化が見られなかったことから（図5-図1）、このデータはEcad trans相互作用がEcad/DSg2相互作用に先行していることも示唆している。 この結論は、EKO/PKDケラチノサイトに完全長Ecad-DM（W2A-K14E二重変異体、図5-図1）をトランスフェクトすることによってEcadトランス接着、ひいてはジッパーを消失させるとDPの動員は観察されないという我々の発見によってさらに強化された。 これらの結果を総合すると、アミノ酸L175がDsg2との相互作用を仲介し、細胞内の初期のデスモソーム複合体形成を促進することが確認された。
Reviewer #2:
1) E-cadherin residue L175 is critical for interaction with Dsg2 という発見は興味深かった。 しかし、相互作用するパートナー残基は同定されていない。 このような状況下で、ドッキングによりE-cadherin/Dsg2相互作用のコンフォメーションを予測することは不安定であると思われる。
我々は、タンパク質ドッキングデータは推測に過ぎないという査読者の意見に同意し、原稿からこれらの結果を削除した。
2) 提案されたDsg2/E-cadherin相互作用とデスモソーム構築の生物学との関連性は希薄でしかなかった。 しかし、著者らは明確な道筋を持っているようである。 彼らは、新生デスモソームにおけるE-カドヘリンの存在（図5のデスモプラキンの共染色により実験的に評価）が、彼らが同定したDsg2/E-カドヘリン会合の役割を示す証拠であると主張している。 今、彼らはその会合を妨げる変異体を同定したので、その変異体を用いて行われた図5の実験は、異なる結果をもたらすはずである。 この実験は、この論文の厳密性を実質的に高めるだろう。
査読者 1 への回答 4 に記載したように、我々は EKO/PKD ケラチノサイトで完全長 Ecad WT および Ecad 変異体を発現し、細胞間接触部位への Dsg2 および DP の動員を分析した。 これらの結果から、アミノ酸L175がDsg2との相互作用を仲介し、細胞内の初期デスモソーム複合体形成を促進することが確認された。 このデータについては、原稿のサブセクション「Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly」に記述している。 対応する画像を図5および図5-図1 に示す。 使用した方法は、サブセクション「Isolation, culture, transfection and confocal imaging of primary keratinocytes」に記載されている。
Reviewer #3:
1）この原稿では、単離タンパクを用いてEカドヘリンとDasmoglein 2間の分子相互作用を特定・特徴付けし、ケラチノサイトにおけるデスモソーム形成初期のこれら2分子間の共局在化が増加していることが示された。 これらは、古典的なカドヘリンがどのようにデスモソームの集合を制御しているかを説明する、非常に興味深い観察結果である可能性がある。 このことは、いくつかのグループによって文献上ではよく知られているが、その根底にあるメカニズムはまだほとんどわかっていない。 しかしながら、考察のセクションの最初にある彼らの結論「私たちの統合された1分子実験、タンパク質-タンパク質ドッキング予測および細胞ベースの超解像度イメージングにより、Ecad/DSG2相互作用は初期のデスモソーム集合において重要な役割を果たすことが示された」は、相互作用が単離細胞外ドメインの特性評価および高解像度顕微鏡とはいえ静止画に基づいていることから、かなり強く誇張された言い方だと言えるでしょう。 この相互作用を妨げると、デスモソームの形成が実際に損なわれることを示す実験は行われていません。私の考えでは、この一連のデータを本当に面白く、幅広い読者に関連したものにするための最低限の要素になると思います。
査読者 1 への回答 4 に記載したように、私たちは現在、完全長の Ecad WT および Ecad 変異体を EKO/PKD ケラチノサイトで発現させて、アミノ酸 L175 が Dsg2 相互作用を仲介し、DP 募集によって評価したように細胞内の初期のデスモソーム形成が促進されることを明らかにしました。 このデータは、原稿のサブセクション「Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly」に記載されている。 対応する画像を図5および図5-図1 に示す。 また、古典的なカドヘリン依存性の初期デスモソームアセンブリがカルシウムの存在を必要とするのに対し、相互作用はカルシウムに依存しないという事実を踏まえ（これは全く議論されていない）、
この洞察に満ちたコメントを下さった査読者の方に感謝します。 Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly」に記載したように、マウスケラチノサイトに発現した変異 Ecad の共焦点イメージングにより、デスモソームの組み立てが Ca2+ 依存的 Ecad trans homodimerization の部位で開始されることが明らかになりました。 このデータに基づいて、私たちは、EcadとDsg2の直接的なシス相互作用と、反対側のEcadのトランス結合の両方によってデスモソームの形成が促進されるというモデルを提案します。 このモデルでは、対向する細胞からのEcadのトランス型ホモ二量化が、デスモソームの形成を調整する空間的な手がかりとなる。 Ecadはその後、Dsg2とシス二量体複合体を形成する。 デスモソーム内に局在すると、Dsg2はEcadから解離し、Dsc2と結合して成熟したデスモソームが形成される。 Dsc2/Dsg2複合体はEcad/Dsg2複合体やDsc2/Dsc2複合体よりも寿命が長いため、強固な細胞間接着が可能になり、成熟デスモソームが機械的な力に耐えられるようになるのだと思われる。 このモデルについては、図6、考察の項で述べた。
3) これは低親和性の全く新しい相互作用であるので、一方の細胞がE-カドヘリン、他方の細胞がDsg2を発現している状況で、相互作用があるかどうかを検討するための相互作用アッセイはおそらく困難であろう。 しかし、彼らのデータは部分的にモデリングに基づいているので、著者らは、y-ダイマーの提案の存在についてより良い証拠を提供するために、A125とA124を変異させた変異体を生成することも必要である。 しかしながら、EKO/PKD ケラチノサイトを用いた実験により、Ecad のアミノ酸 L175 の変異が Dgs2 および特に初期接触形成部位への DP の動員を阻害し、Ecad-L175 が細胞内でデスモソーム形成を促進することが明らかになり、我々の生物物理学の結果を確認することができました。 このような懸念は、原則的に実験ではなく、追加のデータ解析で対応可能であり、この場合、修正原稿を検討する。
この心強いレビューに編集者に感謝する。 以下に述べるように、我々の修正原稿はハイライトされた問題点をすべて解決している。
1) E-カドヘリン-Dsg相互作用が初期のデスモソーム形成に必要であるという結論は、DsgとE-カドヘリンの共局在が接合部の成熟とともに減少することに基づくものであった。 しかし、図3では、観察されたDPとの共局在化が偶然に予想される以上に有意なのか、それとも接合部の成熟とは無関係なE-カドヘリン亜細胞局在の時間依存的変化から生じているのかは明らかでない。 図3Cでは、右側のパネルに示したコントロール実験により、デスモソームの構成要素として知られているDsg2とDPの共局在が強調されており、3つの時点すべてで蛍光シグナルが密接に対応していることが示されている。 一方、左図では、E-カドヘリンとDPの発現はある程度重なっているように見えるが、対照実験で観察されたシグナルの対応関係を示していない。 この件に関する最初のレビューポイントに対する回答（レビューア1、ポイント3など）は、デスモソームの定義に焦点を当てているが、上記の点には触れていない。
我々は、共局在化ではなく、DP「線路」パターンを示す膜の領域へのEcadまたはDsg2のいずれかの動員を測定していることを明確にしたいと思う。 これをより明確にするため、Ecad が「成熟デスモソームから排除される」のではなく「新生デスモソームに濃縮される」ことを強調するよう、現在修正原稿を修正しました。
デスモソームにおける Ecad 濃縮の測定に関するレビューアの懸念に直接取り組むため、細胞境界全体における Ecad の相対レベル（細胞境界における Ecad:DP 比）は時間の経過と共に変化しないことを現在示しています。 このデータは、初期の時点におけるDPレールトラック内のEcadの濃縮が膜のデスモソーム領域に特異的であり、ランダムな偶然や接合部の成熟とは無関係なE-カドヘリン局在の変化のために予想される以上に有意であることを確認するものである。 このデータは図3-図1 に示され、サブセクション「Ecad is present in nascent desmosomes but not in mature desmosomes」に記載されている。
最後に、図3 に示されたラインスキャンが紛らわしいので、改訂原稿からラインスキャンを削除した。 その代わりに、図3Bに、高Ca2+培地で1、3または18時間培養したヒトケラチノサイトのデスモソーム領域のいくつかの代表的な画像を示すようにした。 これらの結果は、図3Cの主な「要点」を強調している。 Ecadのレベルは初期のデスモソームに濃縮され、デスモソームが成熟するにつれて相対レベルが低下する。
2) Ecad L175が細胞間のDsg2動員およびデスモソームの組み立てに効率的に不可欠なことを示すとされている図5についても同様の懸念が提起されている。 パネルAの画像は、確かにWTまたは変異体カドヘリンと比較して、Dsg2およびDPの局在に劇的な違いがあることを示している。 Dsg2とDPは接合部でWTまたはK14E Ecadと共局在化するが、L175D Ecadの接合部を挟んで別々の点状に留まり、共局在化しない。 しかし、著者らがこの表現型の意義を検証するために何を定量化したかは不明である。 Bにおいて、「接点を形成する接合部の％」とは何か？ 接触はどのように定義されるのだろうか？ どのような結合を測定しているのか？ AJなのかデスモゾームなのか？ CとEで、「Dsg2またはDP陽性の接合部の割合」とはどういう意味か？ 3380>
今回、解析に使用した定量基準や接合部のカテゴリーを説明する図パネル（図5-図1A）を追加した。 このパネルは、細胞間AJ形成を示さない（左パネル）または示す（右パネル）Ecad変異体をトランスフェクトした細胞の例を示している。 Dsg2またはDPのリクルートメントについては、AJジッパーが観察された細胞間インターフェースのみを定量化した。 3380>
原稿のサブセクション「Ecad L175 is essential for efficient intercellular Dsg2 recruitment and desmosome assembly」において、トランスフェクトしたケラチノサイトのAJ形成能力は、まず細胞間接触におけるEcadの「ジッパー様」パターンの形成によって評価したと述べている。 我々は以前、これらのジッパーが初期AJを表し、ビンキュリンのようなAJマーカータンパク質をリクルートすることを示した（Rübsam et al.、2017）。 我々は、AJジッパーを持つ細胞間界面について、Dsg2やDPをこれらの接点にリクルートする能力についてのみ調べた。 重要なことに、我々は、AJジッパーがない場合、細胞間接触におけるデスモソーム成分の濃縮を観察したことがない（Michels et al.、2009）。
以下の回答3aに記載するように、我々は現在、3時間以内にDsg2およびDPがEcad陽性ジッパーで何らかの共局在化を示すものの、AJおよびデスモソームは既に異なる細胞間接合に分離し始めていることを示唆して、重ならない接合染色も存在していることについて考察セクションで述べる。 我々の実験の要点は、L175がDsg2を細胞間界面に動員し、デスモソーム形成を促進すること（DPの細胞間接触への動員によって示される）と関連性を示すことだったので、原稿ではこの共局在化を定量化しなかった。 我々は、図5で定量化したWT、L175変異体、K14変異体の間の動員における遅延が、この点を説明していると考えている。
3) 論文のアクセシビリティと同様に、上記の指摘に対応するために必要な「はじめに」と「考察」のセクションの修正もある：
a) 上記の指摘と関連して、重なり合ったが真の共局在染色パターンではない局在化研究に基づくin vitro結合実験と提案された生物的役割間のリンクは希薄であると思われる。 おそらく共局在化は動的であり、E-カドヘリン分子の一部だけがDsg2と結合しているのだろう。 3380>
Ecad/Dsg2 の相互作用が一過性であることから、接合部に動員されたデスモソームタンパク質は、Ecad から急速に分離すると予想される。 その結果、細胞間界面の画像はEcadとデスモソームタンパク質の染色パターンが重複しているものと分離しているものがあることが予想される。 一致して、Dsg2とDPはEcad陽性ジッパーでいくらかの共局在化を示すが（図5）、最初の3時間以内であっても、有意な非重複接合部染色が観察される。 このことは、AJとデスモソームが急速に別個の細胞間接合に分離することを示唆している。 3380>
b) Discussionセクションの冒頭で、著者は次のように主張している。 「効率的なデスモソーム集合を開始し促進する2つの重要なイベントを特定した。 (i) Ecad の安定なトランス型ホモダイマー化、および (ii) Ecad と Dsg2 のエクトドメインの直接的な親和性結合である。 我々のデータは、デスモソームの形成がEcadのトランス型ホモ二量化部位で開始されることを実証している。 その後、EcadとDsg2はEcadシス結合界面の保存されたLeu175を介して結合し、初期のデスモソームに局在する短命の異種複合体を形成し、細胞間接触形成部位にデスモソーム蛋白質を効率的にリクルートしている。 デスモソームが成熟すると、Dsg2はEcadから解離し、Dsc2と安定な結合を形成し、強固な接着を媒介する。” – このパラグラフは観察、解釈、仮説モデルが混在しており、そのため誤解を招きやすい。 彼らは結果の要約を解釈とそのモデルから分離すべきです。
査読者から提案されたように、我々は考察セクションの最初のパラグラフから解釈を排除し、現在は結果のみを要約しています。
c) 著者らは、要約と序文に “Ecad cis結合界面の保存Leu 175を介してDsg2との相互作用をする” と記しています。 – 著者らは、読者がE-cadのホモフィリック相互作用に精通していると仮定すべきではなく、これを明確に説明すべきである。
さらに、Abstractにおいて、現在、我々は、『以前の研究は、トランスおよびシスコンフォメーションの両方で相互作用する接着タンパク質であるEカドヘリン (Ecad) が未知のメカニズムでデスモソーム集合を促進することを示している』として述べています。 Ecadは横方向に相互作用して同じ細胞表面でシス二量体を形成するため（Harrisonら、2011）、一方、反対側の細胞からのEcad分子はトランス鎖交換二量体構造で相互作用する（Boggonら、2002; Parisiniら、, 2007; Vendome et al., 2011）、トランスXダイマー構造（Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010）である。そこで、Ecadのトランスまたはシス相互作用を特異的に停止させる変異体を用い、Dsg2またはDsc2’との結合を試験してみた。 最後に、序文で、『以前の構造研究は、L175 がホモフィリックな Ecad cis 二量体化を仲介することを示した (Harrison et al., 2011)』と述べるようになりました。